牡丹愈傷組織增殖及褐化研究

程雨飛，朱向濤，季 雯，洪爾蔓，林 芯，范 貞，張俊麗

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)暨陽學(xué)院，浙江 諸暨 311899；2.臨沂市園林局，山東 臨沂 276037；3.濰坊職業(yè)學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，山東 濰坊 262737）

【研究意義】牡丹（Paeonia suffruticosa L.）為芍藥科芍藥屬亞灌木，是名貴的觀賞和藥用植物。其花大色艷，觀賞價值高，是我國傳統(tǒng)十大名花之一。然而，傳統(tǒng)的牡丹育種方法周期長、選擇效率低，無法滿足日益增長的牡丹市場需求。組織培養(yǎng)作為高效的繁殖方法，可以提高繁殖效率，具有較好的應(yīng)用前景［1］?！厩叭搜芯窟M展】目前牡丹組織培養(yǎng)研究主要集中在體細(xì)胞胚發(fā)生和器官發(fā)生兩大方面。關(guān)于牡丹體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的研究已經(jīng)取得一定進展，通過改變添加物［2］、植物生長調(diào)節(jié)劑［3］、外植體成熟度［4］來提高體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率。器官發(fā)生途徑在牡丹組織培養(yǎng)中研究較多也較早，以牡丹莖段［5］、葉柄、莖尖［6］為外植體通過試驗建立牡丹離體快繁體系，雖已有一定基礎(chǔ)，但愈傷組織增殖和分化困難、增殖過程中褐化嚴(yán)重［7］以及生根難［8］等問題仍然存在，也是制約牡丹離體快繁體系建立的主要問題。通過組織培養(yǎng)建立高效牡丹繁殖體系是目前研究的重點和熱點，而兩種組織培養(yǎng)途徑都需要大量愈傷組織作為材料，因此獲得大量愈傷組織是牡丹組織培養(yǎng)體系建立的基礎(chǔ)。而愈傷組織的繼代增殖是愈傷組織大量繁殖與分化成功與否的關(guān)鍵［9］?，F(xiàn)階段，牡丹愈傷組織增殖過程存在的主要問題是增殖系數(shù)低［10］、褐化率高。有研究表明，在不同質(zhì)量濃度的PIC處理下，鳳丹牡丹的增殖系數(shù)存在顯著差異［11］。而光源CCFLs（冷陰極熒光燈）［12］、KT（呋喃甲氨基嘌呤）［13］可一定程度上促進牡丹愈傷組織生長。關(guān)于牡丹增殖過程中易褐化的現(xiàn)象，有研究發(fā)現(xiàn)低溫培養(yǎng)［11］、添加適宜濃度硝酸銀［14］、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）［15］、活性炭、去除培養(yǎng)基中Cu2+［16］、添加不同糖源或不同質(zhì)量濃度蔗糖培養(yǎng)基［17］進行增殖培養(yǎng)等措施，都可有效降低褐化率。但關(guān)于預(yù)培養(yǎng)時間和赤霉素（GA3）對牡丹愈傷組織增殖及增殖過程中褐化情況的影響，尚未見報道?！颈狙芯壳腥朦c】以牡丹胚軸、子葉愈傷組織為材料，研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度、不同外植體預(yù)培養(yǎng)時間以及GA3對牡丹愈傷組織增殖的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】確定牡丹胚軸、子葉愈傷組織適合的增殖培養(yǎng)基以及預(yù)培養(yǎng)時間，有效抑制增殖過程中的褐化現(xiàn)象，以期通過愈傷組織大量增殖、分化奠定基礎(chǔ)，進一步建立牡丹離體再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以不同生長階段的胚軸愈傷組織和子葉愈傷組織為材料，供試牡丹品種為‘鳳丹白’，種子采自浙江農(nóng)林大學(xué)暨陽學(xué)院的牡丹圃。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理 試驗在浙江農(nóng)林大學(xué)暨陽學(xué)院組培室進行，晴天上午，取生長狀況良好的成熟牡丹種子，裝入樣品袋，帶回組培室進行表面滅菌：用軟刷刷去表面污垢，2% NaClO浸泡20 min。然后置于超凈工作臺內(nèi)，用無菌水沖洗3～5遍，70%酒精消毒10 s后，無菌水沖洗3～5遍，將表面水分用無菌濾紙吸干，在超凈工作臺將種胚取出接于培養(yǎng)基 NAA 3.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 1.0 mg/L中進行暗培養(yǎng)。種胚暗培養(yǎng)30 d后，切取胚軸與子葉部分，分別接種于上述相同培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)，得到牡丹胚軸愈傷組織和子葉愈傷組織。

