無菌斑馬魚感染鯉春病毒血癥病毒模型的建立

謝亞東, 解明旭, 李 解, 王安然, 楊培龍, 冉 超, 周志剛

中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點實驗室, 北京 100081

水生動物的疾病可分為病毒病、細菌病、真菌病和寄生蟲病等[1]，其中，病毒病爆發(fā)迅速、傳染性極強，且目前尚無特別有效的手段應對，但其產(chǎn)生的危害往往極為嚴重。在我國大宗淡水魚養(yǎng)殖中造成嚴重危害的病毒主要有4種：鯽魚造血器官壞死病病毒(cyprinid herpesvirus-2，CyHV-2)、鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus，SVCV)、錦鯉皰疹病毒(cyprinid herpesvirus-3，CyHV-3)、草魚呼腸弧病毒(grass carp reovirus，GCRV)。其中，SVCV宿主范圍較廣，主要是鯉科魚類，其可以感染所有年齡的鯉魚，且年齡越小越易患病，1齡仔魚死亡率達70%以上[2]。其多通過水平傳播，經(jīng)鰓進入魚體，隨后傳播到腎臟、肝臟、脾臟、心臟和胃腸道[3]。SVCV被世界動物衛(wèi)生組織列為必須申報的疾病，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也將其列為《中華人民共和國進境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》(2008)中的二類動物疫病。因此，深入研究SVCV對于疾病的檢測、預防，特別是開發(fā)相關疫苗及診斷試劑具有重要意義[2]。斑馬魚(Daniorerio)是一種水生脊椎動物，具有完善的先天免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)，對SVCV易感，且通過注射和浸浴兩種途徑均可感染，所以近年來多借助斑馬魚來探究SVCV感染機制和發(fā)病機理[4～6]。

傳統(tǒng)的病毒學家們普遍認為病毒感染機體是一個雙向過程，除病毒和機體的免疫系統(tǒng)以外沒有其他因素參與。如今，已有研究證明，某些病毒在其所感染的宿主腸道的黏膜區(qū)域同共生菌群有著直接的、特殊的相互作用，說明共生菌群是病毒感染機體的第3個參與者，影響著宿主和病毒的相互作用[7,8]。此前的研究中，在不同的病毒類型和感染模型中，共生菌群對病毒的致病性具有促進或抵抗的作用，表明宿主-菌群-病毒三者之間的相互作用機制的明晰需要更為深入的研究[8]。

已有的水生動物腸道菌群和病毒感染的相互關系的研究較少。目前有部分研究表明益生菌在水產(chǎn)動物中具有抗病毒作用。如通過飼喂橄欖牙鲆乳酸菌和芽孢桿菌可控制淋巴囊腫病病毒(lymphocytic disease virus，LCDV)的感染[9]；在虹鱒腸道中也已經(jīng)分離出了具有良好抗病毒特性的嗜冷益生菌乳酸乳球菌和氣單胞菌亞種[10,11]。此外，研究表明，弧菌屬(Vibrios)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)的某些菌種對鮭科(Salmonidae)魚類的傳染性造血組織壞死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV)具有拮抗作用，具體機制可能涉及拮抗化合物的產(chǎn)生；同時，從鮭魚孵化場分離的波氏假單胞菌(Pseudoalteromonasundina)菌株也具有抗病毒效果，可以提高實驗室條件下感染擬鯵神經(jīng)壞死病毒(Shima-aji neuro necrosis virus，SJNNV)、桿狀病毒(baculovirus)和虹彩病毒(irido virus)后的南美白對蝦和褐鱒的存活率[12]。從蝦孵化場分離的2種弧菌可以抑制馬蘇大麻哈魚病毒(Oncorhynchus masou virus，OMV)和IHNV的感染，有望作為抗病毒劑使用[13]。綜上所述，來源于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖動物腸道的細菌均可發(fā)揮抵抗病毒感染的效果，說明有必要深入系統(tǒng)地研究腸道菌群和腸道土著菌株在魚類宿主病毒感染中發(fā)揮的作用。

