HA納米顆粒對HepG2細(xì)胞冷凍干燥效果的影響

袁 俊， 李維杰， 劉寶林， 周新麗， 宋 萍

（上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海 200093）

近年來，隨著細(xì)胞移植、組織工程和遺傳技術(shù)的發(fā)展，活細(xì)胞正成為臨床醫(yī)療中重要的治療手段[1-2]，如何實現(xiàn)細(xì)胞的長期保存成為當(dāng)下的熱門話題。細(xì)胞經(jīng)冷凍干燥后可在常溫下長期保存，受周圍環(huán)境的影響較小，且在運輸過程中不需要特殊的儲藏設(shè)備。因此，將細(xì)胞凍干保存成為一種新的保存方法，這種方法也得到了各國研究人員的關(guān)注。

當(dāng)材料達到納米尺寸時，其物理化學(xué)性質(zhì)相較于宏觀物質(zhì)具有很大的不同。將納米顆粒添加到冷凍保護劑中，提高細(xì)胞存活率，這方面的研究已取得一些成果。納米顆粒作為一種新型材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域已被廣泛使用，并因其具有一些特殊的性質(zhì)，在低溫生物領(lǐng)域被大量研究。根據(jù)納米顆粒的小尺寸效應(yīng)，顆粒尺寸越小，表面能越大，其強大的表面能會與溶液物質(zhì)相互作用，從而影響溶液的穩(wěn)定性及溶質(zhì)的分散性，間接地影響溶液的黏度[3]和導(dǎo)熱效果。根據(jù)納米顆粒對溶液性質(zhì)的影響，唐臨利等[4]將SiO2納米顆粒加入到丙三醇溶液中，發(fā)現(xiàn)隨著溶液中納米顆粒濃度的增加，丙三醇溶液的導(dǎo)熱系數(shù)也隨之提高。另外，降溫過程中納米顆粒具有輔助成核、降低過冷、改變玻璃化和反玻璃化溫度等性質(zhì)。Han等[5]通過DSC來研究不同納米顆粒對多元醇的過冷度及反玻璃化溫度的影響，發(fā)現(xiàn)溶液中添加納米顆粒后，溶液成核時的過冷度顯著降低，且在溶液的復(fù)溫過程中反玻璃化溫度也有所下降。他們的結(jié)論與高志新等[6]的研究結(jié)果相似，在PVP低溫保護劑中添加HA納米顆粒后，溶液的玻璃化溫度和反玻璃化溫度都隨著納米顆粒濃度的增加而降低。根據(jù)以上研究結(jié)果顯示，納米顆粒在生物樣本的低溫保存中能夠起到積極的作用。李維杰等[7]將不同濃度、不同粒徑的HA納米顆粒添加到冷凍保護劑中，探索低溫保存對豬卵母細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為0.5 g/L的60 nm的HA納米顆?？梢詼p少復(fù)溫過程中的再結(jié)晶，提高豬卵母細(xì)胞的低溫保存效果。

凍干過程比低溫保存更加復(fù)雜，需要經(jīng)歷冷凍、升華干燥和復(fù)水3個過程，其中每個過程都會對細(xì)胞的存活率造成影響。目前，凍干保護劑對細(xì)胞的作用機理主要有兩種：“玻璃態(tài)”假說[8]和“水替代”假說[9]。這兩種假說的作用基礎(chǔ)是溶液實現(xiàn)部分或完全玻璃化。納米顆粒可以提高溶液黏度[3]，納米凍干保護劑有可能增強溶液的玻璃化程度，從而提高冷凍干燥過程中細(xì)胞的存活率。另外，界面層效應(yīng)可以顯著增強納米流體的有效熱導(dǎo)率[10]，縮短溶液的相變時間，減輕冷凍和干燥過程對細(xì)胞的傷害。本文嘗試將HA納米顆粒添加到凍干保護劑中，研究在靜置、冷凍、干燥和復(fù)水各個階段納米凍干保護劑對HepG2細(xì)胞回收率、存活率和24 h貼壁率的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗設(shè)備與材料