1.2.2 不同培養(yǎng)基對愈傷組織增殖的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，采用L9（34）設(shè)計4因素3水平的正交試驗（表1），共9個處理。將牡丹胚軸、子葉愈傷組織轉(zhuǎn)接至試驗培養(yǎng)基（蔗糖30.0 g/L、瓊脂7.0 g/L，pH 5.8）中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度24（±1）℃、光照時間10 h/L、光照強度30～50 μmol/m2·s，每個處理3次重復(fù)。每隔15 d記錄愈傷組織的增重量、褐化情況，30 d為一個繼代周期。愈傷組織質(zhì)量用電子天平測量，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計愈傷組織在增殖過程中的褐化情況，統(tǒng)計愈傷組織的增殖倍數(shù)，方法如下：

愈傷組織增殖倍數(shù)=愈傷組織繼代30 d增長質(zhì)量/繼代初質(zhì)量

愈傷組織褐化情況：將愈傷組織褐化情況分為4個等級：0級，無褐化；1級，輕微褐化，褐化部分占愈傷組織總體積1/10以下；2級，中度褐化，褐化部分占愈傷組織總體積的1/10～1/3；3級，重度褐化，褐化部分占愈傷組織總體積1/3以上（圖1）。

數(shù)據(jù)用Excel統(tǒng)計，運用SPSS 22.0進行單因素方差分析（One-way ANOVE）和鄧肯多重比較（Duncan）。

表1 L9（34）愈傷增殖試驗因素水平Table1 Factors in L9 (34) callus proliferation test

圖1 牡丹愈傷組織增殖過程中的褐化等級Fig.1 Browning level during peony callus proliferation

1.2.3 不同預(yù)培養(yǎng)時間對愈傷組織增殖的影響把誘導(dǎo)出的牡丹胚軸、子葉愈傷組織接入相同培養(yǎng)基NAA 3.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 1.0 mg/L中，在黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)時間分別為30、60、90 d，在空白培養(yǎng)基上進行3 d過渡培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接至篩選出的最佳增殖培養(yǎng)基（蔗糖30.0 g/L、瓊脂7.0 g/L，pH 5.8）。培養(yǎng)條件為溫度24（±1）℃、光照時間 10 h/L、光照強度 30～50 μmol/m2·s，每個處理3次重復(fù)。每隔15 d記錄愈傷組織的增重量、褐化情況，統(tǒng)計方法如1.2.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹愈傷組織繼代增殖最佳培養(yǎng)基篩選

2.2.1 牡丹胚軸愈傷組織繼代增殖最佳培養(yǎng)基表2顯示，牡丹胚軸愈傷組織在不同培養(yǎng)基組合上的增殖效果差異顯著。其中增殖倍數(shù)最高的是4號培養(yǎng)基、為5.75，最低的是1號培養(yǎng)基、為2.69。胚軸愈傷組織在3、4、9號培養(yǎng)基中褐化程度最輕。綜合來看，4號培養(yǎng)基（PVP 1.0 g/L+IAA 0.2 mg/L+TDZ 1.0 mg/L+GA31.0 mg/L）是牡丹胚軸愈傷組織增殖繼代的最佳組合。

表2 不同培養(yǎng)基對牡丹胚軸愈傷組織繼代增殖的影響Table2 Effects of different media on subculture mulitiplication of peony hypocotyl callus

2.2.2 牡丹子葉愈傷組織繼代增殖最佳培養(yǎng)基由表3可知，牡丹子葉愈傷組織在不同培養(yǎng)基組合上的增殖效果差異顯著。其中增殖倍數(shù)最高的是8號培養(yǎng)基、為5.50，最低的是1號培養(yǎng)基、為3.13。子葉愈傷組織在3、4、8號培養(yǎng)基中褐化程度最輕。綜合來看，8號培養(yǎng)基（PVP 2.0 g/L+IAA 0.5 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+GA31.0 mg/L）是牡丹子葉愈傷組織增殖繼代的最佳組合。

表3 不同培養(yǎng)基對牡丹子葉愈傷組織繼代增殖的影響Table3 Effects of different media on subculture mulitiplication of peony cotyledon callus

