廣東地區(qū)豬群新發(fā)塞內(nèi)卡病毒流行株的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析

林秀銀，溫肖會(huì)，呂殿紅，翟少倫，霍 瑋，翟 頎，魏文康，楊彩娟

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3. 廣東省動(dòng)物防疫物資儲(chǔ)備中心，廣東 廣州 510520）

【研究意義】塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A，SVA），也稱(chēng)為塞內(nèi)加谷病毒（Seneca valley virus，SVV），屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）塞內(nèi)卡病毒屬［1］，與心病毒屬（Cardiovirus）的親緣關(guān)系較近。SVA病毒粒子的直徑為20～30 nm ，呈正二十面體，無(wú)囊膜。SVA具有小RNA病毒科病毒基因組的共同特點(diǎn)，即呈現(xiàn)L-4-3-4分布［2］。SVA 基因組約7.2 kb，為單鏈正股RNA。雖然SVA造成的損失有限，但由于該病的臨床癥狀癥狀與口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)、豬水皰病 (swine vesicular disease，SVD)、豬水皰疹(vescular exanthema of swine，VES)和水皰性口炎(vesicular stomatitis，VS)等豬原發(fā)性水皰病(porcine idiopathic vesicular disease，PIVD)極為相似，能引起豬的鼻吻和蹄部冠狀帶、蹄部出現(xiàn)水皰樣病變［3］，臨床上很難區(qū)分，甚至容易誤診，必須借助實(shí)驗(yàn)室方法［4-6］來(lái)鑒別。SVA危害養(yǎng)豬業(yè)的健康，能引起很大的經(jīng)濟(jì)損失?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】塞內(nèi)卡病毒病最早于2002年在美國(guó)分離，此后美洲陸續(xù)報(bào)道了SVA引起豬水皰性疾病的病例。從2015年開(kāi)始，巴西、美國(guó)、加拿大、哥倫比亞、泰國(guó)、越南［7-13］等多國(guó)相繼發(fā)生SVA感染豬的疫情，且呈蔓延之勢(shì)。2015年，我國(guó)廣東省發(fā)生由SVA引起的水皰性疾病，這是我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)SVA的存在［14］，此后，SVA在黑龍江、福建、河南、湖北等?。?5-20］陸續(xù)有相關(guān)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】我們于2016—2018年從廣東地區(qū)兩個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)收集及保存了108份臨床樣品，包括口鼻部、蹄冠部位帶有水皰樣病變的水皰皮及水皰液病料，采用熒光RT-PCR的方法排查FMD、SVD，初步懷疑豬病由SVA感染引起。本研究采用細(xì)胞分離、電子顯微鏡檢查、RT-PCR等鑒定方法，對(duì)病料進(jìn)行分離和鑒定，最后分離得到兩株SVA毒株，并進(jìn)行基因序列測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】目前，國(guó)內(nèi)分離到的SVA流行毒株數(shù)量較少，對(duì)于SVA的研究還不夠深入。本研究通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行篩選，從而分離鑒定出兩株SVA，為研究SVA的生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)理、遺傳進(jìn)化提供試驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病料為2016—2018年于廣東省兩個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)收集的疑似SVA的108份病料組織，供試細(xì)胞為BHK-21細(xì)胞、ST細(xì)胞，均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所保存。

主要試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶，均購(gòu)自賽默飛世爾有限公司；PrimeScript ? One Step RT- PCR Kit試 劑 盒、pMD19-T載體、DNA 膠回收試劑盒、DL2000 DNA Marker，均購(gòu)自大連 TaKaRa 公司；感受態(tài)細(xì)胞TOP 10，購(gòu)自天根生化（北京）公司；AxyPrepTM體液病毒DNA/ RNA小量提取試劑盒，購(gòu)自康寧生命科學(xué)有限公司；口蹄疫病毒通用型/豬水皰病毒/塞內(nèi)卡病毒三重核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ?，?gòu)自深圳澳東檢驗(yàn)檢測(cè)科技有限公司。

