吉陶單極蟲可分泌蛋白酶基因的克隆與生物信息學分析

張鳳麗, 楊雅麟*, 夏 銳, 高辰辰, 李 棟, 冉 超, 張 震, 張洪玲, 周志剛*

1.中國農業(yè)科學院飼料研究所, 農業(yè)農村部飼料生物技術重點實驗室, 北京 100081;2.中國農業(yè)科學院飼料研究所, 中國-挪威魚類消化道微生物聯(lián)合實驗室, 北京 100081

粘孢子蟲隸屬于粘體門、粘孢子綱，呈世界性分布，目前世界上己報道的魚類粘孢子蟲種類達2 100余種[1]，部分種類能導致嚴重的魚類病害。目前，粘孢子蟲的防治主要以化學藥物為主[2]，這種防治措施不僅對魚類危害較大，而且可能會存在藥物殘留。因此尋找在魚體無殘留、對魚類安全性高的藥物，對于水產健康養(yǎng)殖迫在眉睫。近年來，研究表明，寄生蟲的蛋白酶在寄生蟲感染以及寄生過程中起著重要的作用，首先，它們可能作為寄生蟲的一種毒力因子參與宿主-寄生蟲的相互作用，作為一種免疫抑制因子或者水解宿主的營養(yǎng)物質以使寄生蟲在宿主體內進行寄生生活等；另外，蛋白酶對于寄生蟲自身的生理學和發(fā)育也很重要。因此寄生蟲蛋白酶常被作為候選藥物的靶標[3]。

目前，研究較多的寄生蟲蛋白酶包括：半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶以及天冬氨酸蛋白酶[4]。Mottram等[5]通過對利什曼原蟲半胱氨酸蛋白酶突變體的研究發(fā)現(xiàn)，敲除半胱氨酸蛋白酶的突變體與野生型相比，對腹膜滲出細胞和雌性小鼠的感染率降低了80%，揭示了這種蛋白酶可能作為寄生蟲的一種毒力因子，對寄生蟲的感染力有至關重要的作用。瘧原蟲的半胱氨酸蛋白酶有一個非常復雜的結構域，其C末端存在與血紅蛋白結合的結構域，為瘧原蟲以血液為營養(yǎng)在宿主體內寄生提供了重要條件[6]。阿米巴原蟲的絲氨酸蛋白酶EhROM1能夠切割宿主細胞表面的凝集素，顯示絲氨酸蛋白酶可能是阿米巴原蟲一種重要的毒力因子，并且這種蛋白酶在寄生蟲的免疫逃避中發(fā)揮重要的作用[7]，弓形蟲的絲氨酸蛋白酶也有同樣的功能[8]。Yeoh等[9]通過對瘧原蟲裂殖子成熟過程蛋白酶的研究發(fā)現(xiàn)，一種名為PfSUB1的絲氨酸蛋白酶與裂殖子的成熟有關。Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲的天冬氨酸蛋白酶TgASP1是一種位于裂殖子尖端的膜蛋白，將其注射小鼠發(fā)現(xiàn)它能夠引發(fā)強烈的Th-1型細胞介導的免疫應答，且這種蛋白酶免疫接種小鼠后對于弓形蟲的感染具有一定的免疫保護性，能夠降低感染弓形蟲小鼠的死亡率。日本血吸蟲體內的組織蛋白酶以及天冬氨酸蛋白酶能夠降解血紅蛋白，從而為寄生蟲在宿主體內的生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質[11,12]；艾美球蟲的天冬氨酸蛋白酶能夠參與寄生蟲對宿主細胞的侵襲過程[13]?？梢?，寄生蟲的蛋白酶在入侵和感染宿主方面起著重要的作用，粘孢子蟲蛋白酶的研究對于粘孢子蟲的防治具有重要的現(xiàn)實意義。