然而，系統(tǒng)研究菌群在抗病毒感染中的作用需要無菌動物模型。本研究以斑馬魚為研究對象，摸索建立無菌斑馬魚的SVCV感染模型，并利用菌群和單菌轉(zhuǎn)接技術(shù)初步探究腸道菌群和代表性的腸道土著菌株對斑馬魚抗病毒感染能力的影響，以期為后續(xù)深入研究魚類宿主-菌群-病毒的三元作用機制提供技術(shù)和模型，并為篩選抗病毒菌株和活性元件提供技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗生產(chǎn)無菌斑馬魚所使用的是實驗室培養(yǎng)的TU純系親魚。鯉魚上皮瘤細胞(epithelioma papulosum cyprini，EPC)以及-80℃凍存的SVCV病毒種子從華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院袁軍法課題組獲得。鯨桿菌(Cetobacteriumsomerae)、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)和類志賀鄰單胞菌(Plesimonasshigelloides)菌株均為本實驗室自斑馬魚體內(nèi)分離純化所得。

GZM溶液：1 L無菌水中加入1.5 mL海鹽原液(40 g/L)，混勻后高壓滅菌。

AB-GZM溶液：向49.6 mL無菌GZM溶液中，依次加入50 μL兩性霉素B母液(250 μg/mL，過0.22 μm濾膜濾滅)、25 μL卡那霉素母液(10 mg/mL，過0.22 μm濾膜濾滅)、250 μL氨芐霉素母液(20 mg/mL，過0.22 μm濾膜濾滅)、500 μL青鏈霉素母液(1 U/μL，過0.22 μm濾膜濾滅)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 細胞培養(yǎng)

EPC細胞的培養(yǎng)基為添加了10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和100 U/mL青霉素和鏈霉素的最低必需培養(yǎng)基(minimum essential medium，MEM)。細胞培養(yǎng)箱設置為25℃，5% CO2。按照上述方法將EPC細胞培養(yǎng)在75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，當培養(yǎng)瓶中的細胞覆蓋率達到80%時，取出培養(yǎng)基并加入2 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，孵育3～5 min，將細胞從培養(yǎng)瓶中分離出來，按照1∶3的比例傳代。

1.3 病毒增殖

待75 cm2培養(yǎng)瓶中的EPC覆蓋率達到90%時吸出培養(yǎng)基，再用無FBS的MEM培養(yǎng)基清洗細胞1次，然后吸出培養(yǎng)基。將SVCV病毒種子(約105copies/μL)置于冰上解凍，取2 μL稀釋到5 mL MEM培養(yǎng)基中。將稀釋的含病毒種子的培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶中，置于25℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，每隔15 min輕輕搖一下培養(yǎng)瓶。隨后吸出含病毒種子的培養(yǎng)基，加入適量MEM培養(yǎng)基(約10 mL)進行細胞培養(yǎng)，增殖病毒。直到致細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)上升至80%，將細胞瓶置于-80℃中，反復凍融3次，將病毒從細胞中釋放出來。隨后將細胞裂解液經(jīng)12 000 g常溫離心20 min，收集上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設計與合成

G蛋白參與病毒內(nèi)吞作用[15]，是SVCV最主要的免疫原性蛋白,也是疫苗和診斷試劑研制的重要靶蛋白。因而,參照Liu等[14]的方法建立SVCV病毒糖蛋白(G蛋白)定量檢測體系。實驗所用引物序列見表1，引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用于病毒基因克隆、病毒定量檢測。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primers used in the experiment.

1.5 病毒定量檢測

1.5.1標準質(zhì)粒的構(gòu)建 參照Liu等[14]的方法，以pLB-SVCV-FR作為SVCV拷貝數(shù)校準的標準質(zhì)粒,其中,pLB-SVCV-FR是將SVCV G蛋白基因擴增后的產(chǎn)物插入pLB載體(天根生化科技(北京)有限公司)中產(chǎn)生的，并在DH5α高效的感受態(tài)細胞中進行增殖。測量質(zhì)粒DNA純化后的OD260，調(diào)整拷貝數(shù)到1010copies/μL，在此基礎上，連續(xù)稀釋，得到10～109copies/μL的標準質(zhì)粒，用作RT-PCR測定的標準量化SVCV。

