除草劑2,4-D降解菌株的分離、篩選與鑒定

栗旭陽, 黃麗玲, 郭倩楠, 高如雨, 張 維, 陳 明, 陸 偉, 周正富

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

除草劑主要應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中雜草的控制和防除，是目前造成環(huán)境污染的主要途徑之一。2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是人工合成的一種激素類的植物生長調(diào)節(jié)劑，高劑量2,4-D具有除草劑特性，廣泛應(yīng)用于多種單子葉作物生產(chǎn)中，如水稻、小麥、高粱、甜蔗和玉米中來進(jìn)行闊葉雜草的防除[1]。2,4-D是一種中等持久性化學(xué)物質(zhì)，半衰期(T1/2)為20～312天[2,3]。近幾年，隨著2,4-D的使用量逐年增大，其對人類與環(huán)境造成的危害也逐年增加。噴施于地表的除草劑會(huì)滲透到土壤以及地下水中[4]，由于2,4-D的低吸附性和水中的高溶解性，2,4-D通?？梢栽诘叵滤偷乇硭斜粰z測到[5～7]。研究表明，地表殘留的2,4-D大約91.7%會(huì)進(jìn)入到水中[8]。這將會(huì)對植物和動(dòng)物的生長造成嚴(yán)重威脅。此外，除草劑也會(huì)通過河流等進(jìn)入水體資源中，從而影響水生動(dòng)植物的生存。

土壤中2,4-D的降解是一個(gè)逐步衰減過程，其受到非生物作用和生物作用的共同影響。不同的土壤成分以及微生物群落對2,4-D的降解起到了關(guān)鍵作用[9]。2,4-D 的生物降解過程已經(jīng)通過降解菌株進(jìn)行了詳細(xì)研究[10]。目前已報(bào)道的具有2,4-D降解能力的細(xì)菌菌株主要為α-、β-、γ-型變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌/綠菌門(Bacteroidetes/Chlorobi)[11]細(xì)菌。在變形菌門中，根據(jù)降解途徑及參與基因的不同分以下三類：第一類主要為生長較快的β-和γ-型變形菌門細(xì)菌，包括無色桿菌屬(Achromobacter)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、鹽單胞菌屬(Halomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和多噬菌屬(Variovorax)等。其主要由α-酮戊二酸(α-KG)依賴型TfdA基因參與2,4-D降解的起始反應(yīng)[12]。第二類主要為生長較慢的貧營養(yǎng)型α-變形菌門細(xì)菌，如慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)[11]等。主要由tfd-like和tfdAα基因參與2,4-D側(cè)鏈基團(tuán)斷裂的起始反應(yīng)，生成4-氯苯氧基乙酸。第三類也屬于α-變形菌門，主要包含鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、食酸代爾夫特菌屬(Delftia)和紅球菌屬(Rhodococcus)菌株，包含cadRABKC降解基因簇[13,14]。

目前細(xì)菌中的2,4-D降解途徑主要分為兩種。第一種為2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)降解途徑，即通過α-酮戊二酸依賴性2,4-D雙加氧酶(TfdA)，去除2,4-D側(cè)鏈基團(tuán)生成2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)，隨后2,4-DCP通過2,4-DCP羥化酶(TfdB)羥化形成二氯鄰苯二酚，再依次通過鄰位裂解雙加氧酶(TfdC)、氯代環(huán)異構(gòu)酶(TfdD)和氯代水解酶(TfdE)的作用，逐步代謝后進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)；第二種代謝途徑為4-氯苯氧基乙酸降解途徑，通過利用2,4-D脫鹵素酶的脫氯作用，使2,4-D轉(zhuǎn)化為4-氯苯氧基乙酸，隨后依次通過2,4-DCP羥化酶、4-氯代雙加氧酶、氯粘蛋白環(huán)異構(gòu)酶的作用下進(jìn)入TCA循環(huán)[14]。目前多數(shù)研究表明2,4-D的細(xì)菌降解途徑中主要的初級代謝產(chǎn)物是2,4-DCP，且其除草毒性與2,4-D相比降低了近100倍。

