飼料磷真消化率不同的山羊空腸菌群結(jié)構(gòu)差異研究

金 磊，王立志，王之盛，薛 白，彭全輝

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，四川 成都 611130)

磷是動(dòng)物體內(nèi)一種重要的常量礦物元素[1-3]，飼料中未被動(dòng)物胃腸道消化吸收的磷，通過(guò)糞便排放到體外后，會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[4-5]。因此，提高動(dòng)物對(duì)磷的消化利用效率對(duì)于降低動(dòng)物養(yǎng)殖成本和減少環(huán)境污染均具有極其重要的意義。反芻動(dòng)物飼料中的磷主要在小腸中進(jìn)行消化吸收[6-7]，小腸微生物可能是影響其對(duì)飼料磷消化吸收的一個(gè)重要因素[8-10]。已有關(guān)于山羊胃腸道微生物多樣性的報(bào)道[11-12]，但磷消化率不同的山羊小腸微生物的結(jié)構(gòu)與組成是否具有差異仍未知。明晰飼料中磷消化率是否受到小腸微生物多樣性的影響，將有助于提高飼料磷利用率相關(guān)技術(shù)的研發(fā)。另外，由于消化道內(nèi)源磷的存在，采用表觀消化率并不能準(zhǔn)確衡量動(dòng)物對(duì)磷的消化吸收情況[13-14]。與表觀消化率相比，真消化率才能真實(shí)且準(zhǔn)確地反映出宿主對(duì)磷的生物學(xué)利用效率[15-17]。本研究采用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)比較飼料磷真消化率不同的山羊空腸微生物組成的差異性，旨在促進(jìn)人們更清晰地認(rèn)識(shí)空腸微生物與宿主飼料磷真消化率之間的關(guān)系，增進(jìn)對(duì)空腸微生物與宿主磷消化利用關(guān)系的理解。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選取24只10月齡，雌性，平均體質(zhì)量(24.25±2.47)kg的努比亞黑山羊，試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，整個(gè)試驗(yàn)期試羊單籠飼養(yǎng)，每日飼料(干物質(zhì))按體質(zhì)量3.5%供給，自由飲水。參照我國(guó)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)，以每天每頭增重0.1 kg為標(biāo)準(zhǔn)配制日糧，日糧配方和營(yíng)養(yǎng)水平詳見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

整個(gè)試驗(yàn)由2期(Ⅰ期和Ⅱ期)構(gòu)成，每期包括14 d預(yù)飼期和6 d代謝試驗(yàn)期，共40 d。代謝試驗(yàn)期內(nèi)，每天記錄每只山羊的飼料供給量和殘留量，并采集當(dāng)天飼喂的飼料及剩料樣品，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用全收糞法收集代謝試驗(yàn)期內(nèi)山羊糞便，取糞總量的10%，用10%鹽酸固氮后于-20 ℃貯存?zhèn)溆?。Ⅰ期和Ⅱ期分別飼喂對(duì)應(yīng)日糧，試驗(yàn)第41天晨飼前，屠宰所有山羊，迅速分割出空腸并進(jìn)行結(jié)扎，以防止相鄰腸斷的內(nèi)容物流入空腸。無(wú)菌采集空腸內(nèi)容物樣品于凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

Table 1 The composition and nutrient level of the diet (dry matter basis) %

1) 預(yù)混料是由同一類的多種添加劑或不同類的多種添加劑按一定配比制作而成的勻質(zhì)混和物，預(yù)混料為每kg日糧提供：Fe(FeSO4)30 mg，Cu(CuSO4)10 mg，Zn(ZnSO4)50 mg，Mn(MnSO4)60 mg，VA2 937 IU，VD343 IU，VE30 IU； 2) 營(yíng)養(yǎng)水平是指日糧中營(yíng)養(yǎng)成分的含量，代謝能為計(jì)算值，其余為實(shí)測(cè)值。

1) Premix was a homogeneous mixture made from a variety of additives of the same class or a variety of additives of different kinds according to a certain proportion，premix provided the following per kg of the diet: Fe(FeSO4)30 mg， Cu(CuSO4)10 mg， Zn(ZnSO4)50 mg， Mn(MnSO4)60 mg， VA2 937 IU， VD343 IU， VE30 IU; 2) Nutrient level referred to the content of nutrients in the diet， metabolic energy was a calculated value and others were measured values.