1.5.2多通道實時定量PCR檢測病毒載量 使用天根生化科技(北京)有限公司病毒RNA提取試劑盒提取1.3中增殖病毒上清液RNA，使用第一鏈cDNA合成試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以其為模板，同10～1010copies/μL的標準質(zhì)粒一同進行多通道實時定量PCR(multiplex quantitative real-time polymerase chain reaction，mqRT-PCR)檢測。反應體系(20 μL)為：cDNA/標準質(zhì)粒 1 μL，10 μmol/L SVCV-F 0.5 μL，10 μmol/L SVCV-R 0.5 μL，10 μmol/L SVCV-P 0.5 μL，KAPAPROBE FAST qPCR Master Mix 10 μL，RNAase-free H2O 7.5 μL。反應程序為：95℃ 1 min；95℃ 3 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。

1.6 無菌斑馬魚制備

參照Pham等[16]的方法，制備無菌斑馬魚。將親魚從本實驗室正常養(yǎng)殖體系中撈出，產(chǎn)卵前一天晚上將親魚按雌雄配比1∶1(或2∶1)放入孵化缸中，用擋板隔開，次日上午8:00拉開擋板，讓親魚自然交配產(chǎn)卵。

親魚產(chǎn)卵后2 h內(nèi)收集受精卵至平皿中，用清水漂洗受精卵1～2次。再用AB-GZM清洗受精卵3次，將受精卵轉(zhuǎn)移至50 mL錐形管中，用AB-GZM浸泡4.5 h。隨后，用GZM漂洗受精卵3次，將受精卵轉(zhuǎn)移至0.05%的聚維酮碘(povidone-iodine,PVP-I)中，浸泡45 s后，用GZM漂洗受精卵3次，再將受精卵轉(zhuǎn)移至0.002%的NaClO中，浸泡10 min。最后，用GZM漂洗受精卵3次，將受精卵轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，30 mL GZM培養(yǎng)液放入約30個卵。置于28℃孵化，光照周期14 h黑暗、10 h光照。

等到3 dpf(受精后的天數(shù)，days post fertilization),用胰酪大豆胨瓊脂(tryptic soytone agar,TSA)平板檢測培養(yǎng)液是否染菌，將染菌的瓶從實驗中剔除。

1.7 無菌斑馬魚浸浴攻毒條件測定

在1.6的基礎上，4 dpf時，更換GZM，并將無菌斑馬魚轉(zhuǎn)移至22℃光照培養(yǎng)箱中過夜。隨后吸出GZM至剩余10 mL，實驗組加入5 mL SVCV病毒液，對照組加入5 mL MEM培養(yǎng)基。分別于12 h、24 h后吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)90%的液體，并添加GZM至30 mL。每天觀察記錄死亡數(shù)。

1.8 無菌斑馬魚轉(zhuǎn)接菌群后浸浴攻毒

在1.6的基礎上，4 dpf時，更換GZM，分別接入PBS重懸的3月齡斑馬魚腸道菌群(G組)、類志賀鄰單胞菌(Ps組)、鯨桿菌(Ceto組)和維氏氣單胞菌(Aer組)至水體內(nèi)菌濃度達到106copies/μL，無菌斑馬魚對照組只加入等體積的無菌PBS(GF組)。菌群和菌株的定量方法詳見參考文獻[17,18]。之后將各組斑馬魚轉(zhuǎn)移至22℃光照培養(yǎng)箱中過夜。24 h后吸出瓶內(nèi)90%的液體，添加GZM至10 mL，實驗組加入5 mL SVCV病毒液(分別命名為GF、G、Ps、Ceto、Aer組)，對照組加入5 mL MEM培養(yǎng)基(分別命名為GF CK、G CK、Ps CK、Ceto CK、Aer CK組)。12 h后吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)90%的液體，添加GZM至30 mL。每天觀察記錄死亡數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有的統(tǒng)計數(shù)據(jù)均來自至少3次以上的獨立實驗，使用軟件Graphpad Prism 5.0、Microsoft Office Excel 2010進行繪圖。數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤”(mean±S.E.M)的形式進行表示。采用t-檢驗比較不同組數(shù)據(jù)平均值差異的顯著性，P<0.05時認為存在統(tǒng)計學顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 pLB-SVCV-FR標準質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)1.5.1，首先克隆SVCV的G蛋白基因片段，大小為102 bp，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖1A所示)，選擇陽性結(jié)果制作pLB-SVCV-FR標準質(zhì)粒。隨后轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細胞擴增，提取質(zhì)粒，使用SVCV G蛋白引物SVCV-F/SVCV-R進行PCR擴增(同1.5.1)，產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖1B所示)，選擇陽性結(jié)果送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序驗證。結(jié)果顯示SVCV G蛋白基因片段已插入pLB，即成功構(gòu)建pLB-SVCV-FR標準質(zhì)粒。