1.1.1 主要儀器和設(shè)備

真空冷凍干燥機，Advantage 2.0 Benchtop Freeze Dryer（美國SP Industries公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（日本松下MCO 18AC）；低速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；低溫臺（BCS196 Biological Cyro-stage）；BX51TRF 顯微鏡（Olympus，日本）。

1.1.2 主要材料與試劑

實驗材料：人肝癌細(xì)胞HepG2（購于中科院）

主要試劑：胎牛血清（FBS）（上海博升生物科技有限公司）；胰蛋白酶（上海勵瑞生物科技有限公 司 ） ； Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素（雙抗）、D-hank’s（上海靳弘生物科技有限公司）；臺盼藍染色液（2X）（碧云天生物技術(shù)公司）；等滲磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、海藻糖、丙三醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；羥基磷灰石（HA）納米顆粒（南京埃普瑞納米材料有限公司）

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 HepG2細(xì)胞的收集

取7個長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，用移液槍吸掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加2 mL的D-hank’s清洗液清洗2遍，再在培養(yǎng)瓶中加入1 mL的胰蛋白酶消化3 min左右，放在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)光亮的圓粒狀且在溶液中漂浮時，加入2 mL的培養(yǎng)基終止消化，用移液槍吹打培養(yǎng)瓶上的細(xì)胞，并將所有的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到離心管中離心（轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，離心4 min），倒掉上清液，收集細(xì)胞備用。

1.2.2 納米凍干保護劑的配置

通過前期對HepG2細(xì)胞凍干實驗的探索，選用胎牛血清（FBS）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、海藻糖和丙三醇作為凍干保護劑的主要成分，其中保護劑中含體積分?jǐn)?shù)為15%的FBS，體積分?jǐn)?shù)為10%的丙三醇，質(zhì)量濃度為400 g/L的PVP，質(zhì)量濃度為200 g/L的海藻糖，其余為DMEM培養(yǎng)液。稱取一定質(zhì)量的HA納米顆粒于配置好的保護劑中，攪拌均勻，最終使得保護劑中納米顆粒的質(zhì)量濃度分別為 0，0.1，0.3，0.5，0.7，1，5 g/L。

1.2.3 凍干懸浮液的配置

在收集的細(xì)胞中加入一定量的DMEM培養(yǎng)基，吹打1 min，使細(xì)胞在培養(yǎng)基中均勻分散，每組按照1∶4的比例，吸取0.2 mL細(xì)胞懸液于0.8 mL的納米低溫保護劑中，混合均勻，轉(zhuǎn)移到5 mL的西林瓶中準(zhǔn)備凍干。

1.2.4 納米顆粒對細(xì)胞的毒性實驗

為了驗證HA納米顆粒對HepG2細(xì)胞活性的影響，進行了以下的毒理實驗：在7組含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加不同濃度的HA納米顆粒并培養(yǎng)24 h，然后對細(xì)胞的貼壁率進行檢測。

1.2.5 納米凍干保護劑對細(xì)胞活性實驗

保護劑在一定程度上都會對細(xì)胞產(chǎn)生影響，在細(xì)胞進行冷凍之前必須先研究納米凍干保護劑對細(xì)胞的損傷情況。將不同質(zhì)量濃度的納米凍干保護劑與細(xì)胞液均勻混合后靜置1 h，然后測其回收率、存活率和24 h貼壁率。

1.2.6 HepG2細(xì)胞的冷凍實驗

降溫階段納米顆粒會對冰晶形成產(chǎn)生影響，將不同質(zhì)量濃度的納米凍干保護劑與細(xì)胞的混合液置于-80 ℃的冰箱中4 h，然后取出，再在37 ℃的水浴鍋中快速復(fù)溫，測其回收率、存活率和24 h貼壁率。

1.2.7 HepG2細(xì)胞的凍干流程

樣品凍結(jié)時，隔板溫度設(shè)置為-70 ℃，停留4 h；一次干燥溫度設(shè)置為-45 ℃，持續(xù)24 h，壓力為5 Pa；二次干燥溫度設(shè)置為20 ℃，持續(xù)時間10 h，壓力為5 Pa。

