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    顫抖蛋白異構(gòu)體7在乳腺癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系

    2019-08-14 07:15:42徐振雷王慶偉
    關(guān)鍵詞:組織化學(xué)結(jié)果顯示陽性細(xì)胞

    徐振雷,王慶偉

    (南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院1.燒傷整形科,2.檢驗(yàn)科,江蘇淮安223001)

    qkI基因編碼一組RNA結(jié)合蛋白的剪接異構(gòu)體,主要調(diào)控細(xì)胞分化[1-2]。在神經(jīng)祖細(xì)胞、肌細(xì)胞和單核細(xì)胞中,顫抖蛋白(Quaking,QKI)異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的分化缺陷[3-4]。qkI基因編碼3個(gè)主要的RNA結(jié)合蛋白,QKI-5,-6和-7,其C末端30個(gè)氨基酸不同;QKI-5 C端含有核定位序列,主要定位于細(xì)胞核中,QKI-6分布在整個(gè)細(xì)胞中并與QKI-5形成異源二聚體,QKI-7主要定位于細(xì)胞質(zhì)中[5]。QKI可作為預(yù)測結(jié)腸癌、肺癌、口腔癌和胃癌預(yù)后的生物標(biāo)志物[6-9],QKI-5通過Ras-MAPK信號通路抑制腎透明細(xì)胞癌的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[10],也可以預(yù)測前列腺癌患者的預(yù)后[11]。但是,QKI-7在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚不清楚。本研究擬觀察QKI-7在乳腺癌組織中的表達(dá),并分析其與患者預(yù)后之間的相關(guān)性。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料與試劑

    組織芯片購于上海芯超生物有限公司,共142例原發(fā)性乳腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織(距離腫瘤邊緣>5.0 cm)。所有患者臨床病理資料和隨訪資料均完整,均為女性,年齡29~83歲,平均53.3歲;腫瘤直徑為0.5~15.0 cm,平均3.5 cm;其中,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移90例;組織學(xué)類型:浸潤性導(dǎo)管癌134例,浸潤性導(dǎo)管癌伴浸潤性小葉癌7例,篩孔癌1例;根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期12例,Ⅱ期83例,Ⅲ期47例。手術(shù)前均未經(jīng)過放射治療、化學(xué)治療和靶向藥物治療,無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;患者接受乳腺癌保乳手術(shù)或乳腺癌根治手術(shù),手術(shù)時(shí)間為2001年1月至2004年8月,隨訪時(shí)間截止到2013年7月,隨訪9~13年。

    小鼠抗人單克隆抗體QKI-7(上海文淵閣生物科技有限公司);小鼠抗人P53和Ki-67抗體(美國Sigma公司);兔抗小鼠二抗購于上海威奧生物科技有限公司;通用型免疫組化檢測試劑盒購于吉泰生物有限公司。

    1.2 免疫組織化學(xué)檢測QKI-7、P53和Ki-67的表達(dá)

    采用SP免疫組織化學(xué)染色法,將組織芯片在80℃微波中加熱20 min;二甲苯浸泡脫蠟15 min;50%、70%、80%、95%梯度乙醇水化各2 min;PBS沖洗3次,每次5 min;3%過氧化氫固定10 min;置于95℃0.01mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)中煮沸15 min,行抗原修復(fù);滴加正常山羊血清室溫封閉20min;滴加小鼠抗人QKI-7(1∶2 000)、P53(1∶1 000)、Ki-67(1∶1 000),4℃孵育過夜;滴加兔抗小鼠二抗(1∶1 000)室溫孵育 2 h;PBS洗 3次,每次 5 min;DAB顯色,脫水、透明、封片、鏡檢;用PBS代替一抗作為陰性對照,用已知陽性片作為陽性對照。

    1.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

    將組織芯片置于光鏡下觀察和評分,結(jié)果判斷綜合考慮低倍鏡下陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和高倍鏡下陽性細(xì)胞所占比例。染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比評分標(biāo)準(zhǔn):基本不著色為0分,淡黃色1分,棕黃色2分,黃褐色3分。組織芯片置于顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<10%為0分;10%~40%為1分;40%~70%為2分;≥70%為3分。兩者相加,0~2分為陰性;3~6分為陽性[12]。由2位有資質(zhì)的病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判讀,陰陽性判斷不一致時(shí),以第三位病理科醫(yī)師的判讀結(jié)果為準(zhǔn)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,QKI-7、P53及Ki-67在乳腺癌和癌旁組織中的陽性率比較采用χ2檢驗(yàn),QKI-7與P53和Ki-67表達(dá)相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析,乳腺癌組織中QKI-7的陽性率與各臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用Pearson、Fisher精確檢驗(yàn)和似然比檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)評估總生存期,組間生存時(shí)間的比較采用Log-Rank法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 QKI-7在乳腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)比較

