留蘭香質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)探討*

萬(wàn)紅才，徐作剛，劉曉艷，段 萍，羅洪蓮，曾 琦，安 軍

（貴州省黔南州食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 都勻 558000）

留蘭香Mentha spicataL.為唇形科植物，全草入藥，夏、秋二季采收，除去雜質(zhì)，鮮用或陰干；氣芳香，味辛涼[1]，功能疏風(fēng)清熱、解表和中、里氣止痛，用于感冒頭痛、胃痛、咳嗽、腹脹、吐瀉、痛經(jīng)、肢麻、跌撲腫痛。目前對(duì)民族藥材留蘭香的質(zhì)量控制僅有性狀描述[2]。本研究中建立了其葉含量、水分、總灰分、酸不溶性灰分及揮發(fā)油含量測(cè)定等相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目，以保證該民族藥材的藥用安全性、有效性和可靠性，同時(shí)也為下一步的開(kāi)發(fā)研究提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DM-2500型生物顯微鏡，萊卡Las-v3.8型顯微照相系統(tǒng)（德國(guó)萊卡公司）；SK250LHC型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)儀器有限公司）；AG135型電子天平（梅特勒托利多）；揮發(fā)油測(cè)定器；水分測(cè)定管及配套玻璃儀器；水浴鍋及常規(guī)實(shí)驗(yàn)器材。

1.2 試藥

香芹酮對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為C11052000，含量為98.2%）；樣品采集于都勻翁奎（編號(hào)為 201701，201707，201708）、都勻大坪東沖（編號(hào)為201703）、都勻劍江河（編號(hào)為 201702）、開(kāi)陽(yáng)毛云（編號(hào)為 201706）、威寧草海（編號(hào)為 201704）、遵義桐梓（編號(hào)為201705）等貴州各地，經(jīng)貴州省食品藥品檢驗(yàn)所李揚(yáng)主任藥師鑒定為正品；硅膠G預(yù)制板（批號(hào)為20110712）、硅膠G板（批號(hào)為0110916）均由青島海洋化工有限公司生產(chǎn)；有機(jī)試劑及其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

市場(chǎng)上留蘭香偽品時(shí)有發(fā)現(xiàn)，采用顯微鑒別能對(duì)偽品作初步判定[3-4]。對(duì)3個(gè)不同采集地點(diǎn)的留蘭香進(jìn)行顯微鑒別，其顯微鑒別特征見(jiàn)圖1。本品葉表面觀：上表面腺鱗圓形或橢圓形，頭部8細(xì)胞，直徑約至100 μm，小腺毛長(zhǎng) 20～30 μm，直徑約 10 μm，頭部及柄部均為單細(xì)胞；下表面非腺毛3～15個(gè)細(xì)胞，長(zhǎng)30～150 μm，直徑約30 μm，常彎曲，微具疣突；氣孔多見(jiàn)，直軸式。

圖1 顯微鑒別圖

2.2 薄層色譜鑒別

溶液制備：分別稱取留蘭香藥材細(xì)粉3.0 g，優(yōu)化提取方法，對(duì)提取溶劑、提取方法進(jìn)行考察，最終以加乙醇30 mL，水浴回流30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液2 mL，作為供試品溶液。此方法操作簡(jiǎn)便，溶劑毒性小，耗時(shí)短，提取較完全。另取香芹酮對(duì)照品約10 mg，置100 mL容量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。

展開(kāi)系統(tǒng)考察：選用極性適當(dāng)?shù)娜軇謩e以正已烷 -乙酸乙酯 -甲酸（15∶8∶0.1，V∶V∶V）、石油醚 -乙酸乙酯 -甲酸（10∶1∶0.2，V∶V∶V）、石油醚 -乙酸乙酯 -甲酸（12∶8∶2，V∶V∶V）和正已烷 -乙酸乙酯 -甲酸（10∶1∶0.1，V∶V∶V）進(jìn)行考察，根據(jù)色譜圖分離效果，結(jié)合展開(kāi)劑的毒性、主要斑點(diǎn)的Rf值及清晰度，選取后一種為展開(kāi)系統(tǒng)。

點(diǎn)樣量考察：取制備的供試品溶液 2，3，5，6，8，10 μL及對(duì)照品溶液10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正已烷 -乙酸乙酯 -甲酸（10∶1∶0.1，V∶V∶V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，點(diǎn)樣量在5～10 μL時(shí)，所顯主斑點(diǎn)均清晰，分離度好背景淺，故選取5～10 μL為點(diǎn)樣體積。

耐用性考察：按國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則實(shí)施細(xì)則》相關(guān)要求進(jìn)行考察。溫度考察了低溫（4 ℃）、室溫（24 ℃）、高溫（40 ℃），相對(duì)濕度考察了低濕度（25% ）、中等濕度（50% ）和高濕度（75% ），薄層板分別選用硅膠G預(yù)制板（批號(hào)20110712）和硅膠G板（批號(hào)為0110916），結(jié)果均較好。

薄層色譜鑒別：按上述優(yōu)化的方法分別制備各地采集樣品的供試品溶液，取對(duì)照品溶液，照薄層色譜法（2015 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則 0502）試驗(yàn)。8 批留蘭香樣品色譜圖中，在對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上均顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見(jiàn)圖2。采用香芹酮對(duì)照品做主要成分鑒定，能把同科同屬植物薄荷偽品作有效區(qū)別，是專屬性強(qiáng)的有效方法之一[5]，彌補(bǔ)了顯微鑒別法的局限性。