根據(jù)山羊飼料采食量，飼料和糞便樣品中的磷含量等數(shù)據(jù)，計(jì)算出24個(gè)山羊個(gè)體有機(jī)磷的真消化率：

磷真消化率(%)=[(Ⅱ期食入磷-Ⅰ期食入磷)-(Ⅱ期排泄磷-Ⅰ期排泄磷)]÷(Ⅱ期食入磷-Ⅰ期食入磷)×100%[18]。

統(tǒng)計(jì)24只山羊?qū)︼暳狭渍嫦实钠骄导皹?biāo)準(zhǔn)差，將磷真消化率大于(群體平均值+0.5倍標(biāo)準(zhǔn)差)的山羊作為高磷真消化率組(high true digestibility of phosphorus，HP)，磷真消化率小于(群體平均值-0.5倍標(biāo)準(zhǔn)差)的山羊作為低磷真消化率組(low true digestibility of phosphorus，LP)。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

提取HP組和LP組空腸內(nèi)容物微生物總DNA，DNA的提取和純化參照文獻(xiàn)[19]方法進(jìn)行[19]。用細(xì)菌通用引物對(duì)：515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′)，以空腸內(nèi)容物菌群總DNA為模板，針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V4區(qū)用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：5 U·μL-1Taq酶0.25 μL，10×Buffer 5.0 μL，10 mmol·L-1dNTPs 1.0 μL，10 μmol·L-1引物各1.25 μL，50 ng·μL-1DNA模板1.0 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30次；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用PCR純化試劑盒純化和回收?；厥盏腜CR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST fluorometer定量，送北京諾禾致源生物技術(shù)有限公司構(gòu)建文庫(kù)，利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

測(cè)序平臺(tái)得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控、拼接、Tags過(guò)濾和去除剔除嵌合體[20-23]后，使用Uclust[24]聚類算法將序列聚類為OTU(operational taxonomic units)，并使用RDF分類器[25]對(duì)OTU代表序列從門(mén)到屬進(jìn)行物種注釋。基于OTU table和rep_set. tree文件及抽樣的最大深度，繪制OTU稀釋曲線并計(jì)算α多樣性指數(shù)。結(jié)合各個(gè)樣品的OTU種類及其豐度進(jìn)行計(jì)算，獲得樣品間Unweighted unifrac距離矩陣，并利用加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，然后繪制PCoA聚類圖[26-27]。根據(jù)門(mén)和屬水平上物種的結(jié)構(gòu)和組成，用OriginPro 9.0和R x64 3.0.2軟件繪制優(yōu)勢(shì)菌門(mén)柱形圖和共享屬聚類熱圖。基于16s rRNA擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果，用PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)，通過(guò)比對(duì)KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes， http://www.genome.jpkegg)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)空腸微生物的基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，并挑選主要功能通路進(jìn)行組間差異性分析[28-29]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)LP組和HP組之間細(xì)菌的相對(duì)豐度進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，將P<0.05視為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。對(duì)組間差異顯著的微生物，用其相對(duì)豐度與宿主對(duì)飼料磷的真消化率進(jìn)行相關(guān)性(Spearman)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊有機(jī)磷真消化率

如圖1所示，24只山羊?qū)θ占Z有機(jī)磷真消化率的平均值為(78.61±7.65)%，變異系數(shù)為9.73%。HP和LP組各挑選6只山羊，飼料有機(jī)磷的真消化率平均值分別為(89.20±0.01)%和(68.95±0.05)%，HP組山羊飼料有機(jī)磷真消化率極顯著高于LP組(P<0.01)。

2.2 空腸內(nèi)容物16S rRNA基因的高通量測(cè)序和OUT統(tǒng)計(jì)

