殼聚糖薄膜培養(yǎng)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞抗炎基因表達(dá)的影響

徐雄峰, 邱 波, 李華杰, 易 鵬

武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨外科, 武漢430060

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以慢性關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和丟失為主，以及關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨骨質(zhì)增生為主要病理特征的疾病，其治療仍是臨床尚未解決的問題。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源于組織和器官，是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞,能夠分化為成骨[1]、軟骨[2]、肝[3]等。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，誘導(dǎo)后的MSCs能夠轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞修復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨，能治療實(shí)驗(yàn)性的OA[4]。目前MSCs在常規(guī)平板培養(yǎng)(two-dimensional culture，2D培養(yǎng))過程中發(fā)生衰老和向成骨細(xì)胞自主分化、增殖能力減退、抗炎能力降低，嚴(yán)重影響了MSCs的治療效果。

殼聚糖是廣泛存在于大自然界中的甲殼素衍生物，具有無免疫原性、低毒性、高生物相容性的特點(diǎn)，殼聚糖大分子和膠原大分子之間有很好的相容性，能夠發(fā)生相互交聯(lián)作用。殼聚糖薄膜(chitosan membrane，CM)上培養(yǎng)的MSCs的遷徙性和干性關(guān)鍵基因的表觀遺傳狀態(tài)的改變已經(jīng)被證實(shí)，某些遷徙相關(guān)細(xì)胞表面受體的mRNA表達(dá)顯著增加[5]，干性相關(guān)基因如Oct4、Sox2和Nanog的mRNA表達(dá)水平顯著高于常規(guī)培養(yǎng)的MSCs[6]。這些結(jié)果提示殼聚糖薄膜培養(yǎng)的MSCs在維持其干性、歸巢能力等方面明顯優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)的MSCs，殼聚糖薄膜培養(yǎng)對(duì)MSCs的表觀遺傳狀態(tài)產(chǎn)生了影響。表觀遺傳狀態(tài)的變化可能影響其抗炎基因的表達(dá)和維持，并影響MSCs的抗炎特性。本文旨在探討殼聚糖薄膜培養(yǎng)對(duì)人臍帶 MSCs抗炎相關(guān)基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討CM培養(yǎng)的MSCs在OA軟骨修復(fù)中的作用奠定基礎(chǔ)，為OA的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 殼聚糖薄膜的制備

制備殼聚糖薄膜的方法見李華杰等[5]的研究方法。

1.2 原代MSCs 的培養(yǎng)

獲得P1代MSCs作為種子細(xì)胞的方法見李華杰等[5]的研究方法。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)組：將MSCs P1代細(xì)胞以3×105/孔接種于底部覆蓋CM的六孔板；對(duì)照組：MSCs P1代細(xì)胞以同樣密度接種于普通平板六孔板中。兩種培養(yǎng)方式均使用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱。觀察細(xì)胞形態(tài)，收集接種3 d后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)定量Real-time PCR檢測(cè)

將收集后的細(xì)胞進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)MSCs抗炎基因LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1、IL1RN、IL-4、IL-13mRNA的表達(dá)水平。細(xì)胞用Trizol法提取總RNA，用基因擴(kuò)增儀逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，每個(gè)樣本加入3個(gè)復(fù)孔；Real-time PCR程序如下：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 40 s；溶解95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。選取管家基因β-Actin作為內(nèi)參，使用ABI 7500軟件2-ΔΔct法處理數(shù)據(jù)，將對(duì)照組基因表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理，用柱形圖表示實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)，Real-time PCR引物序列見表1。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study.

1.5 蛋白印跡法(Western blot)

采用Western blot法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組MSCs抗炎相關(guān)基因LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1、IL1RN、IL-4、IL-13蛋白的表達(dá)，β-Actin作為對(duì)照。

1.6 免疫熒光檢測(cè)