主要儀器：梯度PCR儀（美國(guó)BIO-RAD T100）、熒光定量PCR儀（Agilent Stratagene MX3000P）、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）、三目倒置顯微鏡（重慶光電XDS-1B）、電子顯微鏡（日立H-7650）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與處理 無(wú)菌采集病豬蹄部水泡皮（病料1）、鼻鏡部水泡皮（病料2），-20 ℃保存。將病料剪碎、加入pH 7.4的PBS研磨，將制成的懸液反復(fù)凍融3次，12 000 g、4 ℃離心20 min ，取上清液。

1.2.2 病毒提取 根據(jù)AxyPrep體液病毒 DNA/RNA小量提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)對(duì)病料提取核酸，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 熒光定量PCR鑒定 提取核酸后，利用口蹄疫病毒通用型/豬水皰病毒/塞內(nèi)卡病毒三重核酸檢測(cè)試劑盒鑒定所采集的病料。反應(yīng)體系制備：核酸擴(kuò)增反應(yīng)液16 μL，F(xiàn)MDV/SVD/SVA三重反應(yīng)液2 μL，RT-PCR酶混液2 μL，待檢樣品RNA 2 μL，總體積為25 μL，分別做陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。反應(yīng)程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s、55 ℃退火/延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)。設(shè)置熒光信號(hào)：熒光信號(hào)采集設(shè)定在退火/延伸時(shí)。對(duì)于多通道熒光PCR儀，口蹄疫病毒通用型選擇熒光素ROX為信號(hào)采集通道，豬水皰病毒選擇熒光素FAM為信號(hào)采集通道，SVA選擇熒光素CY5為信號(hào)采集通道，淬滅基團(tuán)選None，染料校正選None，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 病毒細(xì)胞分離 將經(jīng)過(guò)研磨的病料1和病料2，4 ℃下12 000 g離心10 min，取上清液，用孔徑0.22 μm的過(guò)濾器過(guò)濾。將處理好的病毒液分別接種到長(zhǎng)至80%～90%的單層ST細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞上，在37℃、5%CO2的條件下孵育1 h，棄上清液，加入10 mL含 2%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)48 h，每隔12 h觀察細(xì)胞病變情況，盲傳10代，同時(shí)設(shè)立正常ST細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞為對(duì)照。

1.2.5 電子顯微鏡檢查 收集出現(xiàn)細(xì)胞病變的病毒液，利用蔗糖梯度密度離心法［21］純化，并進(jìn)行病毒液處理，具體步驟如下：取5 μL純化后的樣品滴于銅網(wǎng)上，靜置2 min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余液體；滴加1滴3%、pH為7.0的磷鎢酸于銅網(wǎng)上，靜置2 min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的磷鎢酸；滴加1滴純水于銅網(wǎng)上，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸取多余水分，約20 min銅網(wǎng)干燥后，在電子顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.2.6 病毒的 RT-PCR鑒定 利用RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)純化的病毒進(jìn)行鑒定。采用文獻(xiàn)［22］的SVA鑒定引物，上游引物F為5′-GTTCCACTC-CACCGACAA-3′，下游引物R為 5′-AAACCACCCTACAGCAAAT-3′，預(yù)期目的片段大小為429 bp。一步法反應(yīng)體系：基因組RNA模板2 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，上游引物 F 0.5 μL，下游引物 R 0.5 μL，2×1 Step Buffer 12.5 uL、滅菌蒸餾水8.5 μL，共25 μL。反應(yīng)程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s、55 ℃退火 30 s、72 ℃延伸60 s ，共 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.2%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定。將經(jīng)膠回收純化的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體，重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.7 RT-PCR擴(kuò)增序列分析 對(duì)擴(kuò)增片段測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至NCBI Blast進(jìn)行搜索比對(duì)，對(duì)擴(kuò)增的核苷酸序列與GenBank中登錄的SVA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并利用軟件Megalign、DNAStar繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.8 病毒的TCID50檢測(cè) 利用半數(shù)組織細(xì)胞感染量（Tissue Culture Infective Dose，TCID50）的方法確定病毒液的滴度，并用Reed-Muench法計(jì)算。具體步驟如下：將長(zhǎng)勢(shì)良好的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)到單層，用2 mL pH 7.4 PBS洗滌細(xì)胞表面，重復(fù)3次，用0.25%胰酶消化長(zhǎng)成單層的BHK-21細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)基使細(xì)胞重新懸浮于液體中，制成細(xì)胞懸液；用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器TC20測(cè)定細(xì)胞懸液的濃度，濃度約2×105個(gè)/mL時(shí)，將含有細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)基接種到96孔板上，100 μL /孔，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄去舊的培養(yǎng)基；每孔各加入100 μL用細(xì)胞維持液以10倍倍比稀釋的病毒液（10-1～10-8），每個(gè)稀釋度重復(fù)8個(gè)孔，并以正常BHK-21細(xì)胞為陰性對(duì)照，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每隔12 h觀察1次； 通過(guò)三目倒置生物顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，記錄細(xì)胞病變的孔數(shù)和未有細(xì)胞病變的孔數(shù)，并用Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)熒光RT-PCR檢測(cè)，CY5信號(hào)采集時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照的Ct值為22.58、病料1的Ct值為17.97、病料2的Ct值為19.37，病料1、病料2均為塞內(nèi)卡病毒陽(yáng)性，對(duì)口蹄疫病毒、豬水皰病病毒均為陰性（圖1）。