對(duì)12個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序，共獲得900 688條有效序列?；谙嗨菩源笥?7%的原則，將獲得的有效序列進(jìn)行聚類，共獲得5 611個(gè)OTU。其中HP組有3 830個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品含(2 313±179)個(gè)OTU；LP組有3 977個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品含(2 085±271)個(gè)OTU；兩組間共享的OTU有2 196個(gè)(圖2)。

圖1 磷真消化率Fig.1 True digestibility of phosphorus

各樣品稀釋曲線如圖3所示。在本試驗(yàn)的測(cè)序深度下，各條曲線最終均趨于平緩，說(shuō)明試驗(yàn)的測(cè)序量足以覆蓋各樣品的絕大多數(shù)微生物。

2.3 山羊空腸微生物的α多樣性分析

α多樣性指數(shù)主要用于評(píng)價(jià)樣品中微生物的豐富性和均勻性。表2列出了HP組和LP組樣品的Shannon、Chao1、Goods coverage和PD_whole_tree指數(shù)。在同一測(cè)序深度下，HP組的α多樣性指數(shù)均大于LP組，但僅Chao1指數(shù)在組間具有顯著差異(P<0.05)。

圖2 OTU維恩圖Fig.2 OTU venn diagram

圖3 各樣品的稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curves of each sample

2.4 山羊空腸微生物門(mén)水平和屬水平上的微生物組成

將所得有效序列在不同分類水平上進(jìn)行物種注釋和統(tǒng)計(jì)，將相對(duì)豐度大于0.1%的微生物視為優(yōu)勢(shì)菌群。HP和LP組均有8個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，2個(gè)組相對(duì)豐度排名前10的門(mén)均依次分別為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、黏膠球形菌門(mén)(Lentisphaerae)、螺旋體門(mén)(Spirochaetes)、軟壁菌門(mén)(Tenericutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、螺旋體菌門(mén)(Saccharibacteria)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)(圖4)。厚壁菌門(mén)(Firmicutes)在HP和LP組的相對(duì)豐度分別達(dá)到了59.75%和70.69%，處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。對(duì)HP和LP組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)進(jìn)行組間差異分析(表3)，HP組厚壁菌門(mén)(Firmicutes)的相對(duì)豐度極顯著低于LP組(P<0.01)，擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)極顯著高于LP組(P<0.01)。

在屬水平上，2個(gè)組相對(duì)豐度大于0.1%的微生物屬共有47個(gè)(圖5)。對(duì)HP和LP組的優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行組間差異性分析，其中有顯著性差異的菌屬如表3所示，HP組Prevotella、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Fibrobacter、Ruminococcus_2和Clostridium_sensu_stricto_1的相對(duì)豐度顯著高于LP組(P<0.05)，而Desulfovibrio和Victivallis的相對(duì)豐度顯著低于LP組(P<0.05)。

如表3所示，在門(mén)水平，宿主的磷真消化率與擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)的相對(duì)豐度極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與厚壁菌門(mén)(Firmicutes)的相對(duì)豐度極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。在屬水平，山羊磷真消化率與Prevotella、Fibrobacter和Victivallis的相對(duì)豐度顯著正相關(guān)(P<0.05)，與Desulfovibrio和Ruminococcus_2的相對(duì)豐度極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與Clostridium_sensu_stricto_1的相對(duì)豐度極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

表2 組間α多樣性指數(shù)的差異性比較

Table 2 Comparison of α diversity index between the two groups

組別GroupShannonChao1Goods coveragePD_whole_treeHP7.38±0.852170.24±202.840.99±0.01107.26±7.30LP6.60±1.521779.45±304.720.99±0.0193.31±15.13P值P value0.3020.0260.1610.07

圖4 門(mén)水平上的菌群組成Fig.4 Composition of microorganism at phylum level

圖5 共享菌群在屬水平上的聚類熱圖Fig.5 Log-scaled percentage heatmap of bacteria community structure at the shared-genus level

表3 HP和LP組在門(mén)和屬水平上差異的菌群及其與磷真消化率的相關(guān)性

Table 3 The difference between HP and LP groups at the level of portal and genera and their correlation with true phosphorus digestibility