國際上對于除草劑的微生物降解已有大量研究報(bào)道，主要圍繞降解菌株的分類篩選以及代謝途徑進(jìn)行研究，但目前許多分離的降解菌株存在一定的局限性、代謝途徑的研究也不夠全面與徹底。近年研究顯示，土壤微生物中存在更多參與2,4-D降解的酶及其編碼基因，表明目前對于2,4-D生物降解的了解仍然有限，因此從土壤中分離高效降解菌株并研究其降解途徑，對新型降解功能基因的開發(fā)具有重要的理論及實(shí)際意義。本研究通過富集培養(yǎng)的方法，用以2,4-D為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基從2,4-D污染土壤樣品中篩選2,4-D耐受以及降解菌株并分類，對降解能力以及初級代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定。為降解菌株中關(guān)鍵降解基因的克隆奠定了研究基礎(chǔ)，也為2,4-D殘留污染的生物修復(fù)以及轉(zhuǎn)基因作物育種提供了菌種和基因資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本實(shí)驗(yàn)土壤樣品采集于廣西省桂林市靈川縣(23°N 110°E)和江蘇省南京市中山陵(32°N 118°E)地區(qū)的農(nóng)田，該地區(qū)長期施用草甘膦和2,4-D等除草劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

2,4-D母液：稱取1.600 g 2,4-D(分析純，純度99%)逐漸溶解于20 mL的色譜甲醇中，配制成80 g/L的母液。

其他試劑：20 mmol/L(pH 6.75)MOPS,200 μmol/L (NH4)2Fe(SO4)2,200 μmol/L維生素C酸鈉,緩沖液Buffer(pH 10.0),2% 4-氨基安替比林,8%鐵氰化鉀,2,4-DCP(100 mmol/L)，配制方法參考Itoh[11]等。

細(xì)菌DNA提取試劑盒(HiPure Bacterial DNA kit)購于Magen公司。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基和微量金屬鹽培養(yǎng)基用于除草劑2,4-D耐受以及降解菌株的篩選和鑒定，其中無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基和微量金屬鹽培養(yǎng)基的配制參考衛(wèi)亞紅等[15]的方法。LB培養(yǎng)基用于除草劑耐受菌株的培養(yǎng)和純化。30℃進(jìn)行菌株的篩選與分離，每組設(shè)定3個(gè)平行。

1.4 2,4-D降解菌株的富集培養(yǎng)

取1 g土壤樣品，加入到20 mL含50 mg/L 2,4-D和50 mg/L葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30℃ 200 r/min 搖瓶培養(yǎng)5 d。吸取1 mL土壤培養(yǎng)基混合液繼續(xù)重復(fù)轉(zhuǎn)接2次，連續(xù)富集菌株。而后將培養(yǎng)基中2,4-D終濃度提高到100 mg/L，30℃ 200 r/min搖瓶培養(yǎng)，且以2,4-D為唯一碳源，轉(zhuǎn)接3～4次。

1.5 降解菌株的分離純化以及耐受菌株的篩選

吸取200 μL富集后的培養(yǎng)液上清涂布于不同2,4-D濃度梯度的無碳無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，無機(jī)鹽培養(yǎng)基的2,4-D終濃度分別為1～8 g/L。30℃培養(yǎng)，挑取長勢良好的菌落在LB瓊脂培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線3次，純化為單菌落，收集單菌落保存于終濃度為20%的甘油中。

1.6 降解菌株的16S rDNA測定

將冷凍保藏菌株劃線接種于LB平板，30℃活化過夜。挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃ 200 r/min培養(yǎng)，提取篩選菌株的基因組DNA。利用細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序分析，EZbiocloud網(wǎng)站進(jìn)行序列比對，鑒定菌株種屬。基因組DNA的提取方法均按常規(guī)方法操作[16]。

