三明野生黃精不定芽增殖和生根體系研究

鄭瑋璇 ，黃奔奔 ，俞涵曦 ，徐小萍 ，邵顏平 ，郭志鵬 ，何邱明，賴鐘雄*，林玉玲*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州 350002；2.福建盤古中藥材有限公司，福建三明 365000）

黃精（Polygonatum sibiricum）屬于百合科黃精屬具肉質(zhì)根狀莖的多年生藥用草本植物，俗稱老虎姜、雞頭參、野山姜，以根莖入藥，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎功能。黃精的主要功能成分是多糖、皂苷和黃酮。多糖具有抗腫瘤、抗輻射、改善記憶、預(yù)防骨質(zhì)疏松癥等作用[1-2]；皂苷具有提高免疫力、延緩衰老等作用[3]；黃酮具有抗氧化、降血糖、調(diào)血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等作用[4]。黃精為兼具食用、藥用和觀賞價(jià)值的經(jīng)濟(jì)植物，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。福建是黃精的產(chǎn)地之一，三明市是福建道地中藥材的主要產(chǎn)區(qū)之一。三明黃精樣本中多糖含量已經(jīng)超過(guò)了《中國(guó)藥典》[5]中黃精合格含量的3倍之多，藥效更足。黃精產(chǎn)業(yè)在健康大背景下后市看好，但產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在資源枯竭且質(zhì)量不穩(wěn)定、人工栽培種質(zhì)混亂技術(shù)滯后、功效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確等問(wèn)題[6]，急需加強(qiáng)對(duì)其繁育技術(shù)和核心功效物質(zhì)的基礎(chǔ)研究。

黃精的繁殖方式主要有有性繁殖（種子繁殖）和無(wú)性繁殖（塊莖繁殖）2種。由于黃精種子難收集，種子發(fā)芽率低，而且種子繁殖育苗時(shí)間長(zhǎng)，種子繁殖至少5年以上才能收獲[7]，這樣就大大增加了黃精的栽培成本，不利于黃精的人工大面積種植。在當(dāng)前的人工栽培中，黃精繁殖主要依靠根莖的無(wú)性繁殖，但該方法繁殖系數(shù)低，種根莖用量大，既不經(jīng)濟(jì)，又限制了黃精的產(chǎn)量潛力，不便栽植管理推廣[8]。僅靠野生資源來(lái)生產(chǎn)藥品遠(yuǎn)不能滿足整個(gè)醫(yī)藥市場(chǎng)的需求。因此，建立更加高效的組織培養(yǎng)快繁體系是目前黃精快速繁殖的重要突破口。

增殖和生根培養(yǎng)是黃精組織培養(yǎng)的難點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)工廠化、規(guī)?；绲年P(guān)鍵技術(shù)。關(guān)于同屬植物多花黃精（P.cyrtonema）的增殖和生根體系已有不少研究。徐忠傳等[9]的研究表明，6-BA對(duì)黃精不定芽增殖起顯著促進(jìn)作用，是目前較為常用的芽增殖植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。通過(guò)許麗萍等[10]的研究可知，僅單獨(dú)使用6-BA也能達(dá)到較好的增殖效果，60 d左右增殖系數(shù)超過(guò)3。程強(qiáng)強(qiáng)等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TDZ有利于多花黃精不定芽增殖，但不定芽生長(zhǎng)較慢，繼代1個(gè)月的增殖苗仍不能用于生根。6-BA與TDZ組合培養(yǎng)，雖然可縮短生根時(shí)間，但增殖效率不高，需要進(jìn)一步優(yōu)化激素配比。劉紅美等[12]和李鶯等[13]分別對(duì)多花和雞頭黃精生根條件進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)最佳生根培養(yǎng)基均為1/2 MS+0.7 mg/L IBA，生根率為90%以上，有效解決了黃精組培快繁中生根率低的問(wèn)題。李文金等[14]以泰山多花黃精試管苗為試驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)最佳生根條件為1/2MS+0.5 mg/L NAA+蔗糖20g/L+暗培養(yǎng)7 d，生根率高達(dá)96%。周新華等[15]對(duì)多花黃精生根培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，結(jié)果顯示多花黃精生根的最適基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，不同種類生長(zhǎng)素對(duì)不定根的誘導(dǎo)能力的強(qiáng)弱依次為NAA＞IBA＞IAA，多花黃精組培苗的最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，生根率為95%。這些均為該次試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供了參考依據(jù)。目前尚未見(jiàn)到關(guān)于福建三明野生黃精增殖體系和生根體系的報(bào)道，該研究以福建三明野生黃精為材料，建立高效不定芽增殖和生根體系，以期為工廠化、規(guī)?；娜饕吧S精育苗提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來(lái)源于福建盤古中藥材有限公司收集種植的福建三明野生黃精。于2017年12月及2018年4—5月挖出，后移至福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，埋藏于栽培基質(zhì)中。參考實(shí)驗(yàn)室呂煜夢(mèng)等建立的無(wú)菌體系進(jìn)行消毒試驗(yàn)（待發(fā)表，三明野生黃精無(wú)菌體系的建立與不定芽的誘導(dǎo)），將黃精塊莖從基質(zhì)中挖出，洗去泥土。剪去葉片和須根，用牙刷或毛刷清洗表面基質(zhì)土，用洗衣粉溶液浸泡，在流水下沖洗3 h，3%多菌靈浸泡2 d后用清水洗去表面多菌靈，然后晾干。在超凈臺(tái)用無(wú)菌水清洗1～2遍，取出塊莖于濾紙晾干，在接種盤中將塊莖根據(jù)節(jié)間長(zhǎng)度切成小塊，較大的塊莖適當(dāng)切小些。用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s，無(wú)菌水清洗1～2次；用0.2%升汞進(jìn)行深度滅菌15min，同時(shí)滴1滴吐溫；無(wú)菌水清洗4～5次。