2.2 病毒的分離與增殖

在倒置顯微鏡下觀察，結(jié)果（圖2、圖3）發(fā)現(xiàn)，接種病料的ST細(xì)胞，分別盲傳至第6代，培養(yǎng) 48 h 后開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，脫落，大量細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)基里，對(duì)照的ST細(xì)胞生長(zhǎng)良好，沒(méi)有出現(xiàn)任何病變（圖2）。

圖1 熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Fluorescence RT-PCR results

圖2 病料接種ST細(xì)胞的細(xì)胞病變情況Fig.2 The CPE of ST cells in clinical test

而病料接種到BHK-21細(xì)胞上，盲傳至第6代，培養(yǎng)48 h后開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，脫落，大量細(xì)胞漂浮于液面上，對(duì)照的BHK-21細(xì)胞生長(zhǎng)良好，沒(méi)有出現(xiàn)任何病變（圖3）。

圖3 病料接種BHK-21細(xì)胞的細(xì)胞病變情況Fig.3 The CPE of BHK-21 cells in clinical test

2.3 病毒的電子顯微鏡觀察結(jié)果

將通過(guò)蔗糖濃度梯度離心純化的病毒液，經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后，在電子顯微鏡下可清晰觀察到病毒粒子，直徑大小約為25 nm（圖4）。

2.4 病毒的RT-PCR鑒定

將兩個(gè)病料純化的病毒經(jīng)過(guò)RT-PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，兩個(gè)病料病毒均在429 bp處出現(xiàn)明亮的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖5）。

2.5 NCBI Blastn序列比對(duì)結(jié)果

將擴(kuò)增得到的片段測(cè)序，結(jié)果提交到NCBI Blastn進(jìn)行搜索比對(duì)，兩個(gè)毒株均鑒定為SVA片段，結(jié)果表明，本研究分離到兩株塞內(nèi)卡病毒，將病料1病毒命名為SVA CH-GDBL1-2016，病料2病毒命名為SVA CHGDBL2-2016。

圖4 SVA電鏡圖Fig.4 Electron micrograph of SVA

圖5 純化病毒的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.5 RT-PCR results of purified virus