2.2 mqRT-PCR檢測病毒載量

以10倍系列稀釋的標準質(zhì)粒為模板，選取102～1010的拷貝數(shù)梯度進行mqRT-PCR檢測病毒載量。以重組質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)為X軸、Ct值為Y軸，構(gòu)建得到標準曲線y=-2.9264x+40.112，相關系數(shù)R2為0.997 8，其中102和1010濃度梯度對應的Ct值分別為34.50和10.85。結(jié)果表明構(gòu)建的熒光定量標準曲線在102～1010范圍內(nèi)有較好的線性關系(圖2)，R2值為0.9978，滿足實驗要求。

圖1 目的片段電泳鑒定Fig.1 Electrophoresis identification of target fragment.注：A：SVCV G蛋白基因片段克?。籅：標準質(zhì)粒中目的片段鑒定。M：DNA分子標準；A中1～2：SVCV G蛋白基因片段；B中1～3：pLB-SVCV-FR質(zhì)粒中的目的片段。

圖2 mqRT-PCR檢測SVCV病毒載量標準曲線Fig.2 Standrad curve of SVCV copies detection by multiplex real-time quantitative RT-PCR.

使用該體系測定由病毒種子增殖后獲取的病毒液中病毒的載量，檢測3個批次，結(jié)果分別為2.61×106copies/μL、3.67×105copies/μL及4.52×105copies/μL，可以滿足后續(xù)浸浴實驗需求。

2.3 SVCV浸浴攻毒無菌斑馬魚

為了確定浸浴攻毒的條件，使用5 mL SVCV病毒液在22℃條件下浸浴攻毒5 dpf無菌斑馬魚，使水體的病毒濃度達到108copies/mL以上，分別在浸浴攻毒12 h、24 h以后換GZM，結(jié)果如圖3所示。攻毒后5 d內(nèi)，12 h組和24 h組浸浴病毒的無菌斑馬魚幼魚死亡率沒有顯著差異，均在40%左右，說明斑馬魚對SVCV也有部分天然的免疫力。綜合考慮，此后本模型均采用5 mL病毒液浸浴12 h攻毒。

圖3 SVCV浸浴攻毒無菌斑馬魚幼魚存活率Fig.3 Survival rate of germ-free zebrafish larvae exposed of SVCV.

2.4 SVCV浸浴攻毒轉(zhuǎn)接菌后的無菌斑馬魚

使用SVCV病毒液浸浴攻毒無菌斑馬魚(GF組)、轉(zhuǎn)接正常斑馬魚腸道菌群24 h后的無菌斑馬魚(G組)和同批次的正常斑馬魚(Z組)。結(jié)果顯示，攻毒后5 d內(nèi)，GF、G和Z組死亡率均在60%左右，沒有顯著差異；各自對照組(G CK、GF CK和Z CK)幾乎沒有死亡(圖4A)。

無菌斑馬魚幼魚分別轉(zhuǎn)接正常成年斑馬魚腸道菌群(G組)、類志賀鄰單胞菌(Ps組)、維氏氣單胞菌(Aer組)及鯨桿菌(Ceto組)24 h后使用SVCV浸浴攻毒。結(jié)果顯示，攻毒后5 d內(nèi)，GF、G、Ps、Aer和Ceto組死亡率均在60%～80%，沒有顯著差別。各CK組幾乎沒有死亡(圖4B)。結(jié)果表明，在24 h的菌群轉(zhuǎn)接周期內(nèi)，斑馬魚幼魚的抗病毒免疫未因菌群的定殖而發(fā)生顯著改變。

