烏司他丁預(yù)處理對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的研究

楊巧俠 王成果 王元欣

摘要：目的? 探討烏司他?。║TI）預(yù)處理對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。方法? 將HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代，隨機(jī)分為H2O2組，UTI100+H2O2組、UTI500+H2O2組、UTI1000+H2O2組及對(duì)照組，其中對(duì)照組不作任何處理，H2O2組，UTI100+H2O2組、UTI500+H2O2組、UTI1000+H2O2組分別加入濃度為0 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L UTI預(yù)處理，24 h后加入300 μmol/L H2O2處理4 h，體外模擬肝細(xì)胞損傷。CCK-8試劑盒和LDH試劑盒檢測LDH變化評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷;TUNEL檢測細(xì)胞凋亡率;Western blot檢測HepG2細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Cleaved caspase-3的表達(dá)變化情況。結(jié)果? 與H2O2組相比較，CCK-8和LDH檢測結(jié)果提示，各TUI預(yù)處理組能改善細(xì)胞生存環(huán)境，減輕H2O2對(duì)HepG2細(xì)胞的應(yīng)激損傷，提高細(xì)胞活力（P<0.05）;TUNEL檢測提示預(yù)處理可降低氧化應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡率（P<0.05）; Western blot結(jié)果提示，與H2O2組比較，UTI可上調(diào)LC3-Ⅱ的表達(dá)（P<0.05），促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生，降低Cleaved caspase-3表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡 （P<0.05）。結(jié)論? UTI可以通過激活LC3-Ⅱ表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞自噬，發(fā)揮保護(hù)作用，拮抗氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：烏司他丁;自噬;凋亡;氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào)：R575.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.13.020

文章編號(hào)：1006-1959（2019）13-0072-05

Abstract：Objective? To investigate the protective effect of ulinastatin （UTI） preconditioning on oxidative stress injury in HepG2 cells.Methods? HepG2 cells were routinely cultured and randomly divided into H2O2 group， UTI100+ H2O2 group， UTI500+ H2O2 group， UTI1000+ H2O2 group and control group. The control group did not do any treatment. H2O2 group， UTI100+ H2O2 group， UTI500+ H2O2 group，UTI1000+ H2O2 group was pretreated with 0 μmol/L， 100 μmol/L， 500 μmol/L， and 1000 μmol/L UTI. After 24 h， 300 μmol/L H2O2 was added for 4 h to simulate hepatocytes in vitro. damage. CCK-8 kit and LDH kit were used to detect LDH changes to evaluate cell damage; TUNEL was used to detect apoptosis rate; Western blot was used to detect the expression of LC3-II and Cleaved caspase-3 in HepG2 cells. Results? Compared with the H2O2 group， the results of CCK-8 and LDH showed that each TUI pretreatment group could improve the cell survival environment， reduce the stress damage of? H2O2 on HepG2 cells， and increase cell viability （P<0.05）. TUNEL detection suggested pretreatment. The apoptosis rate induced by oxidative stress was reduced （P<0.05）.Western blot results showed that compared with H2O2 group， UTI could up-regulate the expression of LC3-II （P<0.05）， promote the occurrence of autophagy， decrease the expression of Cleaved caspase-3， and inhibit cell apoptosis （P<0.05）. Conclusion? UTI can promote the autophagy of cells by activating LC3-II expression， and play a protective role in antagonizing apoptosis induced by oxidative stress.

Key words：Ulinastatin;Autophagy;Apoptosis;Oxidative stress

肝臟擔(dān)負(fù)著人體的重要生理功能，肝臟損傷引起肝功能代謝障礙，繼而引起的一系列臨床癥狀，對(duì)患者造成一定的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。藥物性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝病等肝病的共同病理基礎(chǔ)是肝細(xì)胞損傷[1]。烏司他丁（ulinastatin，UTI）是從健康男性尿液提取的一種蛋白酶抑制劑，具有強(qiáng)大的廣譜溶酶體酶抑制功能，具有穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用[2]。臨床上常用于急性胰腺炎、急性循環(huán)衰竭的救治。氧化應(yīng)激是肝細(xì)胞損傷中一個(gè)重要的損傷機(jī)制，是各種肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)[3]。本研究通過模擬離體急性肝細(xì)胞損傷，探討UTI預(yù)處理對(duì)肝細(xì)胞自噬調(diào)控、凋亡的影響，為肝損傷的救治提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料? 人肝癌細(xì)胞HepG2由中國科學(xué)院腫瘤醫(yī)院提供;胎牛血清購自Gibco公司;DMEM及0.25%胰酶購自美國Invitrogen公司;兔抗小鼠LC3B、β-actin、Cleaved caspase-3抗體購自于美國CST公司;TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒美國Roche;山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記二抗購自于武漢三鷹;細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒（cell counting Kit-8，CCK-8）購自于日本同仁公司;乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)? 將HepG2 細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇，加入離心管中，吹打混勻，離心機(jī)中離心（800 r/min，5 min），棄上清，使用高糖型DMEM培養(yǎng)基并加10%胎牛血清配制而成的培養(yǎng)液，移入培養(yǎng)瓶中，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞長至約85%密度時(shí)，可以傳代，經(jīng)消化分散后，接種于塑料培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組? 將傳代好的HepG2細(xì)胞分隨機(jī)為5組，對(duì)照組不作任何處理，其余4組分別加入濃度為0 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L UTI預(yù)處理24 h后，加入300 μmol/L H2O2處理4 h，體外模擬肝細(xì)胞損傷。