1.2.8 納米顆粒復(fù)水液復(fù)水凍干細(xì)胞

細(xì)胞與無納米顆粒的凍干保護劑混合均勻后分成相同的7組于凍干機中凍干，將2 mL含不同質(zhì)量濃度的納米顆粒等滲磷酸鹽緩沖溶液（PBS）加入到凍干的樣品中，在37℃的水浴鍋內(nèi)輕輕晃動，直至凍干樣品全部溶解。

1.2.9 凍干細(xì)胞回收率的檢測

凍干細(xì)胞復(fù)水后使用血球計數(shù)板計算細(xì)胞數(shù)，凍干細(xì)胞回收率按式（1）計算：

1.2.10 凍干細(xì)胞存活率的檢測

取10 μL復(fù)水后的細(xì)胞液與10 μL的臺盼藍混合均勻，滴在血球計數(shù)板上，在顯微鏡上分別對活細(xì)胞和死細(xì)胞計數(shù)，活細(xì)胞無色透明，死細(xì)胞會被染成藍色，細(xì)胞的存活率按式（2）計算：

1.2.11 貼壁率的檢測

將復(fù)水后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中離心（轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，離心4 min），倒掉上清液，加入4 mL的DMEM培養(yǎng)基吹打均勻，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后，收集培養(yǎng)基和D-hank’s清洗液于離心管中，并對液體中的細(xì)胞計數(shù)，為未貼壁細(xì)胞。接著在培養(yǎng)皿中加入0.5 mL左右的胰蛋白酶消化，加入2 mL的DMEM培養(yǎng)基，吹打均勻并對溶液中的細(xì)胞計數(shù)，為貼壁細(xì)胞。細(xì)胞的貼壁率按式（3）計算：

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)過程中HA納米顆粒對細(xì)胞24 h貼壁率的影響

將不同質(zhì)量濃度的納米顆粒同細(xì)胞一起培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，隨著納米顆粒質(zhì)量濃度的增加，貼壁率逐漸下降，當(dāng)質(zhì)量濃度低于0.5 g/L時，納米顆粒對細(xì)胞的影響較小。當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.5 g/L時，細(xì)胞的貼壁率顯著下降，其結(jié)果如圖1所示（柱狀圖中各組之間含有不同字母，則說明相互具有顯著性差異（P＜0.05）；如果含有相同字母，則相互沒有顯著性差異（P＞0.05））。高質(zhì)量濃度的納米顆粒會影響細(xì)胞的生長和傳代，這是由于顆粒的小體積效應(yīng)能夠吸附培養(yǎng)基中的化學(xué)成分，影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成和pH，從而阻礙細(xì)胞的正常生長。納米顆粒進入細(xì)胞內(nèi)部時會與細(xì)胞器、染色體等相結(jié)合，影響細(xì)胞的發(fā)育[11]，而且大量的納米顆粒會嵌入細(xì)胞膜內(nèi)，從而改變膜的結(jié)構(gòu)和生理功能[12]，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

圖 1 含不同質(zhì)量濃度納米顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后其貼壁率Fig.1 Adherence rate of cells with different mass concentrations of nanoparticles after 24 h culture

2.2 冷凍之前納米顆粒對細(xì)胞的影響

細(xì)胞置于納米凍干保護劑中1 h后細(xì)胞的活性發(fā)生很大變化，細(xì)胞的回收率（81.3%）和存活率（85.63%）都有所降低，將回收后的細(xì)胞進行24 h培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的貼壁率（71.06%）顯著下降，正如圖2顯示。當(dāng)保護劑與細(xì)胞液混合后，由于高濃度保護劑滲透壓較大，使得細(xì)胞嚴(yán)重脫水，造成細(xì)胞膜的損傷和細(xì)胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)的變性，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[13]。當(dāng)凍干保護劑中納米顆粒的質(zhì)量濃度低于0.5 g/L時，各組之間的回收率和24 h貼壁率都沒有顯著性差異。但隨著保護劑中納米顆粒質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞的回收率、存活率和24 h貼壁率都顯著下降，其中可能的原因為：a. 納米顆粒具有殺死細(xì)胞的作用，保護劑中納米顆粒的濃度越高，細(xì)胞表面吸附的納米顆粒也越多，在一定程度上改變或破環(huán)細(xì)胞膜原有的結(jié)構(gòu)，使得細(xì)胞不能進行正常的生理代謝，從而造成細(xì)胞的死亡；b. 由于納米顆粒具有較強的表面活性，當(dāng)納米顆粒黏附在細(xì)胞膜表面時，可能發(fā)生強的氧化作用，改變組成細(xì)胞膜的脂質(zhì)分子[14]和蛋白質(zhì)[15]，對細(xì)胞活性造成損傷。