3 討論

斑馬魚是水產(chǎn)研究領域的模式生物，受精后發(fā)育迅速，可以進行無菌化處理[19]，且可以通過浸浴感染包括SVCV在內(nèi)的多種病毒[5,20,21]。本研究成功構(gòu)建了無菌斑馬魚的SVCV感染模型，并結(jié)合菌群轉(zhuǎn)接技術(shù)，為系統(tǒng)研究腸道菌群和菌株對病毒感染的影響奠定了基礎。

近年來的研究表明，腸道菌群同生物體抗病毒免疫之間存在著復雜而緊密的關系，有的對病毒感染起促進作用，有的則表現(xiàn)出拮抗效應。在哺乳動物的相關研究中，人類腸道細菌可以促進諾如病毒(norovirus)感染人和小鼠的B細胞[22]；而使用抗生素滅殺菌群可以延遲輪狀病毒(rotavirus)對小鼠的感染，并且降低感染率[23]。也有研究表明，經(jīng)抗生素處理的小鼠對脊髓灰質(zhì)炎病毒較不敏感，且病毒在腸道中極少地復制。暴露于細菌或其含有N-乙酰葡糖胺的表面多糖(包括脂多糖和肽聚糖)的脊髓灰質(zhì)炎病毒感染力增強，表明抗生素介導的腸道菌群的消耗削弱了腸道病毒感染，并且腸道病毒利用腸道菌群進行復制和傳播[24]。在拮抗效應方面，口服短雙岐桿菌增加了小鼠血清中的抗流感病毒IgG抗體并且防止了流感病毒感染[25]；陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)可以抑制無菌豬中諾如病毒的感染性[26]；長期服用益生菌可以減少成年人病毒性呼吸道感染的嚴重程度[27]；也有報道顯示，益生菌的使用能降低實驗室條件下養(yǎng)殖凡納濱對蝦的白斑綜合癥病毒感染的死亡率和流行率[28]。

圖4 SVCV浸浴攻毒斑馬魚幼魚存活率Fig.4 Survival rate of zebrafish larvae exposed of SVCV.注：A：SVCV攻毒無菌、無菌轉(zhuǎn)接腸道菌群及正常斑馬魚存活率；B：SVCV浸浴攻毒轉(zhuǎn)接單菌無菌斑馬魚幼魚存活率。

在建立無菌斑馬魚病毒感染模型的多次試驗中，使用108copies/mL的SVCV浸浴無菌斑馬魚后，3 d內(nèi)開始出現(xiàn)死亡，5～6 d內(nèi)達到最大死亡率，最大死亡率范圍穩(wěn)定在40%～70%之間。盡管實驗室不同批次無菌魚存在差異，但可以認為無菌斑馬魚病毒感染模型已成功建立。并初步應用本模型探究正常腸道菌群和實驗室分離的部分土著菌株對病毒感染的影響，結(jié)果沒有呈現(xiàn)明顯的正、負效應，推測這可能與菌魚互作周期有關。在24 h的轉(zhuǎn)接周期內(nèi)，轉(zhuǎn)接斑馬魚腸道菌群和土著菌的無菌斑馬魚與無菌斑馬魚相比，先天免疫可能沒有明顯差別，即短時間的菌群轉(zhuǎn)接可能還不足以對斑馬魚的免疫系統(tǒng)造成明顯的差異。后續(xù)將就進一步延長菌魚互作周期展開相關的研究。

水產(chǎn)領域?qū)τ诰涸诓《靖腥局械淖饔玫难芯枯^少，對病毒感染也缺乏有效的應對手段，目前主要通過免疫接種預防。無菌斑馬魚病毒感染模型的建立，提供了一個快速篩選與病毒感染相關菌株的途徑，也為進一步探究細菌的抗病毒效應元件提供了可能。