1.7 降解菌株代謝產(chǎn)物中2,4-DCP的檢測

2,4-DCP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法見Itoh[11]等。利用MOPS/MSM溶液制備2,4-DCP標(biāo)準(zhǔn)品溶液，終濃度分別為100 μmol/L、200 μmol/L、300 μmol/L、400 μmol/L。分別取不同濃度的2,4-DCP標(biāo)準(zhǔn)品150 μL，依次加入15 μL Buffer(pH 10.0)、1.5 μL 4-氨基安替比林、1.5 μL鐵氰化鉀，反應(yīng)10～15 min，測定OD510，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將菌株轉(zhuǎn)接于以2,4-D為唯一碳源且終濃度為50 mg/L的MSM培養(yǎng)基中，30℃ 200 r/min搖瓶培養(yǎng)3～4 d，以24 h為時(shí)間間隔進(jìn)行取樣，分別測定其OD600、4-aminoantipyrine method顯色反應(yīng)條件下的OD510，即取150 μL菌液加入反應(yīng)液，反應(yīng)10～15 min后測定OD510，通過顯色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)測定2,4-DCP生成量。同時(shí)取樣5 mL進(jìn)行HPLC檢測菌株降解能力，取樣1 mL進(jìn)行LC/MS檢測其可能的代謝產(chǎn)物。通過在MSM無機(jī)鹽培養(yǎng)基和MOPS溶液中測定標(biāo)準(zhǔn)品在不同濃度梯度下的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過OD510的測定計(jì)算菌株培養(yǎng)液中2,4-DCP的含量變化情況，從而計(jì)算2,4-D的轉(zhuǎn)化效率及其降解能力。

1.8 高效液相色譜法檢測菌株對2,4-D的降解能力

取樣5 mL，加入等體積乙酸乙酯混勻，靜置幾分鐘，吸取上層溶液，離心濃縮蒸干后，用甲醇：水=1∶1(V/V)溶液溶解并定容到5 mL，取樣進(jìn)行HPLC檢測。流動(dòng)相溶液為乙腈:水(含0.5%冰乙酸)=60∶40(V/V)，流速：1.0 mL/min，檢測波長：λ=230 nm，柱溫：40℃。

1.9 代謝產(chǎn)物初步分析

利用LC-QTOF對具有2,4-D降解能力的菌株進(jìn)行檢測，取樣1 mL 12 000 r/min 離心10 min，再通過0.22 μm孔徑濾膜后上樣檢測分析。利用LC-QQQ全掃描質(zhì)譜通過提取差異峰并與2,4-D、2,4-DCP標(biāo)準(zhǔn)品比較，推測初級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌株的篩選和分離

通過以2,4-D為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，觀察其菌落形態(tài)。共分離得到85株菌，提取菌株基因組DNA進(jìn)行菌株的16S rDNA序列測定與菌種鑒定分析。

2.2 功能菌株的16S rDNA序列分析以及2,4-D耐受能力分類

將篩選菌株的16S rDNA序列在EZbiocloud上進(jìn)行序列比對分析，同時(shí)將篩選分離得到的功能菌株涂布于以不同濃度2,4-D為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上進(jìn)行耐受能力的分類測定，整理分離的85株菌株的種屬信息以及耐受能力如表1所示，各種屬菌株數(shù)量及所占比例如圖1所示，由圖1和表1分析可知，分離篩選到85株菌分屬于13種屬，包括23株假單胞菌(Pseudomonassp.)、16株芽孢桿菌(Bacillussp.)、7株賴氨酸桿菌(Lysinibacillussp.)、5株類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)、19株短桿菌(Brevibacillussp.)、2株沙雷氏菌(Serratiasp.)、2株甲基桿菌(Methylobacteriumsp.)、5株貪銅菌(Cupriavidussp.)、1株紅球菌(Rhodococcussp.)、 2株拉恩氏菌(Rahnellasp.) 、1株葡萄球菌(Staphylococcussp.)、1株阿氏腸桿菌 (Enterobactersp.)、1株分支桿菌 (Mycobacteriumsp.)。耐受較高2,4-D濃度的菌株主要為假單胞菌 (Pseudomonassp.)，少量為阿氏腸桿菌(Enterobactersp.)、貪銅菌 (Cupriavidussp.)和類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)。其中假單胞菌屬(Pseudomonas)細(xì)菌所占比例最大，耐受能力普遍較高(1～8 g/L)。

表1 除草劑2,4-D分離菌株種屬鑒定及耐受能力分類Table 1 The identification and classification of 2,4-D tolerant strains.

