人口腔鱗狀細胞癌發(fā)病節(jié)點lncRNA的篩選、驗證及意義*

仇永樂, 耿熙雪, 劉遠航, 李昆珊, 郭杰

1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科(河北石家莊 050000)； 2河北省中醫(yī)院病理科(河北石家莊 050000)； 3石家莊市第二醫(yī)院口腔科(河北石家莊 050000)

雖然最近十年口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)的診治已取得很突出成績，但是中晚期患者的生存質(zhì)量仍然很差。大量研究也揭示了OSCC發(fā)生、發(fā)展過程是由多種基因突變所致，具有多步驟的變化[1]。因此，深入研究OSCC發(fā)生的分子機制，對選擇合適的預(yù)測腫瘤標記物和發(fā)現(xiàn)新的治療策略十分關(guān)鍵。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)缺乏完整的開放閱讀框，不具有蛋白編碼功能。盡管lncRNA的轉(zhuǎn)錄水平通常低于蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平，但它們的表達呈現(xiàn)高度組織特異性，這表明它們可能參與機體組織和細胞功能的精確調(diào)節(jié)[2]。LncRNA與腫瘤生物功能緊密相關(guān)，調(diào)節(jié)著癌細胞生長、發(fā)育、增殖、周期、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移，并可作為判斷癌癥患者預(yù)后的指標。本實驗通過lncRNA表達譜芯片，篩選OSCC中表達差異的lncRNAs和mRNAs。探尋OSCC發(fā)病中節(jié)點lncRNAs，分析其表達水平與臨床病理特征及患者預(yù)后之間的關(guān)系，為臨床OSCC防治提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月至2016年10月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院手術(shù)切除的72例患者的OSCC組織及對應(yīng)的正常組織(距腫瘤邊緣2 cm以上)。所有患者的病例資料完整，病理診斷明確，均為第1次發(fā)病初次手術(shù)治療，術(shù)前未進行放化療等針對OSCC的治療，并簽署知情同意書。患者出院后即獲隨訪，無一例失訪，隨訪截止日期2018年4月30日。無進展生存時間(progression-free survival，PFS)定義為確診至疾病進展的時間，總生存時間(overall survival，OS)定義為確診至患者死亡或隨訪截止時間。

1.2 LncRNA芯片檢測 選取3例OSCC組織及對應(yīng)的正常組織，其中，1例舌癌(T1N2M0)，1例牙齦癌(T2N0M0)，1例頰癌(T3N1M0)，交予上海伯豪生物技術(shù)有限責(zé)任公司應(yīng)用SBC Human (4×180K) lncRNA芯片實現(xiàn)lncRNA差異表達譜的篩選。實驗中所用的芯片可以同時檢測出lncRNAs(77103)和mRNAs(18853)，并能夠覆蓋目前核心數(shù)據(jù)庫，如：GENCODE V21 (7346)，Lncipedia V3.1 (19324)等。

1.2.1 RNA提取與質(zhì)檢 液氮預(yù)冷研缽，取100 mg標本于研缽中充分、均勻磨碎，等待液氮揮發(fā)完畢后，迅速往研缽中加入1 mL Trizol液體，按照實驗標準流程，進行后續(xù)total RNA提取。所得total RNA利用NanoDrop ND-2000分光光度計、Agilent Bioanalyzer 2100以及瓊脂糖凝膠電泳完成質(zhì)檢，合格的RNA用于后期實驗。

1.2.2 cDNA合成、標記和雜交 按照Agilent公司的Low Input Quick Amp WT Labeling Kit和標準操作流程，對質(zhì)檢合格樣品的total RNA進行cDNA擴增和熒光標記，并用RNeasy mini kit純化標記后的cRNA，然后在滾動雜交爐中(65℃，10 r/min)雜交17 h，雜交cRNA上樣量1.65 μg。隨后取出完成雜交的芯片，充分洗滌，進行芯片掃描。

1.2.3 數(shù)據(jù)采集和標準化 采用Agilent Microarray Scanner掃描已經(jīng)完成雜交的芯片，利用Feature Extraction software 10.7獲得芯片圖，并讀取數(shù)值，得到原始數(shù)據(jù)。借助R軟件(The R Project for Statistical Computing, http://www.r-project.org/)中l(wèi)imma包，進行Quantile的標準化和隨后的數(shù)據(jù)處理。