2.3 冷凍過程中納米顆粒對細(xì)胞的影響

圖 2 細(xì)胞在含有不同質(zhì)量濃度納米凍干保護劑中1 h后其回收率、存活率和24 h貼壁率Fig. 2 Recovery rate, survival rate and 24 h adherence rate of cells after 1 h in protective agent containing different mass concentrations of nanoparticles

將細(xì)胞與納米凍干保護劑均勻混合，于-80℃冰箱中冷凍4 h，然后取出在37 ℃的環(huán)境下復(fù)溫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著保護劑中納米顆粒濃度的增加，細(xì)胞的回收率和存活率都有所提高，當(dāng)納米顆粒質(zhì)量濃度為0.5 g/L時，細(xì)胞的回收率（70.13%）和存活率（72.37%）達到最大值，與其他組之間都有顯著性差異。由圖3顯示，隨著濃度的繼續(xù)增加，細(xì)胞的回收率和存活率都顯著下降。在降溫過程中，保護劑中的納米顆粒具有輔助成核的作用，能夠促進冰晶的形成，降低過冷度，防止胞內(nèi)冰的形成，減小冰晶對細(xì)胞的物理損傷[16]。凍干保護劑中的海藻糖、甘油、PVP等物質(zhì)能夠增加其黏度，在降溫階段實現(xiàn)部分玻璃化，但不能完全避免冰晶的形成，冰晶損傷仍然是造成細(xì)胞死亡的主要原因[17]。

圖 3 將細(xì)胞與納米凍干保護劑的混合液于-80 ℃冰箱中4 h后其回收率、存活率和24 h貼壁率Fig.3 Recovery rate, survival rate and 24 h adherence rate of the mixture of cells and nanoprotectants in a refrigerator at -80 °C for 4 h

納米顆粒的質(zhì)量濃度較低時，其輔助成核的效果不明顯，對細(xì)胞存活率沒有顯著影響。納米顆粒質(zhì)量濃度較高時，因其具有較強的表面能，在溶液中難分散且容易以團聚的形式存在[18]，在降溫過程中雖然能夠避免胞內(nèi)冰的形成，但會形成較大的胞外冰而使溶液離子濃度升高，對細(xì)胞造成滲透損傷。另外，納米顆粒本身對細(xì)胞就有很大的毒性，在細(xì)胞的冷凍之前，保護劑中大量的納米顆粒已經(jīng)對細(xì)胞活性產(chǎn)生了損傷，從而導(dǎo)致存活率的下降。

2.4 凍干過程中納米顆粒對細(xì)胞的影響

凍干過程中，細(xì)胞水分的去除會破環(huán)大分子物質(zhì)周圍的水膜，使物質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變化，如蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，會造成大分子物質(zhì)的變性而使細(xì)胞死亡[19]，所以相較于圖3的結(jié)果，凍干后細(xì)胞的回收率、存活率和24 h貼壁率都大幅度下降。