注：不同數(shù)量“+”所代表耐受濃度分別為：“+”: 100 mg/L～1 g/L; “++”: 1～3 g/L; “+++”: 4～6 g/L; “++++”: 7～8 g/L。

圖1 2,4-D耐受菌株種屬分類Fig.1 Classification of strains corresponding to the 2,4-D tolerance.

2.3 菌株初級代謝產(chǎn)物2,4-DCP的測定

分別在MSM無機(jī)鹽培養(yǎng)基和MOPS中測定標(biāo)準(zhǔn)品在不同濃度梯度下的吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2所示，通過以24 h為時(shí)間間隔測定OD510，分析各菌株培養(yǎng)液中2,4-DCP含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，已進(jìn)行測定的菌株中，有11株菌培養(yǎng)液中2,4-DCP含量較高，其中最高的4株菌測定結(jié)果如表2所示。

2.4 菌株2,4-D降解能力測定

對以上4株功能菌株的降解能力進(jìn)行檢測，以不加菌株的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(2,4-D終濃度為50 mg/L)作為對照，利用HPLC進(jìn)行檢測。以相同時(shí)間間隔取樣測定OD600，分析菌株生長情況，同時(shí)取樣進(jìn)行HPLC檢測，根據(jù)液相色譜圖峰值積分可計(jì)算培養(yǎng)72 h后的2,4-D的利用率。測定結(jié)果如圖3所示，由圖可知菌株在2,4-D為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長良好，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)基中的2,4-D含量逐漸降低，其中培養(yǎng)72 h后菌株不再生長，根據(jù)HPLC檢測的積分結(jié)果計(jì)算可知菌株L1、L2、L4和L6在培養(yǎng)72 h后2,4-D的利用率分別為17.3%、38.97%、49.02%和28.07%。

圖2 2,4-DCP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of 2,4-DCP.A: MSM無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的標(biāo)準(zhǔn)曲線; B:MOPS培養(yǎng)基中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

時(shí)間(h)04812162432364048546072CK0.020.1040.1030.100.1100.1130.110.110.100.0090.0090.100.11L10.050.0550.130.1350.160.210.360.650.455004050.2950.340.355L20.040.110.1250.3850.450.5150.620.7350.610.5150.390.430.425L40.0520.010.250.3350.4220.6450.7250.7750.5250.4150.2050.340.37L60.0630.01150.1050.2750.3150.430.530.6050.5150.390.190.2950.35

2.5 菌株降解產(chǎn)物初步分析

2.5.12,4-D標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 優(yōu)化2,4-D的LC-MS檢測條件，標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖4所示。

2.5.2LC-MS-QTOF檢測結(jié)果分析 利用MRM模式以兩對離子對為參照，對以上4株菌株進(jìn)行檢測。根據(jù)質(zhì)譜圖分析可知色譜圖中兩個(gè)定性離子對峰面積相對于CK均有一定程度的降低。繼續(xù)進(jìn)行LC-MS-QTOF全掃描檢測其可能的代謝產(chǎn)物及結(jié)構(gòu)，提取差異峰分子量如表3所示，由表3可知紅色部分為四種主要的成分分子量，分別為89.006 3、124.983 7、160.960 9 和218.968 3，利用Chemisketch、Pubchem軟件計(jì)算并推測其主要化學(xué)結(jié)構(gòu)(表4)，由于LC-MS-QTOF負(fù)離子模式檢測，推測可知4種主要代謝產(chǎn)物分別為苯酚、4-氯苯氧基乙酸、2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。

