降糖類中成藥和保健食品中13種非法添加成分檢測(cè)方法改進(jìn)

黎 雋 ，裴小龍 ，張 麗，王一欣

（1.陜西省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，陜西 西安 712046； 2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710061）

目前，市場(chǎng)上很多降糖中成藥和保健食品常會(huì)非法添加一些常用降糖類西藥[1]。原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的降糖類中成藥和保健食品高效液相色譜檢測(cè)法（批準(zhǔn)件編號(hào)分別為 2009029，2011008，2013001）中測(cè)定13種非法添加成分需要采用2種方法，不僅耗時(shí)長(zhǎng)（2種方法共耗時(shí)近120 min），且流動(dòng)相離子對(duì)試劑的配制十分復(fù)雜（庚烷磺酸鈉0.505 6 g，加三乙胺1.4 mL，加水至 1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié) pH 至 3.5 ±0.05），成本也很高。本研究中通過(guò)改變流動(dòng)相的成分，在不影響檢驗(yàn)效果的情況下縮短檢驗(yàn)時(shí)間至35 min，提高了檢測(cè)效率，節(jié)約了檢測(cè)成本?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent Infinity 1290型高效液相色譜儀，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器。

試藥：鹽酸二甲雙胍對(duì)照品（批號(hào)為100664-200602），鹽酸苯乙雙胍對(duì)照品（批號(hào)為 100922-201001），格列吡嗪對(duì)照品（批號(hào)為 100281-200602），格列齊特對(duì)照品（批號(hào)為100269-200603），馬來(lái)酸羅格列酮對(duì)照品（批號(hào)為100952-200701），鹽酸吡格列酮對(duì)照品（批號(hào)100634-200401），格列本脲對(duì)照品（批號(hào)為 100135-200404），格列美脲對(duì)照品（批號(hào)為100674-201102），格列喹酮對(duì)照品（批號(hào)為100280-201002），瑞格列奈對(duì)照品（批號(hào)為 100753-201102），格列波脲對(duì)照品（批號(hào)為520026-201401），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；樣品為市場(chǎng)監(jiān)督抽驗(yàn)降壓類中成藥及保健食品；鹽酸丁二胍對(duì)照品（批號(hào)為1-RLJ-70-1，加拿大TRC公司）；甲苯磺丁脲對(duì)照品（批號(hào)為SZBAOBXV，德國(guó)Fluka公司）；乙腈、乙酸銨（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm，210 nm～400 nm；柱溫：35℃；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.02 mol／L 乙酸銨溶液（B），梯度洗脫程序見(jiàn)表 1；流速：0.2mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：235nm；進(jìn)樣量：2μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

高效液相色譜儀：LCMS-8040；色譜柱：Zorbax SB-C18柱（100mm×2.1mm，1.8μm）；流速：0.2mL／min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；離子源：電噴霧離子源；電離模式：ESI＋（正離子模式）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.01 mol／L 乙酸銨溶液（B），梯度洗脫程序見(jiàn)表 2。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序表

表2 質(zhì)譜流動(dòng)相梯度洗脫程序表

2.2 溶液制備

陽(yáng)性對(duì)照品溶液：稱取13種對(duì)照品各10 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度約為1 g／L的單標(biāo)貯備液。臨用時(shí)，吸取不同體積各單標(biāo)貯備液置同一25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為50 μg／mL的混標(biāo)貯備液。詳見(jiàn)表3。取上述13種單標(biāo)貯備液各2.0 mL，置同一25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為106.10，106.20，109.10，67.12，110.50，97.84，100.40，99.12，89.20，103.80，96.96，166.50，99.84 μg ／mL 的加標(biāo)用混標(biāo)貯備液。

表3 陽(yáng)性對(duì)照品溶液

供試品溶液：取市場(chǎng)監(jiān)督抽驗(yàn)的降壓類中成藥及保健食品作為供試品，每份取10粒（取膠囊內(nèi)容物進(jìn)行測(cè)定），混勻，精密稱取相當(dāng)于1次的服用劑量，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放至室溫再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

陰性對(duì)照品溶液：由于降糖類中成藥和保健品制劑配方的多樣性，本試驗(yàn)中采用的陰性樣品為膠囊劑，選取歷次監(jiān)督抽檢中有代表性的，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜驗(yàn)證確認(rèn)未添加化合物的中成藥或保健品。