實驗室前期對粘孢子蟲的轉錄組進行分析發(fā)現(xiàn)[14]，其與營自由生活的刺胞動物相比，與營養(yǎng)物質獲取特別是脂肪獲取有關的蛋白酶基因表達量顯著升高。且多數(shù)蛋白酶基因在營養(yǎng)和代謝途徑中發(fā)揮重要作用，尤其是水解酶類，這將成為新型藥物研制的靶標。因此，本研究在實驗室前期轉錄組研究的基礎上，分析了一些可分泌蛋白酶和抑制劑表達差異顯著的基因，并對分析得到的差異顯著的所有基因進行了克隆，通過對這些基因和蛋白進行生物信息學分析，對粘孢子蟲提取RNA，并進行逆轉錄得到cDNA，進而克隆獲得上述3個可分泌蛋白酶基因，并通過與pET28a進行同源重組，導入大腸桿菌BL21進行異源表達，并進行Western blotting鑒定，為后期粘孢子蟲可分泌蛋白酶與宿主魚相互作用的分子機制研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1粘孢子蟲與菌株 粘孢子蟲從感染的鯉魚腸道獲得，患病鯉魚來自天津武清魚塘。大腸桿菌EscherichiacoliTransI-T1、大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)購自北京全式金生物技術有限公司。pET28a載體為實驗室保存質粒。

1.1.2培養(yǎng)基、試劑與引物 LB培養(yǎng)基：1%NaCl，1%蛋白胨，0.5%酵母粉。固體LB培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂粉。培養(yǎng)基中卡那霉素的濃度為100 mg/L。TaKaRaTaq聚合酶購自北京寶日醫(yī)生物技術有限公司；KOD超保真聚合酶、Assembly Master Mix購于北京NEB公司；DNA純化試劑盒購于全式金生物技術有限公司；瓊脂糖、瓊脂粉、6×DNA Loading Buffer、IPTG 購于Thermo Scientfic公司；5×SDS-PAGE Loading Buffer購于Genestar公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、His-tag抗體、兔抗鼠二抗、HRP抗體稀釋液、DAB顯色試劑盒、高純度質粒大提試劑盒、蛋白定量試劑盒等產品購于天根生化科技(北京)有限公司；TGX Stain Free Fast Cas凝膠試劑盒購自 Bio-Rad公司；轉印儀、凝膠成像儀均為Bio-Rad公司儀器；PCR引物(表1)由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1粘孢子蟲蟲體的分離、DNA的提取與鑒定

患病鯉魚從形態(tài)上可觀察到：腹部膨脹，打開體腔可見前腸、中腸膨脹，充血發(fā)紅，體腔內有大小不等的圓形孢囊，剖開腸壁可見腸壁上有多處明顯的瘤塊狀突起，大小不一，黏連或者分散排布，這可能為粘孢子蟲在鯉魚腸道內的聚集體。用無菌剪刀在超凈工作臺剪開腸道，用2% SDS吹洗，10 000 r/min離心10 min；用10 mL PBS吹洗沉淀，10 000 r/min離心10 min，重復2次；得到乳白色沉淀即為粘孢子蟲吉陶單極蟲。用6 mL PBS重懸沉淀，分裝到3個2 mL EP管中，用于粘孢子蟲的形態(tài)觀察以及DNA和RNA的提取。

應用液氮研磨的方法提取粘孢子蟲基因組DNA，具體實驗方法參照Yap 以及Thompson等[15]對基因組DNA的提取方法。對粘孢子蟲的分類鑒定主要運用形態(tài)及其結合核編碼基因[16]以及保守序列核糖體小亞基18S rDNA[17～20]，因此，本研究主要通過對粘孢子蟲形態(tài)學的觀察結合18S rDNA對粘孢子蟲進行鑒定，以報道的粘孢子蟲的18S rDNA序列[21]為理論序列，用Primer 5.0設計18S rDNA F、18S rDNA R引物，以粘孢子蟲樣品中提取到的基因組DNA為模板進行擴增，以期擴增達到粘孢子蟲核糖體小亞基18S rDNA進行粘孢子蟲的分類鑒定。 PCR的程序為：94℃，2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min；72℃，10 min。以期擴增出粘孢子蟲的特異性序列18S rDNA，進而鑒定是否為粘孢子蟲。