由表4可知，4株功能菌株培養(yǎng)液的質(zhì)譜檢測結(jié)果中2,4-DCP的色譜峰均為除2,4-D外的差異峰主峰，因此推測4株功能菌株降解2,4-D的主要途徑為2,4-DCP。同時(shí)在L1、L4和L6培養(yǎng)液中還分別存在苯酚、4-氯苯氧基乙酸成分峰，由此推測上述菌株中不僅存在2,4-DCP降解途徑，同時(shí)也可能存在脫鹵降解途徑，這一結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.6 降解菌株系統(tǒng)進(jìn)化分析

對篩選得到的4株降解菌株的16S rDNA序列進(jìn)行功能進(jìn)化分析，菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖5～8所示。菌株L1、L2、L4和L6分屬于阿氏腸桿菌屬(Enterobacter)、 紅球菌屬(Rhodococcus)、貪銅菌屬(Cupriavidus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。通過進(jìn)行同源性分析，菌株L1為阿氏腸桿菌屬(Enterobacter)，與菌株Enterobacterasburiae具有較高的同源性(98.87%)，菌株L2為紅球菌屬，與菌株Rhodococcuskroppenstedti具有較高同源性(98.2%)，菌株L4為貪銅菌屬，與菌株Cupriaviduspampae具有較高同源性(97.93%)，菌株L6為假單胞菌屬，與菌株P(guān)seudomonasputida具有最高同源性(98.92%)。研究表明，紅球菌屬、貪銅菌屬和假單胞菌屬均被報(bào)道具有除草劑及多苯環(huán)芳香烴降解能力，推測其中含有除草劑降解基因。

3 討論

本文共分離篩選到85株菌，16S rDNA分析顯示，這些菌分屬13個(gè)種屬，表明經(jīng)過2,4-D長期馴化后田間土壤中廣泛存在2,4-D耐受(降解)菌株。近年來又發(fā)現(xiàn)多種降解菌株：2012年分離到的代爾夫特菌屬(Delfitia)菌株可以在24 h內(nèi)降解100 mg/L 2,4-D[17]；2014年和2015年分別于日本、北京和阿根廷分離到3株具有2,4-D降解能力的貪銅菌屬(Cupriavidus)細(xì)菌，分別命名為：Cupriavidussp. CY-1[18]、CupriaviduscampinensisBJ71[19]和Cupriavidusnecatorstrain N-1[20]；2015年分離到新鞘氨醇桿菌(Novosphingobiumstrain DY4)，可在5 d內(nèi)能夠降解2,4-D[21]；2016年González等[22]報(bào)道伯克霍爾德菌(Burkholderia)和分支桿菌屬(Mycobacterium)細(xì)菌具有2,4-D降解能力；已報(bào)道在土壤和活性污泥的混合物中分離到兩株無色桿菌屬(Achromobacter)細(xì)菌能夠在18 d內(nèi)降解144mg/L的2,4-D[23,24]。

本實(shí)驗(yàn)篩選所得的2,4-D耐受菌株中亦含有多株假單胞菌屬(Pseudomonas)、貪銅菌屬(Cupriavidus)和分支桿菌屬(Mycobacterium)的細(xì)菌，推測以上3個(gè)種屬細(xì)菌可能含有具有2,4-D降解能

圖3 功能菌株的生長情況和2,4-D降解能力測定Fig.3 The growth curve and the degradation ability of 2,4-D.注：A,C,E,G:分別為菌株L1、L2、L4、L6的生長情況；B,D,F,H:分別為菌株L1、L2、L4和L6對2,4-D的降解能力測定。

圖4 2,4-D標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4 The 2,4-D standard curve and chromatogram.注：A: 2,4-D標(biāo)準(zhǔn)曲線；B: 1 000 bbp 2,4-D標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。

菌株名稱保留時(shí)間(min)提取代謝產(chǎn)物分子量L12.11889.0063225.1671233.1116239.1488241.09016.619115.9237160.9609218.9675303.9494514.3388583.2965L22.144153.0708165.9835233.1116.545115.9242160.9615218.9683514.3399583.2961L42.14589.0035233.11123.245115.9228124.9837195.1193226.167241.1617323.127429.20226.212115.5244160.9613218.9689514.3359583.2973L61.79124.969164.0731475.2536528.16536.074115.9242160.9611218.9683303.9482514.3406583.2966

表4 降解菌株代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)分析Table 4 The possible structure of metabolite from functional strains.