2.2 赤霉素對牡丹愈傷組織繼代增殖的影響

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牡丹胚軸愈傷組織3、4、9號處理組（表2）以及子葉愈傷組織3、4、8號處理組（表3）增殖培養(yǎng)30 d后未出現(xiàn)明顯褐化現(xiàn)象。以上6個處理中，GA3濃度均為1.0 mg/L。牡丹胚軸愈傷組織培養(yǎng)基中GA3濃度為1.0 mg/L的處理組，增殖倍數(shù)為5.28、5.75、4.14，增殖倍數(shù)較高，分別為第1、2、3位；牡丹子葉愈傷組織培養(yǎng)基中，GA3濃度為1.0 mg/L的處理組，增殖倍數(shù)為4.25、5.50、5.41，增殖倍數(shù)也處于較高水平，分別為第1、2、4位?？梢?，1.0 mg/L GA3有利于抑制愈傷組織增殖過程中的褐化現(xiàn)象，并促進愈傷組織增殖。

圖2 牡丹愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)30 d后未出現(xiàn)明顯褐化組別Fig.2 Groups without obvious browning after 30d of subculture mulitiplication of peony callus

2.3 不同外植體預(yù)培養(yǎng)時間對牡丹愈傷組織繼代增殖的影響

從圖3和表4可以看出，預(yù)培養(yǎng)不同時間的外植體其增殖情況不同。預(yù)培養(yǎng)30 d的愈傷組織相較于預(yù)培養(yǎng)60、90 d的愈傷組織，增殖倍數(shù)最高，褐化程度最輕，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的增長，愈傷組織的增殖倍數(shù)呈降低后升高的變化趨勢，差異明顯，褐化程度則更嚴(yán)重。綜合來看，不同外植體預(yù)培養(yǎng)時間影響愈傷組織增殖和褐化情況，在增殖繼代中利用預(yù)培養(yǎng)30 d的愈傷組織，有利于提高增殖倍數(shù)、減輕褐化現(xiàn)象。

圖3 預(yù)培養(yǎng)30 d愈傷組織繼代增殖Fig.3 Multiplication of callus precultured for 30 d

表4 不同外植體預(yù)培養(yǎng)時間對牡丹愈傷組織繼代增殖的影響Table4 Effects of different explant preculture time on multiplication of peony callus

2.4 不同愈傷組織狀態(tài)對牡丹愈傷組織繼代增殖的影響

研究過程中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織在繼代增殖過程中，狀態(tài)大致可以分為3種情況：（1）表面附著一層絮狀物，與愈傷組織一起增大，愈傷整體呈淡黃綠色，略為松軟（圖4A）；（2）頂部呈顆粒狀的愈傷組織不再增長，基部密實的愈傷組織不斷增大，愈傷組織軟硬適中（圖4B）；（3）新舊愈傷組織呈相同活性，愈傷組織整體增殖變大，顏色逐漸翠綠，硬度逐漸增大（圖4C）。呈現(xiàn)第1種狀態(tài)的愈傷組織，在整個增殖培養(yǎng)過程中的狀態(tài)比較穩(wěn)定，不易褐化且中后期體積增殖變化明顯；呈現(xiàn)第2種狀態(tài)的愈傷組織，在增殖過程中存在一定的褐化現(xiàn)象，不嚴(yán)重，體積增長情況則穩(wěn)定且緩慢；呈現(xiàn)第3種狀態(tài)的愈傷組織，在增殖培養(yǎng)前期表現(xiàn)十分突出，體積增大較快，但到中后期往往不再增長，且極易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