1.2.2粘孢子蟲RNA的提取 Trizol法提RNA并反轉錄，取1 mg分離的粘孢子蟲加入1 mL的Trizol，勻漿器進行勻漿，樣品室溫放置5 min，使核蛋白復合物完全分離，4℃ 12 000 r/min離心10 min。再向漿液中加入200 μL三氯甲烷劇烈震蕩，再次勻漿。靜置5 min后離心，方法同上。將上清轉移至新的EP管中，加入等體積的異丙醇，緩慢顛倒混勻置于-20℃沉淀1 h。如上述方法離心，于超凈臺吹干后加入100 μL DEPC水。測定RNA的濃度后，按1 μg的量進行反轉錄。得到粘孢子蟲總RNA，保存-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3粘孢子蟲可分泌蛋白酶基因的克隆 通過前期實驗室轉錄組的測序與分析，得到吉陶單極蟲38個高表達的可分泌蛋白酶基因，通過提取的吉陶單極蟲的cDNA為模板，以38個基因的序列設計特異性的引物擴增目的基因片段，僅成功克隆出3個可分泌蛋白酶基因：TK Papain-1、TK Papain-2、TK Pepsin(其cDNA在NCBI中Gene ID分別為：KII64894.1、KII63832.1、KII63469.1)。對應的特異性引物分別為KII64894.1 F、KII64894.1 R、KII64894.1 F、KII64894.1 R、KII63469.1 F、KII63469.1 R(表1)。PCR 反應液的配制：2×PCR Buffer for KOD FX 25 μL、2 mmol/L dNTPs 10 μL、10 μmol/L Primer F 1.5 μL、10 μmol/L Primer R 1.5 μL、cDNA 1 μL、KOD FX(1.0 U/μL)1 μL，加水至總體系為 50 μL。 PCR的程序為：94℃ 1 min；94℃ 30 s，55℃(退火溫度視具體引物而定)30 s，72℃ 2 min；72℃ 1 min。反應結束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，用膠回收試劑盒回收基因產物，備用。

1.2.4粘孢子蟲可分泌蛋白酶基因的同源重組、轉化與鑒定 將上述4個樣品的PCR產物取4 μL，用PEASY-T3 cloning vector試劑盒，將基因片段克隆到T3載體上，挑取單克隆，以M13通用引物測序，驗證基因的正確性。并以同源引物HR-pET28a和HRKII63469.1、HRKII63832.1、HR KII64894.1分別擴增帶有同源片段的載體片段和目的基因片段，并用膠回收試劑盒回收上述擴增片段產物。NEB Assembly Master Mix試劑盒對上述基因片段和載體片段進行同源重組，得到重組質粒。將獲得的重組質粒轉入大腸桿菌TransI-T1感受態(tài)細胞，篩選陽性轉化子。進而提取質粒，轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，并鑒定得到含有上述目的基因的重組大腸桿菌BL21，用于后期異源表達的研究。

1.2.5粘孢子蟲可分泌蛋白酶的異源表達 將上述重組大腸桿菌BL21以1∶100的比例接種到LB液體培養(yǎng)基中，當OD600=0.6時，添加一定體積的濃度為1 mmol/L的IPTG，16℃誘導24 h。離心收集菌體，并收集細菌培養(yǎng)液，添加PBS緩沖液混勻，超聲破碎(超聲5 s，間隔5 s)10 min左右。超聲破碎后4℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清和沉淀。將破碎上清用2倍體積的丙酮沉淀，-20℃放置1 h，然后用PBS混勻，添加5×SDS-PAGE Loading Buffer制備上樣蛋白樣品，命名為SP。將菌體和破碎后的沉淀直接用PBS混勻，同上述方法制備上樣樣品，分別命名為C和IP，然后通過12%分離膠，4%的濃縮膠進行SDS-PAGE，檢測蛋白的表達情況。然后通過半干轉印儀轉移到PVDF膜上，用His-tag抗體作為一抗，兔抗鼠作為二抗，進行Western-blotting，最后用DAB顯色試劑盒顯色，以進行Western-blotting鑒定。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers and their sequences used in the study.