    免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,QKI-7主要位于細(xì)胞質(zhì)中,P53和Ki-67主要位于細(xì)胞核。乳腺癌組織中QKI-7陽性表達(dá)率(28.2%,40/142)明顯低于癌旁組織(78.9%,112/142,χ2=73.378,P<0.05)。此外,乳腺癌組織中P53陽性表達(dá)率(21.8%,31/142)明顯低于癌旁組織(93.7%,133/142,χ2=150.139,P<0.05),Ki-67陽性表達(dá)率(54.9%,78/142)明顯高于癌旁組織(17.6%,25/142,χ2=42.791,P<0.05)。見圖1。

    2.2 乳腺癌組織中QKI-7表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

    結(jié)果顯示,腫瘤組織中QKI-7表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及孕激素受體相關(guān)(P均<0.05),QKI-7陽性率越低,腫瘤直徑越大,腫瘤越趨于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越高;而與患者年齡、組織學(xué)類型、雌激素受體和HER2受體情況等無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。見表1。

    2.3 乳腺癌組織中QKI-7的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

    將142例乳腺癌患者按QKI-7表達(dá)分為陰、陽性兩組,Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示,QKI-7陽性患者累積生存率(87.80%)明顯高于QKI-7陰性患者(61.39%,Log-Rank檢驗(yàn),P=0.001 8)。見圖2。

    圖1 乳腺癌組織和癌旁組織中QKI-7、P53和K i-67的表達(dá)(免疫組化染色×200)

    表1 乳腺癌組織中QKI-7表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 n(%)

    2.4 乳腺癌組織中QKI-7表達(dá)與P53及Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

    相關(guān)分析結(jié)果顯示,乳腺癌組織中QKI-7表達(dá)與P53表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.579,P<0.05),而與Ki-67表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.329,P<0.05)。見表2。

    圖2 不同QKI-7表達(dá)患者的Kaplan-Meier生存曲線

    表2 Spearman檢驗(yàn)分析QKI-7與P53及Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

    3 討論

    以往有研究顯示QKI在多種實(shí)體惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào),其通過抑制腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑癌基因的作用[8,13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,QKI-7表達(dá)在乳腺癌組織中顯著下調(diào),且隨腫瘤直徑增大、TNM分期升高而表達(dá)降低;此外,QKI-7在轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中較無轉(zhuǎn)移乳腺癌組織表達(dá)更低,由此表明,QKI-7低表達(dá)在乳腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的過程中可能發(fā)揮負(fù)面作用。孕激素受體是配體激活的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,與配體結(jié)合后移位至胞核同DNA結(jié)合,促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖和分化[14]。QKI-7與孕激素受體呈負(fù)相關(guān),推測QKI-7異常低表達(dá)時(shí)孕激素受體促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞過度增殖。以往研究報(bào)道,胃癌中QKI低表達(dá)與患者不良預(yù)后有關(guān)[9],結(jié)直腸癌中QKI異常低表達(dá)促進(jìn)患者術(shù)后的復(fù)發(fā),同時(shí)也是患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]。本實(shí)驗(yàn)生存分析發(fā)現(xiàn),QKI-7陽性表達(dá)患者總生存率顯著高于QKI-7陰性表達(dá)者,說明QKI-7可以作為乳腺癌患者的不良預(yù)后標(biāo)志物。

    Ki-67是衡量細(xì)胞增殖活性的生物學(xué)標(biāo)志物,Ki-67高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后較差[15]。P53是最早發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一,同時(shí)也是腫瘤中最常發(fā)生突變的基因,在約50%的惡性腫瘤中發(fā)生突變[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,P53在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著降低,可能在乳腺癌的發(fā)生過程中發(fā)揮負(fù)面作用;而Ki-67在乳腺癌中的表達(dá)顯著升高,其可能促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),乳腺癌組織中QKI-7陽性表達(dá)與細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67陽性表達(dá)呈弱負(fù)相關(guān),而與P53陽性表達(dá)呈中等正相關(guān),提示QKI-7更可能與P53共同參與乳腺癌的進(jìn)展,兩者在乳腺癌發(fā)展過程中可能起協(xié)同作用,但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

    綜上所述,QKI-7在乳腺癌組織中低表達(dá),且其可能與腫瘤增殖、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān),提示QKI-7參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展;生存分析結(jié)果表明,QKI-7低表達(dá)與患者的不良預(yù)后有關(guān),由此表明,QKI-7可作為乳腺癌患者潛在的預(yù)后標(biāo)志物。今后需要在體外細(xì)胞層面和體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證QKI-7與乳腺癌惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系,探討QKI-7參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

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