小麥TaLEA3基因家族的全基因組鑒定及其響應(yīng)赤霉病的表達(dá)模式分析

鄭 彤, 袁敏敏, 花 辰, 周 瑤, 李 磊, 孫政璽, 李 韜

揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 江蘇省作物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州 225009

胚胎晚期豐富(late embryogenesis abundant，LEA)蛋白是指胚胎發(fā)育后期種子中大量積累的一系列小分子量蛋白質(zhì)，最早在棉花種子中被發(fā)現(xiàn)[1,2]。1993年，Dure[3]根據(jù)LEA蛋白中氨基酸序列的同源性及一些特殊基元序列，將LEA蛋白分為6組。其中，來自第三組的LEA3蛋白因其在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要功能而被廣泛研究，其顯著特點(diǎn)是通常存在一段多拷貝的11個氨基酸組成的基元序列(T/AA/TO/EA/TA/TKRQ/EDK/RA/TXE/DQ)，可形成親水的α-螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠避免干旱脅迫時細(xì)胞內(nèi)高濃度離子的積累所引起的損傷，同時也可以防止組織內(nèi)過度失水[4]。

LEA3基因一般伴隨種子成熟而表達(dá)，在種子萌發(fā)時很快消失，這是該蛋白在種子發(fā)育過程中的一種特定表達(dá)模式[5]。然而，其功能并不止于此，研究還發(fā)現(xiàn)LEA3基因的表達(dá)與植物抗逆性密切相關(guān)，低溫、干旱及鹽漬等脅迫都可以誘導(dǎo)LEA3基因的表達(dá)[6,7]。由于LEA3蛋白與植物抗逆性的關(guān)系密切，對于LEA3蛋白的深入研究不僅有利于了解植物抗旱的分子機(jī)制，而且可以為研究植物抗旱育種提供新的思路和方法。通過外源轉(zhuǎn)入LEA3基因到植物或微生物體內(nèi)，可以在一定程度上提高轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性。如將大麥HVA1基因(LEA3蛋白)轉(zhuǎn)入水稻中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻提高了對高鹽脅迫和水分脅迫的耐受性[8]；將大麥的lea3基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，獲得了耐鹽能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株[9]；而通過將大豆PM2基因(LEA3蛋白)轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，證明了PM2基因全長的耐鹽功能[10]。上述研究為植物抗性育種提供了良好的基礎(chǔ)。

LEA3蛋白除了在干旱和鹽脅迫下發(fā)揮重要功能，與小麥抗病性也存在一定關(guān)聯(lián)。楊高山[11]發(fā)現(xiàn)Wrab17基因(LEA3基因家族)在葉銹菌接種早期呈現(xiàn)出顯著的上調(diào)表達(dá)，并通過一系列實(shí)驗(yàn)證明Wrab17基因在小麥抵抗葉銹菌侵染的過敏性反應(yīng)里發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)室前期通過高通量蛋白質(zhì)組學(xué)方法在小麥禾谷鐮刀菌接種的抗感池中也鑒定到1個差異表達(dá)基因Wrab17(基因號：TraesCS4B02G332800)，研究結(jié)果顯示其可能與赤霉病抗性相關(guān)[12]。以此為切入點(diǎn)，本研究基于已公布的中國春參考基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對小麥TaLEA3基因家族進(jìn)行全面鑒定，從基因組水平上解析小麥TaLEA3基因家族的序列特征、染色體分布、進(jìn)化關(guān)系與表達(dá)特征，以期為進(jìn)一步研究該家族成員的功能、探索其與赤霉病抗性之間的關(guān)系以及改良小麥赤霉病抗性提供參考。

1 材料與方法

1.1 小麥TaLEA3基因家族的鑒定及序列分析

關(guān)于LEA3基因家族的鑒定參照水稻[13]和短柄草[14]的鑒定方法。小麥的中國春參考基因組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在URGI網(wǎng)站(https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/)下載。通過Pfam蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(http://pfam.sanger.ac.uk/)查找并下載LEA3蛋白結(jié)構(gòu)域(PF02987)的隱馬爾可夫模型[15]，利用HMMER 3.0[16]搜索小麥基因組中的TaLEA3基因做為候選基因家族成員，默認(rèn)參數(shù)取0.01。另外將擬南芥[17]和水稻[13]中已經(jīng)報道的24條LEA3蛋白序列作為模板，通過TBlastn方法比對到小麥基因組上，得到TaLEA3候選基因家族成員。選擇2種方法同時檢測到的候選基因家族成員，利用PFAM(http://pfam.xfam.org/search/sequence)[18]和SMART在線工具(http://smart.embl.de/)進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的驗(yàn)證，剔除無典型LEA3結(jié)構(gòu)域的序列，并進(jìn)行手工確認(rèn)，最終獲得小麥TaLEA3基因家族所有成員。