1.2.4 差異表達分析 原始數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理后，憑借篩選的高質(zhì)量探針進行深入的分析。實驗中l(wèi)ncRNAs和mRNAs差異表達譜的篩選，以差異表達倍數(shù)即Fold change(FC)>2、且P<0.05為標準，利用火山圖直觀顯示差異表達的基因。通過計算差異表達lncRNAs和mRNAs間的Pearson系數(shù)，并依據(jù)系數(shù)大小來篩選有共表達關(guān)系的基因，以此建立共表達網(wǎng)絡(luò)。

1.3 qRT-PCR驗證 取適量標本組織利用Trizol法提取total RNA，進行RNA質(zhì)檢，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，按照SYBR-Green qPCR Master Mix試劑盒操作說明進行熒光定量分析。熱循環(huán)條件為：95℃變性10 min，95℃變性15 s，60℃變性30 s，72℃變性30 s。GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法測定相對表達水平，設(shè)置3個重復(fù)孔，計算其均數(shù)和標準差。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier方法并進行Log-rank檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織total RNA質(zhì)檢 組織中total RNA的A260/A280比值均在1.8～2.1之間，提示RNA含量較高，純度較好，沒有DNA污染，所有樣本的RNA質(zhì)量均滿足檢測要求；瓊脂糖凝膠電泳實驗中，28S、18S條帶清晰，5.8S條帶模糊，28S條帶亮度基本是18S條帶亮度的2倍，提示抽提的total RNA完整，滿足后期實驗要求。見圖1。

1、2、3：正常組織；4、5、6：口腔鱗癌組織圖1 Total RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 LncRNA芯片結(jié)果分析

2.2.1 箱線圖(box-whisker plot) 箱線圖能夠用來評估數(shù)據(jù)分布的集散程度。實驗通過箱線圖分析，6例標本芯片掃描值分布相同，未見明顯差異，可用來進行下一步數(shù)據(jù)分析。見圖2。

1、2、3：正常組織；4、5、6：口腔鱗癌組織圖2 熒光密度值分布箱線圖

2.2.2 火山圖(volcano plot) 火山圖中的X軸和Y軸分別表示差異倍數(shù)和P值，經(jīng)歸一化和標準化處理后的信號值分布在對應(yīng)區(qū)域，灰點表示檢測到的基因不符合本次實驗設(shè)定的篩選標準?；鹕綀D結(jié)果說明存在很多顯著差異表達的lncRNAs和mRNAs。見圖3。

2.2.3 差異表達lncRNAs和mRNAs數(shù)據(jù)分析 實驗共篩選出差異表達lncRNAs 2 294條(上調(diào)lncRNAs為933條，下調(diào)lncRNAs為1 361條)；差異表達mRNAs 1 938條(上調(diào)mRNAs為891條，下調(diào)mRNAs為1 047條)。差異倍數(shù)前10位的lncRNAs 和mRNAs，見表1～2。

火山圖中紅點代表OSCC，藍點代表正常組織;A：lncRNAs；B：mRNAs圖3 LncRNAs和mRNAs的火山圖表1 OSCC與正常組織相比差異表達lncRNAs(前10個)

lncRNAs來源差異倍數(shù)上調(diào) lnc-MANSC4-8:1lncipedia201.36 ENST00000520185ENSEMBL_GENCODE86.97 lnc-CXCR3-5:2lncipedia64.77 NR_002712RefSeq61.10 lnc-IFI44-6:1lncipedia57.54 lnc-MANSC4-8:1lncipedia51.02 ENST00000522970ENSEMBL_GENCODE50.39 lnc-IFI44-5:1lncipedia43.84 ENST00000562027ENSEMBL_GENCODE42.53 ENST00000455557ENSEMBL_GENCODE38.31下調(diào) NR_117092RefSeq418.62 lnc-SPRR1B-1:1lncipedia266.21 ENST00000392385ENSEMBL_GENCODE256.68 lnc-TMPRSS11BNL-1:3lncipedia237.23 lnc-ANKS1A-1:1lncipedia212.48 ENST00000555864ENSEMBL_GENCODE194.03 lnc-TPP2-7:2lncipedia185.49 NR_104048RefSeq180.41 lnc-SPRR1A-2:1lncipedia160.52 ENST00000504297ENSEMBL_GENCODE150.61

表2 OSCC與正常組織相比差異表達mRNAs(前10個)

圖4lncRNAs與mRNAs共表達網(wǎng)絡(luò)圖

A：芯片結(jié)果與qRT-PCR驗證結(jié)果間lncRNAs差異倍數(shù)對比；B：72例OSCC和正常組織中l(wèi)ncRNAs標準化水平對比