1.2.6粘孢子蟲可分泌蛋白酶的生物信息學分析 蛋白質分子質量及其等電點的預測用在線工具Expasy(https://web.expasy.org/compute_pi/)。用Signal IP 4.0預測基因信號肽序列的有無。HNN (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)預測蛋白的二級結構。用在線工具PredictProtein 預測二硫鍵的有無(https://www.predictprotein.org/)。應用Pfam(https://pfam.xfam.org/)預測蛋白酶的結構域。將基因編碼的氨基酸序列分別提交NCBI進行BlastP，將該蛋白與Non-redundant protein sequence(nr)數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列進行比對，找到可分泌蛋白酶在其他物種中的同源序列，用MEGA 7.0進行系統(tǒng)進化樹的構建。將找到的可分泌蛋白酶的同源序列進行Cluster W多序列比對和Espript 3.0找到該蛋白的motif。

2 結果與分析

2.1 粘孢子蟲形態(tài)及鑒定

對粘孢子蟲的形態(tài)進行觀察(圖1)，孢子呈瓜子形，前端尖細，后端鈍圓，前端致密的卵圓形結構為孢子內的極囊，一般情況下極絲呈螺旋狀盤繞在極囊內，在光鏡觀察下，有的孢子還釋放出細長的極絲，這與之前對粘孢子蟲的形態(tài)報道一致[22,23]。通過提取粘孢子蟲的基因組DNA對18S rDNA進行擴增，得到大小為750 bp的擴增產物。擴增的條帶大小接近于理論值(圖2)。并且對擴增結果進行測序，通過Blast比對，該18S rDNA序列與上述文獻報道的序列一致，確定為粘孢子蟲。

2.2 可分泌蛋白酶基因的克隆與異源表達

以提取的粘孢子蟲的cDNA為模板，成功克隆得到3個可分泌蛋白酶TK Papain-1、TK Papain-2、TK Pepsin基因。并以同源引物分別擴增得到的載體和目的基因的同源片段進行同源重組，得到重組質粒。然后PCR驗證，并進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖3)，基因的大小正確(基因大小分別為：KII64894.1：453 bp；KII63832.1：969 bp；KII63469.1：1 476 bp)，質粒構建成功。將構建好的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,獲得重組菌BL21(DE3)-TK Pepsin、重組菌BL21(DE3)-TK Papain-1、重組菌BL21(DE3)-TK Papain-2，用誘導劑IPTG對獲得的重組菌進行異源表達，對制備的蛋白上樣樣品，菌體蛋白C、可溶蛋白SP、沉淀蛋白IP進行12%的SDS-PAGE電泳(圖4)，發(fā)現(xiàn)TK Papain-1、TK Papain-2、TK Pepsin蛋白大小為17.6 kDa、36.7 kDa、55.4 kDa，與預測的蛋白大小基本一致。其中，TK Papain-1、TK Pepsin均以包涵體形式表達，TK Papain-2有微量可溶性蛋白表達。并且通過Western-blotting分析蛋白的表達情況發(fā)現(xiàn)，印跡條帶單一，說明大腸桿菌異源表達系統(tǒng)表達的蛋白酶無雜蛋白，并且Western-blotting分析所用一抗為His標簽抗體，單一條帶將有助于后期利用親和層析對蛋白酶進行純化。

圖1 粘孢子蟲光鏡圖片(40×)Fig.1 Light microscopy picture of Myxosporea Thelohanellus kitauei(40×).

圖2 粘孢子蟲吉陶單極蟲18S rDNA的PCR擴增產物Fig.2 18S rDNA PCR amplification product of Myxosporea Thelohanellus kitauei.注：1：粘孢子蟲18S rDNA PCR 擴增產物；M：DNA Marker。

圖3 粘孢子蟲吉陶單極蟲蛋白酶基因擴增產物的瓊脂糖電泳分析Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of amplification products of protease gene of Myxosporea Thelohanellus kitauei.注：1：KII64894.1基因擴增產物; 2： KII63832.1基因擴增產物; 3：KII63469.1基因擴增產物; M：DNA Marker。

2.3 粘孢子蟲可分泌蛋白酶的分子特征

通過生物信息學方法，對3個可分泌蛋白酶的理化特征、信號肽、二級結構特點進行了分析(表2)。Papain家族蛋白酶包括大多數(shù)的半胱氨酸蛋白酶，主要分布于溶酶體上，有的分布在胞質空間，與哺乳動物及寄生蟲等的消化過程有關，且在寄生蟲的侵染過程中有很關鍵的作用[24]。本研究通過SignalIP 4.1預測上述3個可分泌蛋白酶均具有信號肽序列，進一步確認了這些蛋白酶為粘孢子蟲體內的可分泌蛋白酶。用在線工具PredictProtein 預測發(fā)現(xiàn)，只有TK Papain-1氨基酸序列中存在二硫鍵。二硫鍵對于半胱氨酸蛋白酶家族成員的穩(wěn)定性和活性有至關重要的作用。有研究表明[25]，Papain C1A蛋白酶的折疊過程主要依賴分子伴侶和二硫鍵，進而形成兩個球狀的結構域，與底物結合。