2.3 方法學(xué)考察

干擾試驗(yàn)：分別取2.2項(xiàng)下混標(biāo)貯備液的10倍稀釋液、陰性對(duì)照品溶液注入色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜中，在對(duì)照品溶液相應(yīng)位置無(wú)干擾峰，說(shuō)明本試驗(yàn)條件下陰性樣品中的其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。）

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察與檢出限測(cè)定：分別精密吸取0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，6.0，8.0 mL 混標(biāo)貯備液置 10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，得系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。在擬訂色譜條件下，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的色譜峰峰高大于3倍信噪比的質(zhì)量濃度乘以進(jìn)樣體積（2 μL）得本方法的檢出限。結(jié)果見(jiàn)表4。

精密度試驗(yàn)：將混標(biāo)貯備液連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果鹽酸二甲雙胍、鹽酸丁二胍、鹽酸苯乙雙胍、甲苯磺丁脲、格列吡嗪、格列齊特、格列波脲、馬來(lái)酸羅格列酮、格列本脲、鹽酸吡格列酮、格列美脲、瑞格列奈、格列喹酮峰面積的RSD分別為 3.76% ，1.71% ，3.18% ，0.92%，0.87%，0.99%，1.22%，1.95%，1.93%，1.16%，0.90%，1.06%和 0.77% （n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液，室溫放置，分別于1，2，4，8 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD均在1.0% ～4.0%范圍內(nèi)，表明加標(biāo)樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：稱取4份同一陰性樣品（編號(hào)1～4），每份 0.5 g，置 25 mL容量瓶中，分別加入不同體積（0.5，1.0，2.0，3.0 mL）的加標(biāo)用混標(biāo)貯備液，加甲醇適量，超聲提取30 min，放至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，過(guò)濾（0.45 μm 濾膜），即為加標(biāo)樣品待測(cè)液。每份待測(cè)液平行測(cè)定2次，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝8）

2.4 供試品測(cè)定

取供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，在不同供試品溶液色譜中，出現(xiàn)與對(duì)照品溶液色譜保留時(shí)間相應(yīng)的色譜峰。采用二極管陣列檢測(cè)器比較相應(yīng)色譜峰的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，取吸收光譜與對(duì)照品溶液相同的供試品溶液，按2.1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢驗(yàn)，離子駐留時(shí)間均為20 ms，13種非法添加成分離子碎片信息見(jiàn)表6，質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，高效液相色譜法檢測(cè)呈陽(yáng)性的供試品，均經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn)含有待測(cè)非法添加成分。

表6 13種非法添加成分的離子碎片信息及相關(guān)電壓參數(shù)

3 討論

原方法中使用甲醇和離子對(duì)試劑作為流動(dòng)相，雖可使各化合物得到很好的分離，但要分兩步進(jìn)行，每一步都要使用不同的流動(dòng)相和洗脫程序，檢驗(yàn)過(guò)程煩瑣?？紤]到非極性固定相，當(dāng)溶劑極性增加時(shí)，待分離組分的保留值增加，分離度增大，利用這個(gè)原理改進(jìn)方法，采用乙腈代替甲醇作為流動(dòng)相A，延長(zhǎng)了非離子型化合物的保留時(shí)間，從而達(dá)到了將其與離子型化合物（胍類）進(jìn)行分離的目的。原方法中使用了離子對(duì)試劑（庚烷磺酸鈉、三乙胺、磷酸水溶液）抑制溶質(zhì)離子化，通過(guò)調(diào)整離子型化合物解離程度來(lái)調(diào)整其極性，最終達(dá)到調(diào)整其保留值、分離度的目的[2-4]，但離子對(duì)試劑成本較高，僅適用于離子型化合物的分離?？紤]到低濃度的乙酸銨（0.005 ～0.01 mol／L）可提高離子化效率，且對(duì) 11 種降糖藥物有很好的分離效果，而高濃度時(shí)（0.02 ～0.03mol／L）則產(chǎn)生離子抑制效應(yīng)，改變?nèi)苜|(zhì)極性、抑制峰形拖尾[5]，因此改進(jìn)方法采用0.02 mol／L乙酸銨代替離子對(duì)試液，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相的比例改善分離效果。

圖2 質(zhì)譜圖

綜上所述，本研究中對(duì)降糖類中成藥的高效液相色譜法流動(dòng)相組分進(jìn)行改進(jìn)，不但能同時(shí)檢測(cè)13種非法添加成分，且檢測(cè)范圍寬，檢出限低，回收率高，線性關(guān)系良好，檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，可用于大批量市場(chǎng)監(jiān)督抽樣檢品非法添加物的快速篩查。