圖510個差異表達lncRNAs的qRT-PCR驗證結(jié)果

項目TMPRSS11BNLlnc-WRN-10:1OSCC組織2.99±0.563.35±0.85正常組織6.55±0.657.35±0.65t值24.27719.492P值<0.001<0.001

表4 LncRNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-11的表達與OSCC患者臨床病理特征間的關(guān)系 例

lncRNA A：TMPRSS11BNL B：lnc-WRN-11圖6 OSCC患者TMPRSS11BNL、lnc-WRN-11的表達與PFS的關(guān)系

lncRNA A：TMPRSS11BNL B：lnc-WRN-11圖7 OSCC患者lncRNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-11的表達與OS的關(guān)系

3 討論

OSCC的局部浸潤性強，具有不可控制的侵襲性，容易發(fā)生頸淋巴轉(zhuǎn)移。一般情況下轉(zhuǎn)移多沿著頸部淋巴鏈，通過血液通道擴散遠處的比例很低[3-4]。瘤栓轉(zhuǎn)移到頸淋巴結(jié)后，于頸部滯留。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，不可避免導(dǎo)致患者生存質(zhì)量下降。因此，OSCC完善的治療方案，除了考慮治療原發(fā)性癌癥外，還應(yīng)考慮頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能性及其治療方案。因此，頸淋巴結(jié)清掃問題也一直作為治療OSCC的關(guān)鍵問題?？谇击[癌患者即使淋巴結(jié)檢查為陰性，也不表示腫瘤沒有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究報道[5]，一旦發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，5年生存率下降50%。因此，OSCC患者只要發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，良好預(yù)后的概率就會顯著下降。OSCC患者預(yù)后生存質(zhì)量與頸淋巴結(jié)相關(guān)因素[6-7]如：(1)一般來說，OSCC患者頸淋巴轉(zhuǎn)移數(shù)目與預(yù)后的生存質(zhì)量呈負相關(guān)狀態(tài)，D′Cruz等[8]腫瘤研究結(jié)果表明，OSCC患者倘若沒有發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，5年生存率是75%。而假如1個淋巴發(fā)生轉(zhuǎn)移，OSCC患者5年生存率下降到49%，2個者下降到30%，3個或更多者僅為13%。(2)頸部發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)如果突破胞膜侵入鄰近組織，OSCC患者的預(yù)后生存質(zhì)量往往很差。Asio等[9]實驗結(jié)果報告，如果轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)發(fā)生胞膜突破現(xiàn)象，OSCC患者行淋巴結(jié)清掃術(shù)后，復(fù)發(fā)率高達84%，而沒有突破者的復(fù)發(fā)率僅是46%。同樣，OSCC患者有包膜突破者的遠處轉(zhuǎn)移率為57%，而沒有包膜突破者為25%。(3)調(diào)查顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的位置與OSCC患者預(yù)后生存質(zhì)量呈正相關(guān)狀態(tài)。Shah等[10]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)轉(zhuǎn)移患者的5年生存率為62%。轉(zhuǎn)移到Ⅲ區(qū)、Ⅳ區(qū)的生存率為35%。目前的研究已經(jīng)達成共識，對于淋巴結(jié)術(shù)前檢查結(jié)果提示陽性的OSCC患者，給予其淋巴清掃術(shù)是十分必要的。但是，對于術(shù)前檢查結(jié)果顯示陰性的OSCC患者，是否行手術(shù)治療仍在爭論[11]。有的腫瘤研究者提倡僅行口腔原發(fā)病灶的手術(shù)治療，頸淋巴結(jié)暫行復(fù)診觀察。另一部分研究者建議，為了避免發(fā)生OSCC患者的淋巴隱匿性轉(zhuǎn)移，必須一并行淋巴結(jié)手術(shù)。但是，針對一些早期OSCC患者若同期行淋巴結(jié)手術(shù)，必然產(chǎn)生嚴重并發(fā)癥，如聳肩無力等，影響著OSCC患者生活質(zhì)量。所以說，早期OSCC患者，若術(shù)前檢查淋巴結(jié)陰性，術(shù)中要不要行同期頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)，是目前爭論研究熱點。頸淋巴結(jié)隱匿性轉(zhuǎn)移一直缺少無創(chuàng)而可靠的檢查方法，因此，對OSCC患者隱匿性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢查方法的研究迫在眉睫。