利用小麥JBrowse網(wǎng)站(http://202.194.139.32/)和ProtParam在線工具(http://web.expasy.org/protparam/)獲得該家族成員蛋白質(zhì)的相關(guān)信息，如染色體位置(position)、外顯子數(shù)目(exon)、理論分子質(zhì)量(Mw)、等電點(diǎn)(pI)、總平均親水性(grand average of hydropathicity，GRAVY)等；采用PSORT(http://psort1.hgc.jp/form.html)[19]預(yù)測LEA3蛋白的亞細(xì)胞定位信息。

1.2 基因復(fù)制事件及選擇壓力分析

染色體大片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)是家族基因擴(kuò)張的主要模式。為了研究小麥TaLEA3基因家族的復(fù)制事件，通過TBtools軟件[20]作圖將各基因物理位置信息定位到不同染色體上，并利用MCScans軟件[21]分析基因的復(fù)制事件，隨后將小麥TaLEA3基因家族的共線性關(guān)系進(jìn)行可視化分析。

達(dá)爾文進(jìn)化選擇的類型通常通過計算Ka/Ks[22](非同義替換率/同義替換率)來衡量，其中Ka/Ks=1用于中性選擇；Ka/Ks<1表示純化選擇；Ka/Ks>1表示正向選擇。利用ClustalX2軟件對TaLEA3家族的編碼區(qū)(coding DNA sequence，CDS)序列進(jìn)行多重序列比對，并通過DnaSP6軟件計算核苷酸的同義替換率Ks、非同義替換率Ka以及兩者的比值。

1.3 小麥TaLEA3基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

為了充分揭示小麥TaLEA3家族基因的進(jìn)化關(guān)系，利用5個物種的LEA3家族蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。除小麥外，還選用了擬南芥[17](6個)、水稻[13](5個)、短柄草[14](4個)和大豆[23](6個)中已報道的LEA3家族蛋白(共21個)構(gòu)建進(jìn)化樹，利用MEGA 7.0軟件[24]中的最大似然法(M-L)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)置為1 000。隨后用Evolview在線工具[25]進(jìn)行美化。相關(guān)基因的序列從Phytozome數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/)下載。

1.4 小麥TaLEA3基因結(jié)構(gòu)及啟動子區(qū)域順式調(diào)控元件分析

小麥TaLEA3家族基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)可通過將其CDS序列與其對應(yīng)的基因組序列進(jìn)行比較，得到相應(yīng)的外顯子、內(nèi)含子、染色體位置等信息；基于MEME在線工具[26]對該家族motif序列進(jìn)行分析，優(yōu)化參數(shù)如下：限制最多挖掘到的motif數(shù)目為10個，每個motif的最佳寬度在6～100個殘基之間。為了進(jìn)一步研究小麥TaLEA3家族基因可能參與的調(diào)控類型，選取小麥TaLEA3家族基因上游2 kb區(qū)域，利用PlantCare網(wǎng)站[27]進(jìn)行順式作用元件預(yù)測，篩選出可能與赤霉病抗性調(diào)控相關(guān)的元件。最后，將以上3組結(jié)果輸入TBtools軟件[20]進(jìn)行可視化繪圖。

1.5 小麥TaLEA3基因家族成員的表達(dá)譜分析

干旱高溫脅迫下的基因表達(dá)結(jié)果來自于2015年Liu等[28]已發(fā)表的小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)材料為美國堪薩斯州小麥品種TAM107，對小麥幼苗分別進(jìn)行1 h和6 h的高溫脅迫(40℃)及干旱處理(20% (m/V) PEG-6000)，對照組(CK)在室溫條件下采用等量的水做相同處理，一共6組實(shí)驗(yàn)，每組2個重復(fù)，取葉片提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。赤霉菌接種下的基因表達(dá)情況則來自于2016年Gou等[29]已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)材料為小麥中國春(CS)和CS-7EL代換系，其中中國春為赤霉病感病材料，CS-7EL為赤霉病抗病代換系，通過單花滴注法接種赤霉菌Fg65菌株，實(shí)驗(yàn)分為2組，每組3個重復(fù)，接種后4 d取穗軸提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

