高效液相色譜多波長法同時測定中風合劑中梓醇、哈巴苷、綠原酸和芍藥苷含量

江建麗

（福建省南平市食品藥品檢驗檢測中心，福建 南平 353000）

中風合劑是由太子參、黃芪、玄參、生地、忍冬藤、白芍、木瓜等11味中藥組成的復方制劑，具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)的功效[1]，用于中風恢復期的半身不遂、肢體麻木、口眼斜、舌強語蹇的治療，療效較好。原標準中只是對制劑的性狀、薄層色譜、檢查項下進行檢驗，未對制劑中玄參、生地、忍冬藤、白芍的有效成分進行含量測定[2-3]。為有效控制中風合劑的質(zhì)量，本研究中根據(jù)處方的劑型特點，對制劑中哈巴苷（玄參的有效成分）、梓醇（生地的有效成分）、綠原酸（忍冬藤的有效成分）、芍藥苷（白芍的有效成分）進行了含量測定[4-9]，現(xiàn)報道如下。

圖1 高效液相色譜圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo ultimate3000型高效液相色譜儀（包括自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器，賽默飛世爾公司）；梅特勒XS205DU型電子天平（德國賽多利斯公司）；ABY-2001-U型超純水機（重慶艾科浦公司）。

1.2 試藥

中風合劑（批號分別為 20161215，20170114，20170209，福建省南平市人民醫(yī)院醫(yī)院制劑）；梓醇對照品（批號為 110808-201210，含量為 98.1%），哈巴苷對照品（批號為111729-201204），綠原酸對照品（批號為110753-201314，含量為 96.6% ），芍藥苷對照品（批號為110736-201741，含量為95.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WelchXB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.06%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 ～5 min時 0→2%B，5～12 min時 2%→10%B，12～25 min時 10%→25%B，25～38 min時 25%→2%B，38～40 min時 2%B）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：200，231，327 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

分別取梓醇 19.88 mg、哈巴苷 19.25 mg、綠 原 酸17.56 mg 和芍藥苷對照品 30.12 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇，分別制成質(zhì)量濃度梓醇為 0.780 1 g ／L（Ⅰ）、哈巴苷為 0.770 0 g／L（Ⅱ）、綠原酸為 0.678 5 g ／L（Ⅲ）、芍藥苷為 1.153 0 g ／L（Ⅳ）的對照品貯備溶液，再分別精密吸取各5.0 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液（Ⅴ，梓醇為 0.156 g ／L、哈巴苷為 0.154 g ／L、芍藥苷為 0.230 6 g ／mL、綠原酸為 0.135 7 g ／L）。精密吸取中風合劑樣品5mL，置25mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例制備不含玄參、忍冬藤、生地和白芍的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

陰性干擾試驗：分別取2.2項下3種溶液各適量，在擬訂色譜條件下，依法進樣。陰性對照品溶液的色譜圖中，在梓醇、哈巴苷、綠原酸和芍藥苷色譜峰保留時間的相應位置上無干擾峰出現(xiàn)。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取混合對照品溶液1，2，3，4，5，6，7，8 mL，置 10 mL 容量瓶中，加 50% 甲醇稀釋至刻度，即得系列對照品溶液。再分別精密吸取系列對照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標、對照品進樣量（X）為橫坐標進行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 各成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍（n＝8）

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液10 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6次，測定。結(jié)果梓醇、哈巴苷、綠原酸和芍藥苷峰面積的RSD分別為0.82%，0.34%，0.15% ，1.56%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品溶液（批號為20161215），室溫放置，分別于 0，2，4，6，8，10，12，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果梓醇、哈巴苷、綠原酸和芍藥苷峰面積的RSD分別為 0.62%，0.71%，0.13%，0.24%（n＝8），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：精密量取同一批（批號為20161215）樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果梓醇、哈巴苷、綠原酸和芍藥苷峰面積的RSD分別為1.25%，1.62%，1.21%，1.34%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取同一批（批號為20161215）樣品2.5 mL，共6份。每份樣品分別精密加入梓醇對照品貯備液（Ⅰ）0.97mL、哈巴苷對照品貯備液（Ⅱ）0.84mL、綠原酸對照品貯備液（Ⅲ）0.45 mL和芍藥苷對照品貯備液（Ⅳ）1.71 mL，依法制備供試品溶液，依法進樣測定并計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定并計算含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（g／L）

3 討論

2015年版《中國藥典（一部）》收載有梓醇、哈巴苷、綠原酸及芍藥苷的高效液相色譜法，但未收載同時測定這4種組分的試驗[1]。試驗前，本研究中也考慮過使用紫外檢測器來同時檢測這4個成分，但因操作較煩瑣，而使用二極管陣列檢測器（DAD）檢測更加高效和節(jié)省時間。

曾取混合對照品溶液（Ⅴ），通過U3000型液相色譜儀（配有DAD檢測器），在190～500 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梓醇和哈巴苷于200 nm波長處吸收值最大，綠原酸于327 nm波長處吸收值最強，芍藥苷于231 nm波長處吸收值最大，并在此波長處無干擾。200 nm波長處雖4個特征峰形能分離，但芍藥苷與綠原酸的響應值相對較低。因此，參照以上色譜條件，設(shè)置DAD檢測器為3個不同紫外波長同時測定4種待測成分，即于200 nm波長處測定梓醇、哈巴苷含量，于327 nm波長處測定綠原酸含量，于231 nm波長處測定芍藥苷含量，各峰形基本上都能達到較理想的分離效果。此外，也嘗試對木瓜的有效成分齊墩果酸和熊果酸進行考察，因這兩者是同分異構(gòu)體，液相色譜法的分離效果不佳，故未對制劑中木瓜的含量進行測定，這是本試驗的不完善之處。以后可考慮通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)法區(qū)分。

分別考察了10%，30%，50%，70%，90%甲醇和甲醇6種稀釋溶劑對提取結(jié)果的影響[4]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同體積分數(shù)的甲醇對哈巴苷、綠原酸、芍藥苷的含量提取基本一致，而梓醇采用50%甲醇為溶劑，含量提取更高。因此，選擇50%甲醇作為稀釋溶劑。

綜上所述，采用高效液相色譜多波長法同時測定制劑中多個組分，較單通道檢測方法操作簡單，減少了操作步驟，節(jié)省了時間，可用作中風合劑的質(zhì)量控制。