2.3 指標(biāo)成分檢查

葉含量：藥材所含揮發(fā)油成分在全草植物體的不同部位（器官）中含量是不均衡的，葉中的含量要遠(yuǎn)高于其他部位（器官）；由于該藥材在采收季節(jié)、加工、炮制、運(yùn)輸過(guò)程中，常因其葉在干燥后易脫落或碎裂而致其藥材中所含葉量少而主要為莖根，使得藥材和飲片中揮發(fā)油含量下降；為了保證藥材的完整性，把葉含量作為控制藥材質(zhì)量指標(biāo)之一；參照2015年版《中國(guó)藥典（一部）》中薄荷藥材檢查方法[6]及2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0211藥材和飲片的取樣法[7]29取樣，稱定質(zhì)量；把根莖和葉分離，稱取葉的質(zhì)量，計(jì)算即得。詳見(jiàn)表1。

圖2 薄層色譜圖

表1 各成分含量測(cè)定結(jié)果（%）

水分：中藥材含有過(guò)量的水分時(shí)，極易造成中藥霉?fàn)€變質(zhì)，使有效成分分解，且相對(duì)減少了實(shí)際用量而影響療效，因此，控制中藥中的水分含量對(duì)保證中藥質(zhì)量有密切關(guān)系；留蘭香藥材及飲片中主要含揮發(fā)性成分，水分測(cè)定按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0832水分測(cè)定第四法測(cè)定[7]103。結(jié)果見(jiàn)表 1。

總灰分及酸不溶性灰分：測(cè)定灰分的目的是限制中藥中無(wú)機(jī)雜質(zhì)如泥土、沙石的含量，以保證中藥的純度，《中國(guó)藥典》已將灰分測(cè)定作為一種常規(guī)檢查，對(duì)大多數(shù)藥材和飲片規(guī)定了限量檢查指標(biāo)[7]204。總灰分測(cè)定法用的供試品須粉碎，使能通過(guò)2號(hào)篩，混勻后，取供試品3～5 g，依法測(cè)定，根據(jù)殘?jiān)|(zhì)量，計(jì)算供試品中總灰分的含量（%）。酸不溶性灰分測(cè)定根據(jù)殘?jiān)|(zhì)量，計(jì)算供試品中酸不溶性灰分的含量（%）。結(jié)果見(jiàn)表1。

揮發(fā)油含量測(cè)定：按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則2204測(cè)定[7]203。測(cè)定的留蘭香樣品須粉碎，使能通過(guò) 2號(hào)至 3號(hào)篩，混勻，取供試品適量（150.00～200.00 g），置2 000 mL的硬質(zhì)圓底燒瓶中，加水650～700 mL與玻璃珠數(shù)粒，保持微沸3 h，依法測(cè)定，讀取揮發(fā)油量，并計(jì)算供試品中揮發(fā)油的含量（%），結(jié)合8批以上不同采集地點(diǎn)、時(shí)間來(lái)源樣品的測(cè)定結(jié)果，確定含量的限度。詳見(jiàn)表2。

表2 揮發(fā)油含量測(cè)定結(jié)果（%）

3 討論

顯微鑒別方法是通過(guò)對(duì)留蘭香顯微特征進(jìn)行觀察、測(cè)量所總結(jié)出的具有代表性的共性描述，可簡(jiǎn)便快速地對(duì)該藥材進(jìn)行初步判定。

薄層色譜鑒別法的建立試驗(yàn)中采用提取方法、點(diǎn)樣量、展開(kāi)系統(tǒng)及耐用性等能與相似藥材薄荷區(qū)分開(kāi)，可行性與專屬性可作為該藥材的質(zhì)量控制方法之一。

因留蘭香葉是含揮發(fā)油成分的主要器官，采用控制葉含量測(cè)定來(lái)控制該藥材質(zhì)量，保證了藥材的完整性，同時(shí)提高了有效成分揮發(fā)油的含量，經(jīng)測(cè)定8批留蘭香藥材含葉平均值為18.04%，按不低于平均值的80%制訂標(biāo)準(zhǔn)。

留蘭香藥材中葉含量不得少于15.52%，再結(jié)合現(xiàn)行2015年版《中國(guó)藥典》中對(duì)該類藥材的限量要求和實(shí)際測(cè)定結(jié)果，建議留蘭香藥材葉含量不得少于14.00%。

由于留蘭香含有揮發(fā)性成分，因此建立甲苯法測(cè)定其水分，經(jīng)測(cè)定8批留蘭香藥材平均值為10.86%，建議留蘭香藥材水分不得超過(guò)15.00%。

該藥材為全草入藥，采收時(shí)可能會(huì)帶入泥土、砂石，有建立總灰分及酸不溶性灰分檢查的必要性，根據(jù)對(duì)8批留蘭香藥材樣品的檢測(cè)，總灰分平均值為7.89%，酸不溶灰分為1.34%，建議留蘭香藥材總灰分平均值為10.00%，酸不溶灰分為2.00%。

樣品中揮發(fā)油含量的多少關(guān)系到藥材的優(yōu)劣，結(jié)果8批留蘭香藥材揮發(fā)油平均值為0.36%，按不低于平均值的80.00%制訂標(biāo)準(zhǔn)，留蘭香藥材揮發(fā)油不得少于0.26%，建議留蘭香藥材揮發(fā)油含量不得少于0.25%（mL／g）。

此標(biāo)準(zhǔn)在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上增加顯微鑒別、薄層色譜鑒別、各項(xiàng)檢查及揮發(fā)油含量測(cè)定等方法，形成了一個(gè)較完整的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，可進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)該藥材的質(zhì)量控制，保障民眾用藥安全。