圖4 牡丹愈傷組織繼代增殖狀態(tài)Fig.4 Status of subculture multiplication of peony callus

3 討論

褐化問題是木本植物組培試驗中常見的問題［18］，而增殖系數(shù)不高則是現(xiàn)階段牡丹愈傷組織增殖過程存在的主要難題。本試驗通過研究不同添加物組合及濃度、不同預(yù)培養(yǎng)時間，對影響褐化情況和增殖倍數(shù)的因素進行了系統(tǒng)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)增殖過程中添加1.0 mg/L GA3時，牡丹愈傷組織增殖倍數(shù)提高且不易褐化，添加其他濃度或未添加GA3的處理組則發(fā)生了不同程度的褐變。GA3是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，在牡丹領(lǐng)域常用于解除種子休眠［19］、促進種子生根和發(fā)芽［20］、延緩葉片衰老［21］，但在愈傷組織增殖方面應(yīng)用較少。有研究表明，GA3可影響黃冠梨［22］和紅葉石楠［23］的增殖率，并對渝茶1號的增殖和生長都有很好的促進作用［24］，這與本試驗的結(jié)果相一致。在組培試驗中，添加抗褐化劑可減輕外植體褐化情況，且不同抗褐化劑對不同種類植物的抗褐化效果及作用機理存在差異。例如，Vc作為一種抗氧化劑對總酚的形成和積累有一定的抑制作用、AC能吸附植物在組織培養(yǎng)中分泌的酚類物質(zhì)。本試驗發(fā)現(xiàn)1.0 mg/L GA3可有效抑制牡丹愈傷組織增殖過程中的褐化現(xiàn)象，有研究表明GA3也能有效抑制冬凌草褐化［25］，可能是適量的GA3可阻止組織中多酚氧化酶被激活或酚類化合物被氧化，但具體作用機理還需進一步研究。與以往GA3在植物方面多應(yīng)用于打破種子休眠、調(diào)控花期不同，可以考慮將其作為一種新型抗褐化劑應(yīng)用于組培試驗。

本研究結(jié)果表明，增殖過程中采用預(yù)培養(yǎng)30 d的愈傷組織相較于采用預(yù)培養(yǎng)60 d和90 d的愈傷組織，可以獲得更高的增殖倍數(shù)，且褐化程度差異明顯。在繼代增殖中，預(yù)培養(yǎng)30 d的愈傷組織增長最快、體積變化最為明顯、且褐化程度最輕，預(yù)培養(yǎng)60 d的愈傷組織次之，預(yù)培養(yǎng)90 d的愈傷組織增殖情況最差且極易出現(xiàn)褐化情況，這可能是由于體內(nèi)積累太多代謝產(chǎn)物，從而促進酚類化合物的合成［26］。有研究表明，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的油菜子葉和下胚軸愈傷組織分化效果較好［27］，這為牡丹分化研究提供了思路。與前人研究不同的是，本試驗中采用的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，與愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，不同預(yù)培養(yǎng)時間改變的可能是愈傷組織成熟度，在今后的增殖試驗中，可通過調(diào)整預(yù)培養(yǎng)階段培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)劑及外源添加物種類來進行優(yōu)化，以期得到更好的增殖效果。

研究中還發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的狀態(tài)很大程度上影響愈傷組織的增殖情況，呈現(xiàn)淡黃綠色且質(zhì)地松軟的愈傷組織在增殖過程中生長迅速，不易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，可以穩(wěn)定增殖。而呈現(xiàn)翠綠色且質(zhì)地堅硬的愈傷組織，在增殖前期體積變化較為明顯，但中后期生長十分緩慢，且狀態(tài)極不穩(wěn)定、易褐化。在本試驗中，前者多為預(yù)培養(yǎng)30 d的愈傷組織，而顏色較深硬度較大的后者則多為預(yù)培養(yǎng)90 d的愈傷組織。有關(guān)研究表明，黃綠色較疏松的華北八寶愈傷組織［28］、淡黃顆粒疏松的苧麻愈傷組織［29］、淡黃色至黃褐色的蓮藕愈傷組織［30］、淡黃色的水稻愈傷組織［31］狀態(tài)良好、生長旺盛，這與本研究結(jié)果一致。當(dāng)愈傷組織處于上述狀態(tài)時即可進行增殖，并可考慮將這兩種愈傷組織進行電鏡觀察，柔軟與堅硬的區(qū)別可能是生理結(jié)構(gòu)層面出現(xiàn)了變化，有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

1.0 mg/L GA3有利于促進牡丹愈傷組織的增殖并抑制愈傷組織增殖過程中的褐化現(xiàn)象，30 d是繼代增殖最適宜的外植體預(yù)培養(yǎng)時間，呈淡黃綠色且質(zhì)地松軟的愈傷組織在增殖過程中生長量大且不易褐化。但褐化仍是牡丹組織培養(yǎng)中較為重要的難題，因此對牡丹外植體培養(yǎng)過程中的生長調(diào)節(jié)劑種類選擇與濃度配比、抗褐化劑的選取等，仍然需要進一步深入研究。