顫抖蛋白異構(gòu)體7在乳腺癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

徐振雷，王慶偉

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院1.燒傷整形科，2.檢驗(yàn)科，江蘇淮安223001）

qkI基因編碼一組RNA結(jié)合蛋白的剪接異構(gòu)體，主要調(diào)控細(xì)胞分化［1-2］。在神經(jīng)祖細(xì)胞、肌細(xì)胞和單核細(xì)胞中，顫抖蛋白（Quaking，QKI）異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的分化缺陷［3-4］。qkI基因編碼3個(gè)主要的RNA結(jié)合蛋白，QKI-5，-6和-7，其C末端30個(gè)氨基酸不同；QKI-5 C端含有核定位序列，主要定位于細(xì)胞核中，QKI-6分布在整個(gè)細(xì)胞中并與QKI-5形成異源二聚體，QKI-7主要定位于細(xì)胞質(zhì)中［5］。QKI可作為預(yù)測結(jié)腸癌、肺癌、口腔癌和胃癌預(yù)后的生物標(biāo)志物［6-9］，QKI-5通過Ras-MAPK信號通路抑制腎透明細(xì)胞癌的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯［10］，也可以預(yù)測前列腺癌患者的預(yù)后［11］。但是，QKI-7在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不清楚。本研究擬觀察QKI-7在乳腺癌組織中的表達(dá)，并分析其與患者預(yù)后之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料與試劑

組織芯片購于上海芯超生物有限公司，共142例原發(fā)性乳腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞5.0 cm）。所有患者臨床病理資料和隨訪資料均完整，均為女性，年齡29～83歲，平均53.3歲；腫瘤直徑為0.5～15.0 cm，平均3.5 cm；其中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移90例；組織學(xué)類型：浸潤性導(dǎo)管癌134例，浸潤性導(dǎo)管癌伴浸潤性小葉癌7例，篩孔癌1例；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期12例，Ⅱ期83例，Ⅲ期47例。手術(shù)前均未經(jīng)過放射治療、化學(xué)治療和靶向藥物治療，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；患者接受乳腺癌保乳手術(shù)或乳腺癌根治手術(shù)，手術(shù)時(shí)間為2001年1月至2004年8月，隨訪時(shí)間截止到2013年7月，隨訪9～13年。

小鼠抗人單克隆抗體QKI-7（上海文淵閣生物科技有限公司）；小鼠抗人P53和Ki-67抗體（美國Sigma公司）；兔抗小鼠二抗購于上海威奧生物科技有限公司；通用型免疫組化檢測試劑盒購于吉泰生物有限公司。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測QKI-7、P53和Ki-67的表達(dá)

采用SP免疫組織化學(xué)染色法，將組織芯片在80℃微波中加熱20 min；二甲苯浸泡脫蠟15 min；50%、70%、80%、95%梯度乙醇水化各2 min；PBS沖洗3次，每次5 min；3%過氧化氫固定10 min；置于95℃0.01mol/L枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）中煮沸15 min，行抗原修復(fù)；滴加正常山羊血清室溫封閉20min；滴加小鼠抗人QKI-7（1∶2 000）、P53（1∶1 000）、Ki-67（1∶1 000），4℃孵育過夜；滴加兔抗小鼠二抗（1∶1 000）室溫孵育 2 h；PBS洗 3次，每次 5 min；DAB顯色，脫水、透明、封片、鏡檢；用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

將組織芯片置于光鏡下觀察和評分，結(jié)果判斷綜合考慮低倍鏡下陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和高倍鏡下陽性細(xì)胞所占比例。染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比評分標(biāo)準(zhǔn)：基本不著色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。組織芯片置于顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＜10%為0分；10%～40%為1分；40%～70%為2分；≥70%為3分。兩者相加，0～2分為陰性；3～6分為陽性［12］。由2位有資質(zhì)的病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判讀，陰陽性判斷不一致時(shí)，以第三位病理科醫(yī)師的判讀結(jié)果為準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，QKI-7、P53及Ki-67在乳腺癌和癌旁組織中的陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，QKI-7與P53和Ki-67表達(dá)相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，乳腺癌組織中QKI-7的陽性率與各臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用Pearson、Fisher精確檢驗(yàn)和似然比檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)評估總生存期，組間生存時(shí)間的比較采用Log-Rank法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QKI-7在乳腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，QKI-7主要位于細(xì)胞質(zhì)中，P53和Ki-67主要位于細(xì)胞核。乳腺癌組織中QKI-7陽性表達(dá)率（28.2%，40/142）明顯低于癌旁組織（78.9%，112/142，χ2=73.378，P＜0.05）。此外，乳腺癌組織中P53陽性表達(dá)率（21.8%，31/142）明顯低于癌旁組織（93.7%，133/142，χ2=150.139，P＜0.05），Ki-67陽性表達(dá)率（54.9%，78/142）明顯高于癌旁組織（17.6%，25/142，χ2=42.791，P＜0.05）。見圖1。