凍干后細(xì)胞的回收率和存活率隨著保護劑中納米顆粒質(zhì)量濃度的增加而提高，當(dāng)納米顆粒質(zhì)量濃度為0.5 g/L時，回收率（37.39%）和存活率（62.02%）都是所有組中最高的，與其他各組之間有顯著性差異。繼續(xù)增加納米顆粒質(zhì)量濃度，回收率和存活率卻逐漸下降，如圖4所示。其保護細(xì)胞的機理為以下3點：a. HA納米顆粒的強表面能能夠?qū)⒅車乃肿游皆谥車绊懭芤盒再|(zhì)，提高溶液的黏度并減緩冰晶的生長，因而加強溶液玻璃化的趨勢[20]；b. HA納米顆粒與水分子之間有較強的氫鍵作用[21]，減少了溶液中自由水的份額，這時細(xì)胞完全被一層保護劑溶液包圍，這有利于在干燥時維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整，充分達到保護細(xì)胞的效果；c. 在升華干燥中，納米顆粒能夠替代去除的水分而維持細(xì)胞原有結(jié)構(gòu)的不變，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)和細(xì)胞膜的正常功能，避免脫水而導(dǎo)致細(xì)胞的損傷。凍干后細(xì)胞的24 h貼壁率都較低，在凍干過程中雖然沒有對細(xì)胞造成直接的損傷，但是隨著細(xì)胞中結(jié)合水的去除，物質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變會引起細(xì)胞原有性質(zhì)的不同和一些功能的喪失，導(dǎo)致細(xì)胞無法正常生長而死亡。

圖 4 含不同質(zhì)量濃度納米顆粒的保護劑與細(xì)胞混合凍干后其回收率、存活率和24 h貼壁率Fig.4 Recovery rate, survival rate and 24 h adherence rate of cells after lyophilization with different mass concentrations of nanoparticles

2.5 復(fù)水過程中納米顆粒對細(xì)胞的影響

當(dāng)固體物質(zhì)溶于液體時會放出熱量，所以在復(fù)水過程中，當(dāng)凍干細(xì)胞溶于復(fù)水液時會產(chǎn)生強烈的復(fù)水熱，導(dǎo)致細(xì)胞的解體死亡。

如果要檢測凍干細(xì)胞的活性，必須將細(xì)胞進行復(fù)水。為了研究納米顆粒在復(fù)水過程中是否會對細(xì)胞的活性產(chǎn)生影響，使用不同質(zhì)量濃度的納米顆粒復(fù)水液復(fù)水凍干后的細(xì)胞（凍干細(xì)胞為同一批次，且細(xì)胞凍干時保護劑中均無納米顆粒），質(zhì)量濃度低于0.5 g/L時各組之間的回收率和存活率都沒有顯著性差異，這說明納米顆粒的加入不能在復(fù)水環(huán)節(jié)提高細(xì)胞存活率，其真正起作用是在冷凍和干燥階段。當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.5 g/L時，回收率和存活率都有所下降，其結(jié)果如圖5所示。納米顆粒質(zhì)量濃度的增加提高了溶液的導(dǎo)熱系數(shù)，使得溶液中物質(zhì)之間的傳熱加快，產(chǎn)生的復(fù)水熱對細(xì)胞造成更大的損傷。結(jié)果表明，添加過多的納米顆粒不僅對細(xì)胞本身造成直接的損傷，也會間接地改變?nèi)芤夯蚱渌镔|(zhì)的性質(zhì)而傷害細(xì)胞。

圖 5 含不同質(zhì)量濃度納米顆粒的復(fù)水液復(fù)水凍干細(xì)胞后其回收率、存活率和24 h貼壁率Fig.5 Recovery rate, survival rate and 24 h adherence rate of cells in rehydration solutions with different mass concentrations of nanoparticles

3 結(jié) 論

在凍干保護劑中添加適當(dāng)質(zhì)量濃度的HA納米顆粒有助于提高凍干后HepG2細(xì)胞的回收率和存活率，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 g/L時保護效果最好，復(fù)水后細(xì)胞的回收率為37.39%，存活率為62.02%，與各組之間都具有顯著差異。當(dāng)保護劑中納米顆粒質(zhì)量濃度高于0.5 g/L時，納米顆粒對細(xì)胞具有很強的毒性，使得回收率和存活率顯著下降。適當(dāng)質(zhì)量濃度的HA納米顆粒對HepG2細(xì)胞的冷凍干燥的確起到了一定的作用，其機理為在冷凍階段能夠降低過冷，輔助成核，減小冰晶對細(xì)胞的損傷；在干燥階段有助于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，避免脫水而導(dǎo)致細(xì)胞膜的破環(huán)，而對于復(fù)水過程不起作用。以上研究對納米顆粒應(yīng)用于生物材料的凍干保存提供了一些新的思路和方法，但更深層次的機理還需進一步的探索。