通過對TK Papain-1、TK Papain-2構建進化樹(圖5A)，發(fā)現(xiàn)TK Papain-1、TK Papain-2二者的親緣關系最近，另與纖毛蟲及小瓜蟲的親緣關系較近，與肝片吸蟲的親緣關系較遠，這一結果與用基因組數(shù)據(jù)進行的系統(tǒng)發(fā)育學分析的結構有一致性[26]。通過將粘孢子蟲天冬氨酸蛋白酶TK Pepsin與其他物種的同源蛋白構建進化樹發(fā)現(xiàn)，其與?？退５挠H緣關系較近，與魚類的同源蛋白親緣關系較遠。這與此前文獻報道的粘孢子蟲在分類上與水螅[27]及?？鸞28]同屬于刺胞動物門且親緣關系較近的發(fā)現(xiàn)一致，同時與斑馬魚的親緣關系較遠具有一定的相關性[29]。

分析表明，TK Papain-1、TK Papain-2具有兩個保守的結構域：半胱氨酸蛋白酶保守的結構域(殘基：115～147，107～321)和組織蛋白酶前肽抑制劑結構域(殘基：36～91，28～83)。BlastP 比對發(fā)現(xiàn)TK Papain-1、TK Papain-2 均編碼半胱氨酸蛋白酶，與木瓜蛋白酶C1A家族成員高度相似，其中TK Papain-1與洗手缽海綿屬動物Geodia的組織蛋白酶相似性最高(序列同源性42.02%)，TK Papain-2與畢氏粗角猛蟻的組織蛋白酶L相似性最高(序列同源性44.12%)。Clustal W多序列比對發(fā)現(xiàn)TK Papain-1和TK Papain-2具有半胱氨酸蛋白酶的3個保守位點DWR、CGSCWAFS、GCNGG(圖6A)，這與文獻報道的組織蛋白酶L典型的保守位點CGSCYAFS、GCNGG有一致性[30]。在本研究中，保守位點CGSCYAFS在TK Papain-1、TK Papain-2序列中變成CGSCWAFS，此保守位點含有一個半胱氨酸殘基，形成潛在的二硫鍵。

通過對TK Pepsin構建進化樹(圖5B)，發(fā)現(xiàn)粘孢子蟲天冬氨酸蛋白酶與低等動物?？退５鹊挠H緣關系較近，與魚類的親緣關系較遠。分析表明，TK Pepsin具有天冬氨酸蛋白酶保守的結構域(殘基：64～420)。BlastP分析發(fā)現(xiàn)TK Pepsin與其他天冬氨酸蛋白酶家族成員高度相似，其中與圓頭珊瑚的β-分泌蛋白酶相似性最高(序列同源性47.8%)。Clustal W多序列比對(圖6B)發(fā)現(xiàn)，TK Pepsin具有天冬氨酸蛋白酶的兩個保守位點VKVALI、GAVIMEGFYVIF，這兩個保守位點處的 Asp162Asp398可能為催化位點處的天冬氨酸殘基[31]。

表2 TK Papain-1、TK Papain-2和TK Pepsin蛋白的生物信息學分析Table 2 The bioinformatics analysis of TK Papain-1, TK Papain-2 and TK Pepsin.

3 討論

粘孢子蟲目前已經成為魚類主要的寄生原生生物，給漁業(yè)的生產造成嚴重的危害，目前在粘孢子蟲的入侵和感染機制方面尚不清楚。近年來，寄生蟲蛋白酶常被作為候選藥物的靶標。研究表明，寄生蟲半胱氨酸蛋白酶在細胞溶解、靶細胞的吞噬作用、降解宿主細胞基質，以及免疫逃避等方面起著重要的作用[32]。通過生物信息學的分析，發(fā)現(xiàn)TK Papain-1、TK Papain-2與小瓜蟲體內的半胱氨酸蛋白酶的保守位點DWR、CGSCWAFS、GCNGG相似[30]，只有一個氨基酸殘基的差異，因此粘孢子蟲吉陶單極蟲的TK Papain-1、TK Papain-2是否具有以上功能值得進一步探討。SignalIP 4.1預測二者均具有信號肽序列，說明吉陶單極蟲的半胱氨酸蛋白酶分泌到細胞外發(fā)揮作用，這暗示二者可能作為直接的調控因子與宿主相互作用。