2.2 乳腺癌組織中QKI-7表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

結(jié)果顯示，腫瘤組織中QKI-7表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及孕激素受體相關(guān)（P均＜0.05），QKI-7陽性率越低，腫瘤直徑越大，腫瘤越趨于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越高；而與患者年齡、組織學(xué)類型、雌激素受體和HER2受體情況等無明顯相關(guān)性（P均＞0.05）。見表1。

2.3 乳腺癌組織中QKI-7的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

將142例乳腺癌患者按QKI-7表達(dá)分為陰、陽性兩組，Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，QKI-7陽性患者累積生存率（87.80%）明顯高于QKI-7陰性患者（61.39%，Log-Rank檢驗(yàn)，P=0.001 8）。見圖2。

圖1 乳腺癌組織和癌旁組織中QKI-7、P53和K i-67的表達(dá)（免疫組化染色×200）

表1 乳腺癌組織中QKI-7表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 n（%）

2.4 乳腺癌組織中QKI-7表達(dá)與P53及Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

相關(guān)分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中QKI-7表達(dá)與P53表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.579，P＜0.05），而與Ki-67表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.329，P＜0.05）。見表2。

圖2 不同QKI-7表達(dá)患者的Kaplan-Meier生存曲線

表2 Spearman檢驗(yàn)分析QKI-7與P53及Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

以往有研究顯示QKI在多種實(shí)體惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，其通過抑制腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑癌基因的作用［8，13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，QKI-7表達(dá)在乳腺癌組織中顯著下調(diào)，且隨腫瘤直徑增大、TNM分期升高而表達(dá)降低；此外，QKI-7在轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中較無轉(zhuǎn)移乳腺癌組織表達(dá)更低，由此表明，QKI-7低表達(dá)在乳腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的過程中可能發(fā)揮負(fù)面作用。孕激素受體是配體激活的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，與配體結(jié)合后移位至胞核同DNA結(jié)合，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖和分化［14］。QKI-7與孕激素受體呈負(fù)相關(guān)，推測QKI-7異常低表達(dá)時(shí)孕激素受體促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞過度增殖。以往研究報(bào)道，胃癌中QKI低表達(dá)與患者不良預(yù)后有關(guān)［9］，結(jié)直腸癌中QKI異常低表達(dá)促進(jìn)患者術(shù)后的復(fù)發(fā)，同時(shí)也是患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［6］。本實(shí)驗(yàn)生存分析發(fā)現(xiàn)，QKI-7陽性表達(dá)患者總生存率顯著高于QKI-7陰性表達(dá)者，說明QKI-7可以作為乳腺癌患者的不良預(yù)后標(biāo)志物。

Ki-67是衡量細(xì)胞增殖活性的生物學(xué)標(biāo)志物，Ki-67高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后較差［15］。P53是最早發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，同時(shí)也是腫瘤中最常發(fā)生突變的基因，在約50%的惡性腫瘤中發(fā)生突變［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，P53在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著降低，可能在乳腺癌的發(fā)生過程中發(fā)揮負(fù)面作用；而Ki-67在乳腺癌中的表達(dá)顯著升高，其可能促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中QKI-7陽性表達(dá)與細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67陽性表達(dá)呈弱負(fù)相關(guān)，而與P53陽性表達(dá)呈中等正相關(guān)，提示QKI-7更可能與P53共同參與乳腺癌的進(jìn)展，兩者在乳腺癌發(fā)展過程中可能起協(xié)同作用，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，QKI-7在乳腺癌組織中低表達(dá)，且其可能與腫瘤增殖、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，提示QKI-7參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展；生存分析結(jié)果表明，QKI-7低表達(dá)與患者的不良預(yù)后有關(guān)，由此表明，QKI-7可作為乳腺癌患者潛在的預(yù)后標(biāo)志物。今后需要在體外細(xì)胞層面和體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證QKI-7與乳腺癌惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系，探討QKI-7參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。