1.2.3 CCK-8細(xì)胞活力檢測? 將HePG2細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為5×107/L，每孔200 μL接種于96孔板上，按上述分組，每組接種8孔，經(jīng)UTI預(yù)處理H2O2損傷后。加入20 μL 的CCK-8溶液在孵箱中繼續(xù)孵育2 h，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀450 nm下檢測吸光度（optical density， OD）。

1.2.4 LDH釋放量測定? 各組經(jīng)處理后，取其培養(yǎng)液。根據(jù)說明書配置標(biāo)準(zhǔn)品后，取其標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品各5 μl加入96孔板，每孔再加入底物工作液100 μl，37℃孵育5 min讀取吸光值A(chǔ)1。孵育30 min后用酶標(biāo)儀在490 nm處測吸光值A(chǔ)2。再用A2值減去A1值等于最終OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相對(duì)應(yīng)的LDH含量。

1.2.5 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡? 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，避光條件下，按9∶1混勻TUNEL試劑盒中的A液和B液，加入配置好的TUNEL反應(yīng)液，加入待檢測細(xì)胞爬片中，放入37℃恒溫孵育1 h。PBS清洗后封片，Hoechst 染料染核5 min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)算凋亡率。凋亡率=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/Hoechst細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6 Western blot檢測LC3和Cleaved caspase-3表達(dá)變化? 收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，和LC3（1∶3000）、Cleaved caspase-3（1∶500）與β-actin（1∶3000）抗體結(jié)合，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，電化發(fā)光法顯色后照相。最后用Image master VDS成像系統(tǒng)攝影，圖像分析件（Image J）行灰度掃描分析。以目的蛋白與β-actin的蛋白產(chǎn)物條帶灰度值之比作為其蛋白水平的相對(duì)量。并進(jìn)行掃描圖像分析儀計(jì)算蛋白條帶的表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 應(yīng)用GraphPad prism 5軟件處理數(shù)據(jù)。連續(xù)變量以（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，同組間兩兩比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著，P<0.001表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義極顯著。

2結(jié)果

2.1各組CKK-8細(xì)胞活性檢測結(jié)果比較? 與對(duì)照組比較，H2O2組細(xì)胞活性顯著下降為（46.30±1.40）%;而UTI100+H2O2組，UTI500+H2O2組，UTI1000+H2O2組細(xì)胞活性隨濃度逐漸增強(qiáng)，分別為（53.58±1.80）%，（58.90±1.45）%，（66.08±0.89）%，見圖1。

2.2 LDH釋放量檢測? 結(jié)果顯示，各UTI處理組與H2O2組比較，LDH檢測率減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡? 在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡如圖2所示。通過TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，對(duì)照組陽性細(xì)胞（4.00±0.31）%，H2O2組神經(jīng)元凋亡率達(dá)（62.80±0.86）%，UTI1000+H2O2組陽性細(xì)胞（34.00±0.70）%，對(duì)照組與H2O2組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P<0.01），見圖3。

2.4 Western blot檢測LC3-Ⅱ和Cleaved caspase-3表達(dá)變化? Western blot結(jié)果提示，HepG2細(xì)胞H2O2處理后LC3-Ⅱ表達(dá)增高，隨著UTI預(yù)處理濃度越大，LC3-Ⅱ表達(dá)進(jìn)一步增高，與H2O2組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;同時(shí)，在H2O2損傷發(fā)生后升高明顯，而UTI預(yù)處理組隨著濃度增加，Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)減少，與H2O2組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