圖5 菌株L1的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic analysis of strains L1.

圖6 菌株L2的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.6 Phylogenetic analysis of strains L2.

力的酶和基因。同時(shí)，根據(jù)菌株耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，假單胞菌屬具有較強(qiáng)的除草劑耐受能力，目前已有研究報(bào)道，假單胞菌是一種易于接受質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的細(xì)菌，其中菌株P(guān)seudomonasputida中存在pJP4質(zhì)粒，該質(zhì)粒能夠以多種微生物作為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)移，是一類廣宿主且具有自轉(zhuǎn)移能力的質(zhì)粒[25,26]。 Aspray等[27]對pJP4質(zhì)粒在污染土壤中的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)pJP4質(zhì)粒主要轉(zhuǎn)移到伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)中，其均含有具有2,4-D降解能力的tfd基因簇[28]，因此推測在2,4-D持續(xù)選擇壓力下，降解質(zhì)粒轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致土壤中假單胞菌具備2,4-D降解能力的主要原因。目前已有研究報(bào)道假單胞菌是一種易于接受質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的細(xì)菌，其中Pseudomonasputida攜帶質(zhì)粒 pJP4，pJP4質(zhì)粒能夠以多種微生物作為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)移，是一類廣宿主且具有自轉(zhuǎn)移能力的質(zhì)粒[29,30]。 Aspray 等[ 31]對 pJP4質(zhì)粒在污染土壤中的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn) pJP4質(zhì) 粒 主 要 轉(zhuǎn) 移 到Burkholderia、Ralstonia和Pseudomonas菌屬中。其上含有編碼2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)降解功能的基因簇(tfd)，因此推測在2,4-D持續(xù)選擇壓力下，降解質(zhì)粒轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致土壤中假單胞菌具備2,4-D降解能力的主要原因。

圖7 菌株L4的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.7 Phylogenetic analysis of strains L4.

圖8 菌株L6的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.8 Phylogenetic analysis of strains L6.

通過初級代謝產(chǎn)物測定實(shí)驗(yàn)共分離到4株降解菌株，其分屬于阿氏腸桿菌屬(Enterobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、貪銅菌屬(Cupriavidus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。目前已經(jīng)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道：假單胞菌屬細(xì)菌可降解苯酚[32]、2,4-D、氯酚[33]、烷基磺酸鹽[34]、多環(huán)芳烴[35]、甲苯[36]和苯氧乙酸[37]等；紅球菌屬細(xì)菌可降解氯代硝基苯[38]和二噁英[39]等；近年來已有較多文獻(xiàn)報(bào)道貪銅菌屬細(xì)菌具有較強(qiáng)的芳香族烴類除草劑降解特性[40]。但菌株L1為阿氏腸桿菌屬細(xì)菌，本研究可知其具有較高的2,4-D耐受能力，但目前并未有文獻(xiàn)報(bào)道其具有除草劑降解能力，對該菌降解2,4-D的代謝途徑及相關(guān)基因還需進(jìn)一步研究。

2,4-D導(dǎo)致的土壤污染給環(huán)境污染防治工作帶來了新的挑戰(zhàn)，同時(shí)也促進(jìn)了環(huán)境微生物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展。目前大量研究表明利用土壤微生物對2,4-D進(jìn)行降解可以有效的解決除草劑污染問題，同時(shí)利用生物技術(shù)方法對具有降解2,4-D潛能的微生物進(jìn)行基因改造，這不僅可以增強(qiáng)對環(huán)境中污染物的降解能力，同時(shí)也為2,4-D殘留污染的生物修復(fù)以及轉(zhuǎn)基因作物育種提供菌種和基因資源。