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將成球培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞懸液滴加至蓋玻片上，置于5%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)至細(xì)胞固著。加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)約6 h。然后用4%多聚甲醛固定。待爬片稍干后用組化筆在蓋玻片中間細(xì)胞分布均勻的位置畫圈，加破膜工作液，室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。在圈內(nèi)滴加3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育20 min，將爬片置于PBS中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。待爬片稍干后在圈內(nèi)滴加一抗覆蓋細(xì)胞，平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。將爬片置于PBS中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。稍甩干后在圈內(nèi)滴加二抗覆蓋細(xì)胞，室溫孵育50 min。PBS洗3次，每次5 min。每孔內(nèi)滴加DAPI染液，室溫孵育5 min,PBS洗3次，每次5 min。滴加抗熒光淬滅劑于細(xì)胞上，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 平板培養(yǎng)和CM培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示，平板培養(yǎng)組(對(duì)照組)MSCs貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)為成纖維細(xì)胞樣，增殖后聚集成簇，在CM作為底物的培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)組)條件下，MSCs為懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)。早期MSCs呈單個(gè)球體懸浮于CM表面，大約1 d后MSCs開始在CM表面自發(fā)聚集為多細(xì)胞球形體，并進(jìn)行性增大。

圖1 平板培養(yǎng)和CM培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphological observation of MSCs cells cultured in plate and CM.注：A、B分別為對(duì)照組培養(yǎng)3 d時(shí)40倍和100倍視野下的細(xì)胞形態(tài)；C、D分別為實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)3 d時(shí)40倍和100倍視野下的細(xì)胞形態(tài)。

2.2 CM培養(yǎng)對(duì)MSCs抗炎相關(guān)基因表達(dá)的影響

CM培養(yǎng)的MSCs抗炎相關(guān)基因IL-4、IL-13、LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1、IL1RN的表達(dá)水平較常規(guī)培養(yǎng)組增加，差異顯著(P<0.01)。其中STC-1、IL-13、IL1RN基因表達(dá)量相對(duì)于平板培養(yǎng)增加超過40倍(圖2)。

圖2 CM組與平板培養(yǎng)組 MSCs mRNA 的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)Fig.2 Relative expression multiple of MSCs mRNA in CM and plate.

2.3 免疫熒光觀察

CM培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)組)和平板培養(yǎng)(對(duì)照組)中待檢測(cè)的COX-2、IL-4、IL-10、ILF基因表達(dá)的蛋白位于細(xì)胞內(nèi)，屬于內(nèi)源性蛋白。而實(shí)驗(yàn)組中COX-2、IL-4、IL-10、ILF基因表達(dá)的蛋白量比對(duì)照組高，說明CM培養(yǎng)有利于MSCs 中COX-2、IL-4、IL-10、ILF基因的表達(dá)(圖3)。

圖3 平板培養(yǎng)和CM培養(yǎng)的MSCs中相關(guān)蛋白的分布情況Fig.3 Distribution of related protein in MSCs cultured in plate and CM.

2.4 CM培養(yǎng)對(duì)MSCs抗炎相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

與常規(guī)培養(yǎng)組MSCs抗炎相關(guān)基因IL-4、IL-13、LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1、IL1RN蛋白的表達(dá)水平比較，CM培養(yǎng)組蛋白的表達(dá)水平顯著增高(圖4)。

圖4 CM和平板培養(yǎng)的MSCs抗炎相關(guān)基因蛋白的相對(duì)表達(dá)情況Fig.4 Relative expression of anti-inflammatory related genes cultured in CM and plate.注：實(shí)驗(yàn)組為CM培養(yǎng)，對(duì)照組為常規(guī)平板培養(yǎng)。

3 討論

OA病理變化涉及形成關(guān)節(jié)的所有組織，其發(fā)展過程中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織具有不同嚴(yán)重程度的炎癥反應(yīng)，關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥導(dǎo)致關(guān)節(jié)的破壞。研究認(rèn)為，免疫系統(tǒng)參與OA的發(fā)生發(fā)展，是OA發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵要素之一[7]。在OA的進(jìn)展過程中，各種細(xì)胞因子其產(chǎn)生和發(fā)揮作用可以根據(jù)疾病的持續(xù)時(shí)間和嚴(yán)重程度而變化[8]。細(xì)胞因子最重要的作用是干擾分解代謝和合成代謝過程，尤其是在經(jīng)常承受高機(jī)械負(fù)荷的組織中，例如人體關(guān)節(jié)[9]。由于合成和分解代謝的平衡遭到破壞，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性退化，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的持續(xù)發(fā)展。由于細(xì)胞因子在OA等炎癥性疾病中的作用，它們可分為炎癥性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子[10]。在OA的發(fā)生發(fā)展中，即包括對(duì)組織有損害的炎癥分解代謝過程，也包括對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用的抗炎合成代謝過程，這些過程由各種炎癥和抗炎因子介導(dǎo)完成。OA發(fā)生病理生理過程主要由炎性細(xì)胞因子和其他增強(qiáng)分解代謝作用的介質(zhì)介導(dǎo)[7]。但是，不應(yīng)低估調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)并對(duì)關(guān)節(jié)組織起保護(hù)作用的抗炎細(xì)胞因子的作用。OA中常見的抗炎基因包括IL-4、IL-13、LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1、IL1RN。