2.6 病毒的同源性及遺傳變化分析

利用軟件Megalign、DNAStar進(jìn)行序列分析，序列比對(duì)結(jié)果（圖6）表明，本研究的分離株 SVA CH-GDBL1-2016、SVA CH-GDBL2-2016的序列與2002年美國(guó)分離株SVV-001相比，同源性分別為92.6%、92.3%；分離株SVA CHGDBL1-2016與美國(guó)分離株SVA-OH1、SVAOH2、SVA-715、MN15-308-M3、NC-011349、US-15-41901SD、USA-SD41901-2015、USA-INPurdue-1581-2016、USA-IN-Purdue-3698-2016的同源性在92.6%～96.3%之間；分離株SVA CH-GDBL2-2016與上述美國(guó)分離株的同源性在92.3%～97%之間；分離株SVA CHGDBL1-2016、SVA CH-GDBL2-2016與 加 拿 大分離株11-55910-3的同源性分別為97.7%、97%，與哥倫比亞分離株Colombia-2016的同源性分別為96.5%、95.8%；與巴西分離株SVABRA-GO3-2015、SVA-BRA-MG1-2015的 同 源性分別為96.5%、97.2%；與泰國(guó)分離株G103-SV-1-2016-Thailand、G103-SV-2-2016-Thailand的同源性分別為95.8%、95.1%；與越南分離株SVA-VIT-3187-2018的同源性分別為98.4%、97.7%；分離株SVA CH-GDBL1-2016與中國(guó)分 離 株 CH-GDLZ02-2017、CH-GDQC-2017、C H-G D Y D-2 0 1 7、C H-G X I 0 9-2 0 1 6、CH-HNSL-2017、CH-LX-01-2016、CHZW-01-2016、GD05-2017、HB-CH-2016、SVA-CHN-17-2017、SVA-HLJ-CHA-2016、CHDB-11-2015、CH-DL-01-2016、CH-FJ-2017、CH-GDLZ01-2017的同源性在94.9%～98.6%之間；分離株SVA CH-GDBL2-2016與上述中國(guó)分離株的同源性在95.6%～99.3%之間，其中與分離株CH-GXI09-2016、SVA-CHN-17-2017的同源性高達(dá)99.3%。

由圖7可知，本研究分離的2株病毒在同一個(gè)小分支上，與中國(guó)分離株CH-GXI09-2016的親緣關(guān)系較近，而與美國(guó)分離株SVV-001、NC-011349不在同一分支上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，存在較大差異。

2.7 病毒的TCID50檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)Reed-Muench法及病毒液在BHK-21細(xì)胞的病變情況，計(jì)算病毒液的TCID50，分別得到SVA CH-GDBL1-2016的 TCID50為 106.8，SVA CH-GDBL2-2016的TCID50為106.7。

3 討論

3.1 新分離毒株的同源性及遺傳變化

從同源性分析來(lái)看，本研究分離到的2個(gè)毒株與我國(guó)分離株CH-GXI09-2016、SVACHN-17-2017的同源性最高、達(dá)99.3%；與美國(guó)分離株SVV-001的同源性分別為92.6%、92.3%，差異較大；從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，本研究分離到的2個(gè)毒株與我國(guó)分離株CH-GXI09-2016、SVACHN-17-2017同屬一個(gè)分支，與加拿大分離株存在一定差異，與美國(guó)分離的原型毒株 SVV-001不在一個(gè)分支上，且距離最遠(yuǎn)，這些差異可能與地域分布有關(guān)。SEGALéS等［23］將SVA VP1的系統(tǒng)進(jìn)化暫時(shí)劃分為 3 個(gè)譜系：Ⅰ系為原型毒株 SVV-001，Ⅱ系主要為 1988—1997 年的美國(guó)分離株，Ⅲ系包括了 2001 年至今從巴西、加拿大、中國(guó)、泰國(guó)和美國(guó)分離的毒株。說(shuō)明近30年來(lái)SVA VP1發(fā)生了變異，這些變異是否給發(fā)病機(jī)制、致病機(jī)理、致病性等帶來(lái)變化，需要進(jìn)一步研究。

圖6 SVA VP1核苷酸序列同源性分析Fig.6 Homology analysis of the SVA VP1 according to nucleotide sequence