將消毒后的塊莖在MS+4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，選擇生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌帶芽塊莖作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 不定芽增殖。將芽誘導(dǎo)試驗(yàn)得到的無(wú)菌帶芽塊莖切成直徑0.5 cm大小的叢生芽塊，切除塊莖底部發(fā)黑褐化的部分以及部分葉片和苞衣后轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基為：（1）MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D；（2）MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA；（3）MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L2，4-D；（4）MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L2，4-D+0.5 mg/L IAA。以上4種培養(yǎng)基均添加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH 5.8。30 d后觀察并統(tǒng)計(jì)芽增殖系數(shù)。

1.2.2 生根試驗(yàn)。將叢生芽切開(kāi)，保留葉片，分成單株，分別接種在添加不同濃度生長(zhǎng)素NAA（0.2～1.0 mg/L）和IBA（0.2～1.0 mg/L）生根培養(yǎng)基上，3種培養(yǎng)基均添加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH 5.8。每瓶接種6個(gè)塊莖，每個(gè)處理接種10瓶，45 d統(tǒng)計(jì)生根率，平均根數(shù)。

1.2.3 培養(yǎng)條件。培養(yǎng)室溫度控制在（25±2）℃，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx，每天光照時(shí)間16 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)不定芽增殖的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，在相同6-BA濃度的基礎(chǔ)上添加不同濃度的IAA、2，4-D、TDZ對(duì)黃精帶芽塊莖進(jìn)行培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計(jì)觀察結(jié)果見(jiàn)表1。將無(wú)菌外植體接入增殖培養(yǎng)基后約15 d有啟動(dòng)趨勢(shì)，出現(xiàn)突出的芽原基；培養(yǎng)25 d左右原有不定芽周圍有大量新芽冒出，且其生長(zhǎng)勢(shì)逐漸增強(qiáng)，有效芽逐漸增多（圖1）。由表1可知，在三明野生黃精增殖繼代的過(guò)程中隨著TDZ濃度的提高，不定芽增殖系數(shù)也相應(yīng)提高。帶芽黃精塊莖在1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA的培養(yǎng)基中增殖效果最好，增殖系數(shù)最高，為3.02，但芽點(diǎn)較細(xì)長(zhǎng)，部分葉片發(fā)生不規(guī)則彎曲。