圖5 TK Pepsin、TK Papain-1和TK Papain-2的進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of TK Pepsin, TK Papain-1 and TK Papain-2.注：A：TK Pepsin與其他物種同源蛋白親緣關系的分析。B：TK Papain-1、TK Papain-2與其他物種同源蛋白親緣關系的分析。通過MEGA 7.0 用Neighbor-Joining 算法構建。

本研究在前期吉陶單極蟲基因組的分析研究中發(fā)現(xiàn)[13]，粘孢子蟲中存在數(shù)量顯著高于營自由生活的刺胞動物的碳水化合物水解酶和脂肪酶的蛋白酶，其中預測的顯著差異表達的可分泌蛋白酶有38個，經過基因克隆，實際擴增到3個可分泌蛋白酶基因。造成大量的蛋白酶基因克隆不成功或者克隆的基因序列與預測不相符，這可能與轉錄組基因預測的準確性不高、測序的深度不夠或者含有其他污染的序列等有關。本研究將成功克隆的3個蛋白酶基因通過大腸桿菌BL21進行異源表達，TK Papain-1、TK Pepsin均以包涵體形式表達，TK Papain-2有微量可溶表達。嘗試進行誘導條件的優(yōu)化與改進，但是可溶蛋白的表達量沒有很大改觀，此前關于組織蛋白酶L在大腸桿菌內不可溶表達也有相關報道[33,34]，這可能與真核生物蛋白在大腸桿菌原核生物表達系統(tǒng)中缺乏相應的加工修飾有關。雖然進一步進行了包涵體的變性復性，但均未得到可溶蛋白。

本研究后期將嘗試與融合增溶標簽蛋白融合表達[35]，或在真核表達體系釀酒酵母中表達或者在哺乳動物細胞中進行分泌表達[36,37]，以期獲得可溶性的重組蛋白。通過對可溶重組蛋白的純化，在此基礎上對可分泌蛋白酶的生物學活性進行測定，并進一步制備多克隆抗體對本研究中的可分泌蛋白酶進行吉陶單極蟲內的定位，為進一步深入研究粘孢子蟲蛋白酶功能及感染機制提供基礎。

圖6 TK Papain-1、TK Papain-2以及TK Pepsin進行Clustal W多序列比對及保守位點Fig.6 TK Papain-1, TK Papain-2 and TK Pepsin for Clustal W multiple sequence alignment and conserved sites.注：A：TK Papain-1、TK Papain-2通過Clustal W與其他同源蛋白進行氨基酸序列比對，比對的其他同源蛋白序列依次為：Cathepsin L-like cysteine peptidase (Trichomonas gallinae)：細毛滴蟲(Cathepsin L；CCH03781.1)，Cathepsin 2L (Fasciola hepatica)：肝片吸蟲(Cathepsin 2L；ACM67632.1)，Hypothetical protein (Pseudocohnilembus persalinus)：纖毛蟲(Hypothetical protein；KRX00829.1)，Cathepsin L1-like (Crassostrea virginica)：美洲牡蠣(Cathepsin L1-like；XP 022324445.1)，Hypothetical protein (Lchthyophthirius multifiliis)：小瓜蟲(Hypothetical protein；XP 004035191.1)，TK pepsin (Thelohanel luskitauei)：肝片吸蟲(Papain cysteine protease PIS84308.1)。B：TK Papain-1、TK Papain-2通過Clustal W與其他同源蛋白進行氨基酸序列比對，比對的其他同源蛋白序列為：beta-secretase (Electrophorus electricus)：電鰻(beta-secretase；>XP 026886442.1)，beta-secretase 1 precursor (Danio rerio)：斑馬魚(beta-secretase 1；>XP 026154490.1)，beta-secretase (Paramormyrops kingsleyae)：象鼻魚(beta-secretase；>XP 023668027.1)，beta-secretase 1 (Mastacembelus armatus)：大刺鰍(beta-secretase 1；>NP 991267.1)，部分保守序列用紅色箭頭表示。