圖7 SVA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of SVA

3.2 豬鼻鏡與蹄冠水皰病的鑒別診斷

病毒的分離培養(yǎng)是研究病毒特性、病毒機(jī)理的基礎(chǔ)。塞內(nèi)卡病毒病與口蹄疫、豬水皰病、豬水皰疹及水皰性口炎等豬原發(fā)性水皰疾病的臨床癥狀極為相似，必須借助實(shí)驗(yàn)室方法來(lái)鑒別。研究表明，在細(xì)胞分離方面，SVA能在NCI-H1299細(xì)胞、ST細(xì)胞、PK-15細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、IBRS-2細(xì)胞等細(xì)胞中增殖，并能產(chǎn)生相對(duì)明顯的CPE。本研究選擇了實(shí)驗(yàn)室比較常見(jiàn)的BHK-21細(xì)胞、ST細(xì)胞，對(duì)疑似SVA的水泡皮病料進(jìn)行分離培養(yǎng)，自第6代起，病毒液在兩種細(xì)胞中均能出現(xiàn)典型的CPE。

為了能進(jìn)一步的判斷，利用RT-PCR、熒光PCR能特異性地鑒定上述幾種豬原發(fā)性水皰疾病。研究人員在RT-PCR、熒光RT-PCR等方面做出了大量研究。KNOWLES等［24］設(shè)計(jì)了特異性引物，上、下游引物分別位于VP3和2A區(qū)域上，利用RT-PCR診斷技術(shù)，擴(kuò)增完整的SVA VP1基因，在豬群中能檢測(cè)到SVA的存在。樊曉旭等［25］在SVA病毒保守的3D基因區(qū)域，設(shè)計(jì)Taq Man探針以及特異性引物，篩選兩者的最優(yōu)組合，建立 Taq Man熒光定量 PCR 檢測(cè)方法，用于病毒的早期檢測(cè)。劉健新等［6］根據(jù)SVA的VP1基因保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法，該法特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單。耗時(shí)短。

3.3 塞內(nèi)卡病毒病是不容忽視的新發(fā)病

塞內(nèi)卡病毒病的危害性雖然沒(méi)有豬口蹄疫高，但也不容忽視，防控該疾病非常必要。2015年，在我國(guó)廣東省發(fā)現(xiàn)了首例由SVA感染引起的水皰性疾病［26］。在我國(guó)，塞內(nèi)卡病毒是新傳入的外來(lái)病，目前還沒(méi)有將塞內(nèi)卡病毒病歸類(lèi)，也不在最新一版的世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊(cè)》中。對(duì)所有水泡特征的疾病都應(yīng)在采取嚴(yán)格生物安全措施的情況下盡快確診，必須與口蹄疫、豬水皰病、水皰性口炎和水皰疹相區(qū)別，防止與我國(guó)I類(lèi)傳染病口蹄疫和豬水皰性疾病混淆。

農(nóng)業(yè)部辦公廳2018年發(fā)布的《2018 年獸醫(yī)工作要點(diǎn)》明確提出，要做好塞內(nèi)卡病毒病等新傳入疫病的防治工作。此公告引起了業(yè)界對(duì)塞內(nèi)卡病毒病的高度關(guān)注，需要對(duì)SVA致病機(jī)理、流行情況、診斷和防控技術(shù)等進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

本研究從廣東兩個(gè)豬場(chǎng)疑似塞內(nèi)卡病毒感染引起死亡的豬群中分離到2株病毒，經(jīng)過(guò)普通RT-PCR鑒定、熒光RT-PCR鑒定、細(xì)胞分離培養(yǎng)以及電子顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察等方法檢測(cè)，證實(shí)分離的這兩株病毒均為塞內(nèi)卡病毒新毒株，分別命名為SVA CH-GDBL1-2016和SVA CHGDBL2-2016。塞內(nèi)卡病毒新毒株可為后續(xù)塞內(nèi)卡病毒的診斷和疫苗研制提供試驗(yàn)材料。