表1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)三明野生黃精不定芽增殖的影響

圖1 三明野生黃精不定芽增殖情況

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)組培苗生根的影響

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的生長(zhǎng)素（NAA、IBA），培養(yǎng)15 d可見(jiàn)基部有白色的根系，培養(yǎng)45 d后，統(tǒng)計(jì)生根情況，結(jié)果如表2所示。以NAA為主的激素處理比以IBA為主的激素處理生根率高；從根系形態(tài)上來(lái)看，NAA濃度高的處理根系較為粗壯，IBA濃度高的處理根系較細(xì)弱。在IBA濃度相同的情況下，隨著NAA濃度的升高生根率呈上升趨勢(shì)。結(jié)果表明NAA誘導(dǎo)三明野生黃精生根的效果比IBA好，1/2MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA生根率最高，為73.3%，但根數(shù)少，幼苗生長(zhǎng)勢(shì)弱，不利于移栽成活。1/2MS+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA生根率高，平均根數(shù)多，但同樣存在幼苗生長(zhǎng)勢(shì)弱的問(wèn)題。綜合考慮，1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA為最適生根培養(yǎng)基，生根率為65.0%，平均生根數(shù)為7.67條，芽苗健壯（圖 2）。

表2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)三明野生黃精生根的影響

圖2 1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA誘導(dǎo)的三明野生黃精不定根

3 討論

3.1 TDZ對(duì)不定芽增殖有顯著促進(jìn)作用

影響植物離體培養(yǎng)的因素有很多，包括外植體的品種、生理狀態(tài)、激素配比等。TDZ是一種高活性細(xì)胞分裂素，常用于木本植物組織培養(yǎng)[16]。TDZ能強(qiáng)烈促進(jìn)愈傷組織、側(cè)芽及不定芽的發(fā)生，在許多植物芽增殖過(guò)程中有良好的效果[17-18]。三明野生黃精芽增殖試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，處理3（1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D）和處理 4（1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA） 的增殖系數(shù)顯著高于其他處理，可能由于TDZ對(duì)黃精芽增殖有較好的促進(jìn)效果。徐紅梅等[19]研究發(fā)現(xiàn)，TDZ促進(jìn)多花黃精芽增殖的效果優(yōu)于6-BA處理，但對(duì)葉片生長(zhǎng)不利，會(huì)導(dǎo)致畸形葉片的產(chǎn)生。這與該次試驗(yàn)的結(jié)果相似，部分葉片出現(xiàn)不規(guī)則彎曲，葉片較為細(xì)長(zhǎng)。為了保持葉片正常形態(tài)，增殖培養(yǎng)后期應(yīng)將叢生芽塊轉(zhuǎn)接到不含TDZ的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)葉片正常生長(zhǎng)。處理 1（1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D）與處理2（1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA）相比增殖效果更佳，可能由于該處理生長(zhǎng)素濃度過(guò)高，對(duì)芽增殖產(chǎn)生抑制作用[20]。處理4的增殖效果優(yōu)于處理3，表明IAA和2，4-D一起處理增殖效果優(yōu)于單獨(dú)使用2，4-D。

3.2 NAA比IBA更有利于三明野生黃精生根

生長(zhǎng)素能促進(jìn)外植體生根。生長(zhǎng)素IBA、NAA被廣泛應(yīng)用于黃精及多花黃精生根誘導(dǎo)，如0.8～1.0 mg/L NAA[11，21]、0.7～1.0 mg/L IBA[12，22]為各報(bào)道中最佳的生根激素配比。在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低濃度生長(zhǎng)素如0.5 mg/L NAA、0.7 mg/L IBA處理下生根啟動(dòng)慢、生根率極低，推測(cè)三明野生黃精需要較高濃度的生長(zhǎng)素處理。試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)三明野生黃精生根較為困難，這可能與三明野生黃精本身生根性質(zhì)有關(guān)。后期參考現(xiàn)有生根報(bào)道設(shè)計(jì)了8個(gè)處理，結(jié)果顯示NAA比IBA更適合誘導(dǎo)三明野生黃精生根，單獨(dú)使用1.0 mg/L IBA、NAA處理，1.0 mg/L NAA的生根率明顯高于1.0 mg/L IBA的處理。在1.0 mg/L NAA的基礎(chǔ)上添加一定濃度IBA對(duì)不定根的誘導(dǎo)有顯著促進(jìn)作用。1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA是生根效果最佳的組合，生根率為70.0%，平均生根數(shù)6.62，但幼苗長(zhǎng)勢(shì)弱，不利于移栽成活。綜合考慮，1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA為生根培養(yǎng)最適培養(yǎng)基。

綜上所述，三明野生黃精最佳芽增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L IAA，30 d增殖系數(shù)達(dá)3.02；最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA，生根率為65.0%，平均根數(shù)7.67。該研究可為三明野生黃精規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。