MSCs具有多向分化潛能，因?yàn)槠湟子诜蛛x、體外培養(yǎng)的增殖能力強(qiáng)、免疫抑制特性、可塑性、自分泌和旁分泌介導(dǎo)的效應(yīng)、向受損部位遷徙能力以及表型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)使其成為治療OA的研究熱點(diǎn)[11,12]。MSCs是一種重要的參與組織再生的細(xì)胞庫，可遷移至損傷部位，在局部微環(huán)境作用下，定向分化為某一特定類型的功能細(xì)胞直接參與組織損傷修復(fù)過程，同時(shí)又能分泌多種生物活性物質(zhì)，包括細(xì)胞因子及細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，起到改善損傷部位再生微環(huán)境、抑制局部炎癥的作用[13]。MSCs具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)和抗炎特性，并具有多向分化潛力，而其低免疫原性又為其應(yīng)用于臨床治療提供了安全性保障，使其在炎性關(guān)節(jié)炎的治療中具有一定的應(yīng)用前景[14]。研究證實(shí)，關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSCs能夠治療早期關(guān)節(jié)炎，并對(duì)關(guān)節(jié)軟骨有保護(hù)作用，同時(shí)還能增加某些抗炎相關(guān)基因和軟骨保護(hù)因子的表達(dá)[15]。

研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)擴(kuò)增后的MSCs在臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的存活率較低，且生物活性與治療效果均不佳[16]。MSCs的分裂或分化與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)，微環(huán)境中的細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、蛋白等均對(duì)MSCs的分化有影響[17]。研究證實(shí)，三維細(xì)胞培養(yǎng)能夠生成多細(xì)胞球形體，并可重現(xiàn)體內(nèi)微環(huán)境和相關(guān)生理活動(dòng)[18]。因此，三維培養(yǎng)的MSCs較傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)的MSCs具有更強(qiáng)的生物功能和治療效果[19]。本研究的培養(yǎng)結(jié)果也顯示，CM三維培養(yǎng)較常規(guī)平板二維培養(yǎng)更有助于維持MSCs抗炎相關(guān)基因的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，利用CM培養(yǎng)MSCs能夠克服平板培養(yǎng)的缺點(diǎn)，表現(xiàn)為MSCs附在CM上可以形成類球形體，類似懸滴培養(yǎng)的3D培養(yǎng)模式，其轉(zhuǎn)化效率顯著加強(qiáng)[20]。研究表明，附著在CM上的MSCs可以自組裝形成三維細(xì)胞球形體[21]。在這一過程中，MSCs在CM上附著和擴(kuò)散，然后收縮偽足形成多細(xì)胞球體，這種聚集過程與懸浮或懸滴培養(yǎng)的形成機(jī)制完全不同[22]。研究發(fā)現(xiàn)，在CM上形成類球狀體與某些基因或蛋白的參與有關(guān)，包括鈣粘素分子[23,24]、RHO/ROCK 激酶通路[21]和Wnt分子[24]。雖然觀察到一些基因、蛋白表達(dá)的變化，但在CM上形成球體的確切機(jī)制還未闡明。

采用三維(3D)懸浮培養(yǎng)MSCs能夠形成多細(xì)胞球體，能夠?qū)SCs的表觀遺傳狀態(tài)產(chǎn)生影響，能夠提高M(jìn)SCs的抗炎特性[25]。CM上培養(yǎng)的MSCs能夠形成多細(xì)胞球體，MSCs的抗炎相關(guān)基因的表達(dá)也會(huì)受影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗炎相關(guān)基因IL-4、IL-13、LIF、IL6ST、IL-10、TSG6、COX-2、STC-1和IL1RN的表達(dá)水平與常規(guī)平板培養(yǎng)比較顯著增高，表明CM培養(yǎng)的MSCs多細(xì)胞球體的形成更有助于維持MSCs抗炎相關(guān)基因的表達(dá)。

綜上所述，與常規(guī)平板培養(yǎng)比較，CM培養(yǎng)有助于維持MSCs抗炎相關(guān)基因的表達(dá)，能夠增強(qiáng)MSCs的抗炎特性。