分類單元Taxa相關(guān)豐度 Relative abundanceHPLPP值 P value相關(guān)系數(shù)rCorrelation coefficient門(mén)Phylum厚壁菌門(mén) Firmicutes59.753±4.76770.692±6.3270.007-0.813**擬桿菌門(mén) Bacteroidetes10.032±2.9165.704±1.4310.0080.718**屬GenusPrevotella5.341±2.6631.922±0.9110.0140.686*Rikenellaceae_RC9_gut_group 2.640±0.2961.580±0.2500.0010.401Fibrobacter0.825±0.2600.376±0.1730.0170.623*Desulfovibrio0.134±0.0190.358±0.0320.0030.845**Victivallis3.555±2.3330.724±0.1990.0040.695*Ruminococcus_23.393±0.2762.468±0.4310.0060.843**Clostridium_sensu_stricto_1 0.851±0.1195.083±0.5590.002-0.995**

**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)，*表示顯著相關(guān)(P<0.05)。

**Represented extremely significant correlation(P<0.01)， * Represented significant correlation(P<0.05).

2.5 PICRUSt基因預(yù)測(cè)

基于本試驗(yàn)16s rRNA擴(kuò)增子的測(cè)序結(jié)果，用PICRUSt對(duì)空腸微生物的基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，2個(gè)組共預(yù)測(cè)到了35個(gè)功能基因。圖6展示了相對(duì)豐度處于前20位的功能基因，這20種功能基因分別占HP組和LP組總基因豐度的93.49%和94.08%。圖6由下到上基因的相對(duì)豐度逐步降低，相對(duì)豐度最高的基因其功能依次為膜轉(zhuǎn)運(yùn)、碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素代謝、脂質(zhì)代謝等。這20種功能基因，其相對(duì)豐度在組間的差異均不顯著(P>0.05)。

3 討論

本試驗(yàn)采用限飼，磷的供給量低于肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，滿足采用差量法測(cè)定飼料磷真消化率的條件。本研究測(cè)定的山羊?qū)︼暳狭椎恼嫦势骄禐?8.61%，略高于單胃動(dòng)物豬[30]和雞[31]。分析原因，可能是由于反芻動(dòng)物胃腸道具有更豐富的胃腸道微生物，微生物可能會(huì)顯著影響宿主對(duì)飼料中磷的消化吸收。動(dòng)物對(duì)日糧中磷消化的影響因素主要包括日糧磷的來(lái)源、磷的水平、鈣磷比和日糧植酸的水平等[32-35]。一般日糧中磷含量越高，無(wú)機(jī)磷的含量越低，動(dòng)物對(duì)磷的消化利用效率越低[36]。但本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂相同飼糧且遺傳背景相同的山羊，飼料磷的真消化率也存在顯著的個(gè)體差異。

圖6 20種優(yōu)勢(shì)功能基因的相對(duì)豐度組成Fig.6 The composition of the relative abundance contributed by the top 20 genes

學(xué)者們普遍認(rèn)為小腸是磷消化吸收的主要場(chǎng)所，但有關(guān)宿主對(duì)飼料磷的消化吸收與小腸中微生物的相關(guān)性研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)探索宿主磷真消化率與空腸微生物組成關(guān)系，較全面地覆蓋了研究對(duì)象的空腸微生物，能真實(shí)全面地反映其微生物組成情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HP組α多樣性指數(shù)中的Chao1指數(shù)顯著高于LP組，暗示HP組微生物的豐富度或者是均勻度高于LP組；但是HP組和LP組之間OTU數(shù)并無(wú)顯著差異，表明2組的微生物豐富度并無(wú)顯著性差異。綜合OTU數(shù)和Chao1指數(shù)的分析結(jié)果可以得出，HP組在空腸微生物的均勻度上要顯著高于LP組，PCoA聚類圖也直觀地證明了這一點(diǎn)。