3討論

肝細(xì)胞損傷是一種由多因素介導(dǎo)的復(fù)雜的生物學(xué)過程，氧自由基的過度激活、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的引發(fā)和持續(xù)是肝病發(fā)生發(fā)展的重要病理過程之一[4]。正常生理情況下，自由基不斷產(chǎn)生、被清除，維持在動(dòng)態(tài)平衡的情況下。當(dāng)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)對(duì)自由基清除能力不足時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，引起脂質(zhì)過氧化、酪氨酸硝化、線粒體呼吸鏈一直等多種途徑，造成核酸斷裂、蛋白交聯(lián)、變性和酶失活等。目前研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激在肝臟疾病中的重要后果可能是改變了基因的表達(dá)，進(jìn)而觸發(fā)炎癥反應(yīng)、肝纖維化或癌變，或啟動(dòng)或加強(qiáng)凋亡[5]。而凋亡抑制因子可能通過攻擊起關(guān)鍵作用的巰基，從而使Caspase喪失活性，通過抑制Caspase活性和參與調(diào)解核因子NF-kB的作用而抑制細(xì)胞凋亡，但這種攻擊可能同時(shí)導(dǎo)致壞死，尤其當(dāng)自由基的濃度很高時(shí)更易引發(fā)壞死[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，烏司他丁能抑制氧自由基的產(chǎn)生，抑制多種炎癥介質(zhì)產(chǎn)生[7， 8]。臨床常用于胰腺炎、膿毒癥、多器官功能障礙綜合征等疾病的治療[9]。然而在多項(xiàng)顱腦損傷的研究中，證明烏司他丁可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和死亡，改善神經(jīng)細(xì)胞損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用[10-12]。有研究發(fā)現(xiàn)UTI可通過抑制多種炎癥物質(zhì)，如彈性蛋白酶、氧自由基等，避免其作用肺血管，改善肺水腫臨床癥狀[13]。在大鼠的肝細(xì)胞損傷模型中，有人認(rèn)為烏司他丁可以通過下調(diào)肝組織中NF-κB、p65表達(dá)，增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化能力[14]。而在UTI預(yù)處理可改善大鼠膿毒癥模型對(duì)心臟組織的損傷，具有保護(hù)作用其作用機(jī)制可能與UTI對(duì)應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，能量代謝，免疫反應(yīng)等相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用有關(guān)[15]。

本研究中，根據(jù)CCK-8活力檢測和LDH釋放檢測，結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞對(duì)H2O2氧化損傷敏感，H2O2處理后細(xì)胞活力顯著降低，LDH漏出率明顯升高，而通過烏司他丁預(yù)處理組觀察，細(xì)胞活力有所增高。LC3-Ⅱ是自噬的標(biāo)志性分子，其表達(dá)的高低與發(fā)生自噬的程度成正比[16]。Cleaved caspase-3表達(dá)水平反應(yīng)了細(xì)胞的凋亡狀況[17]。相關(guān)研究表明，在HCV 感染的肝細(xì)胞中出現(xiàn)自噬泡堆積現(xiàn)象，說明HCV病毒阻止自噬泡與溶酶體融合，從而避免病毒被溶酶體降解[18]。而通過脂多糖/D-半乳糖胺可以提高細(xì)胞中的自噬作用，保護(hù)野生型小鼠的急性肝損傷，細(xì)胞自噬對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用[19]。因此，本研究進(jìn)一步通過Western blot手段檢測LC3-Ⅱ和Cleaved caspase-3表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與H2O2組比較，UTI處理組LC-Ⅱ表達(dá)增高，并呈濃度依賴性，Cleaved caspase-3表達(dá)則表達(dá)下降，說明通過UTI預(yù)處理，細(xì)胞自噬表達(dá)增強(qiáng)，凋亡分子表達(dá)減少。

氧化應(yīng)激的發(fā)生在一定程度上會(huì)激活細(xì)胞的凋亡[20]，通過凋亡的發(fā)生可以阻斷病毒復(fù)制或清除受損、衰老的肝細(xì)胞，維持肝臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。而肝細(xì)胞過度凋亡會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，嚴(yán)重的肝損傷、甚至肝功能衰竭的發(fā)生。自噬和凋亡兩者之間可以相互轉(zhuǎn)變，細(xì)胞內(nèi)部可以通過應(yīng)激依賴的幸存機(jī)制調(diào)控來恢復(fù)細(xì)胞使其達(dá)到穩(wěn)態(tài)，所以，在外界條件刺激下，細(xì)胞會(huì)通過自噬清理受損線粒體，以避免凋亡因子進(jìn)入細(xì)胞里激活凋亡信號(hào)。

肝損傷是臨床上常見的疾病，對(duì)各種肝病所致的肝細(xì)胞損傷的病理機(jī)制至關(guān)重要，而尋找有效的防治藥物仍然同樣重要。盡管國內(nèi)外目前關(guān)于UTI對(duì)肺損傷、胰腺炎和休克等危重傷病保護(hù)機(jī)制的研究，已經(jīng)取得了極大的進(jìn)展。但關(guān)于UTI在肝病中作用和機(jī)制研究較少，而對(duì)于UTI預(yù)處理可以影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸，特別是凋亡和自噬的影響更值得我們進(jìn)行深入的研究。

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收稿日期：2019-4-15;修回日期：2019-4-25

編輯/宋偉