在本研究中，HP組和LP組空腸微生物相對(duì)豐度最高的門(mén)均是厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，肉牛和奶牛上的研究都表明[37-38]，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)在空腸微生物中處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，這可能與反芻動(dòng)物日糧中粗飼料含量較高有關(guān)，有研究表明，胃腸道中厚壁菌門(mén)(Firmicutes)的比例與日糧中粗飼料的含量呈顯著正相關(guān)[39]。在門(mén)和屬水平上，HP和LP組之間均存在差異顯著的菌群，并且這些差異菌群與宿主對(duì)飼料磷的真消化率之間存在顯著的相關(guān)性，說(shuō)明空腸微生物的結(jié)構(gòu)會(huì)顯著影響山羊?qū)︼暳狭椎南?。在本研究中，HP組Bacteroidetes屬的相對(duì)豐度極顯著高于LP組，同時(shí)隸屬于Bacteroidetes門(mén)的Prevotella屬和Rikenellaceae_RC9_gut_group屬的相對(duì)豐度也顯著高于LP組，并且三者的相對(duì)豐度均與磷真消化率之間呈顯著的正相關(guān)。這些結(jié)果表明，空腸中的Bacteroidetes門(mén)菌群可能有助于宿主對(duì)飼料磷的消化吸收。尤其值得注意的是Bacteroidetes門(mén)的Prevotella屬，其所能消化分解的底物非常廣泛，例如隸屬于Prevotella屬的短普雷沃氏菌，不但具有很高的蛋白酶活性，還能發(fā)酵葡萄糖、乳糖和纖維二糖；棲瘤胃普雷沃氏菌和布氏普雷沃氏菌，能分泌木聚糖酶和羧甲基纖維素酶以降解淀粉、木聚糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[40]。因此，普雷沃氏菌屬幾乎可以單獨(dú)完成蛋白質(zhì)、糖類和碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解任務(wù)。本研究中，Prevotella屬菌群可能也參與了飼料中植酸磷的分解，使得植物性飼料中所含的原本不能被宿主利用的磷被釋放出來(lái)，從而被山羊消化吸收。已有研究表明，Prevotella屬菌群能分泌微生物植酸酶催化植酸的水解，釋放飼料中的植酸磷，提高宿主對(duì)飼料植物磷的消化率[41]。

以有研究表明，F(xiàn)ibrobacter和Ruminococcus_2均是動(dòng)物胃腸道中重要的纖維分解菌。Fibrobacter能產(chǎn)生多糖酶，這些酶能夠降解日糧中的多種纖維類物質(zhì)[42-44]。隸屬于Ruminococcus屬的白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌都是主要的纖維分解菌種，在纖維素和半纖維素的降解中發(fā)揮著重要作用。HP組的Fibrobacter和Ruminococcus_2的相對(duì)豐度顯著高于LP組，且相對(duì)豐度都與山羊?qū)︼暳狭椎南曙@著正相關(guān)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是飼料纖維結(jié)構(gòu)的破壞促進(jìn)了飼料中被束縛的磷的釋放，纖維物質(zhì)的降解發(fā)酵可以提高飼料磷的消化吸收率[45]。

目前為止，人們對(duì)腸道微生物在宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化代謝的過(guò)程中發(fā)揮的作用認(rèn)知十分有限。通過(guò)PICRUSt基因預(yù)測(cè)，空腸微生物最主要的功能類別為代謝功能類，如能量代謝、糖酵解途徑、碳水化合物代謝、脂肪代謝和氨基酸代謝等，這與前人的研究結(jié)果一致[46-47]。必須指出的是，雖然本研究表明，空腸微生物與宿主對(duì)飼料磷的真消化率存在顯著的相關(guān)性，但目前尚缺乏直接的證據(jù)證明微生物的差異直接影響了山羊?qū)︼暳狭椎南铡５豢煞裾J(rèn)的是，本研究首次發(fā)現(xiàn)了空腸微生物的組成與山羊磷的真消化率存在關(guān)聯(lián)性，這為今后研究調(diào)控微生物以促進(jìn)磷的消化利用提供了嶄新的思路。