為了驗(yàn)證4B染色體上TaG3LEA-25基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，采用SYBR Premix ExTaq(日本TaKaRa公司)進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)材料為1個赤霉病抗病池(包含F(xiàn)hb1抗病近等基因系NIL-R、蘇麥3號、望水白、Nyubai、寧7840、黃方柱、白三月黃、黃蠶豆、臺灣小麥和Tokai-66共10個材料)和1個赤霉病感病池(包含F(xiàn)hb1感病近等基因系NIL-S、Wheaton、Bobwhite、Jagger、中國春和Clark共6個材料)。對這16個抗感品系分別選取10個小穗采用單花滴注法接種10 μL的禾谷鐮刀菌孢子懸浮液，對照組接種10 μL綠豆湯懸浮液(采用同樣的方法)，共得到4個集合，分別是抗池接種(RFg)、抗池對照(RM)、感池接種(SFg)、感池對照(SM)。在接種3 d后分別取4個集合中的接種小穗穗軸部位，等量混合并提取RNA，使用TRIzol reagent試劑盒分離并純化總RNA，隨后使用PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒(日本Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系(20 μL)：cDNA 1 μL，正、反向引物各0.8 μL，50×ROXⅡ 0.4 μL，2×SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL，滅菌水 7 μL。反應(yīng)程序如下：95℃ 5 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共40個循環(huán)?？醇一騎aActing與TaG3LEA-25的引物序列如表1所示。本次qRT-PCR每個樣本池包含3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)，每個基因的相對表達(dá)量使用2-ΔΔCT公式計算。相對表達(dá)量使用SPSS 23軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥中TaLEA3基因家族成員獲得

根據(jù)HMMER 3.0軟件在小麥中的搜索結(jié)果，找到36條蛋白質(zhì)序列作為候選基因家族成員，隨后，將擬南芥(18條)和水稻(6條)中已鑒定到的LEA3家族成員與小麥蛋白質(zhì)組做TBlastn比對后，共得到59條同源序列作為候選基因家族成員。整理合并后發(fā)現(xiàn)HMMER方法找到的候選基因家族成員全部存在于TBlastn得到的序列中，因此可將其直接作為分析對象進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的驗(yàn)證。通過PFAM和SMART在線工具進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，手工矯正并剔除了10條不包含完整LEA3特征結(jié)構(gòu)域的序列，最終留下26條序列作為小麥TaLEA3基因家族成員，以其在染色體上的位置順序命名為TaG3LEA-1～TaG3LEA-26。

表1 TaActing與TaG3LEA-25的引物序列Table 1 Primer sequences of TaActing and TaG3LEA-25.

對該基因家族蛋白質(zhì)進(jìn)行序列及理化性質(zhì)分析，結(jié)果如表2所示，小麥TaLEA3家族中，最長的有408個氨基酸殘基(TaG3LEA-19)，最短的有163個氨基酸殘基(TaG3LEA-13)；外顯子數(shù)目大多為2～3個；蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為16.9～43.2 kDa，大部分在10～30 kDa；總平均親水性在-0.633～-1.118之間，可以看出小麥中的LEA3蛋白均具有較高的親水性，符合其家族特質(zhì)。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，21個TaLEA3蛋白被預(yù)測定位在細(xì)胞質(zhì)中，2個TaLEA3蛋白被同時定位在細(xì)胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)中，3個位于4A、4B、4D上的TaLEA3蛋白被單獨(dú)定位在線粒體基質(zhì)內(nèi)。

表2 26個小麥TaLEA3基因家族成員基本信息Table 2 The basic information of 26 TaLEA3 genes in wheat.

注：C：細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)；MM：線粒體基質(zhì)(mitochondrial matrix)。

2.2 小麥TaLEA3家族基因復(fù)制事件及選擇壓力分析

小麥TaLEA3家族基因分布于小麥21條染色體中的9條染色體上(圖1)，分別是1A、1B、1D、3A、3B、3D、4A、4B和4D。其中1A、1B、1D上含有較多的基因(5～6個)。根據(jù)Holub[30]的描述，1個染色體在200 kb以內(nèi)的區(qū)域包含2個或者更多的基因，則被定義為串聯(lián)復(fù)制事件。由此可以看出，該家族在1A、1B和1D染色體的長臂端聚集成3個串聯(lián)重復(fù)的區(qū)域，表現(xiàn)為TaLEA3家族基因分布的熱點(diǎn)區(qū)域。除了串聯(lián)重復(fù)事件外，通過MCScanX方法進(jìn)行共線性分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)還存在12個片段復(fù)制事件，涉及該家族的15個基因。一些基因被發(fā)現(xiàn)至少與3個同源基因?qū)τ嘘P(guān)，其中1A染色體上的TaG3LEA-2基因與TaG3LEA-6、TaG3LEA-12和TaG3LEA-20均存在片段復(fù)制現(xiàn)象；3A染色體上的TaG3LEA-18基因與TaG3LEA-6、TaG3LEA-16、TaG3LEA-20和TaG3LEA-22也存在片段復(fù)制現(xiàn)象，推測這些基因可能在TaLEA3基因家族進(jìn)化過程中發(fā)揮了重要作用；4A、4B、4D染色體上的TaG3LEA-23、TaG3LEA-24和TaG3LEA-26這3個基因經(jīng)過相互片段復(fù)制產(chǎn)生，且與其他染色體上基因無關(guān)，說明這3個基因可能在祖先分化之前就已經(jīng)存在。

同義替換(synonymous substitution)和非同義替換(nonsynonymous substitution)是生物進(jìn)化過程中核苷酸替換的2種形式，Ka、Ks及Ka/Ks能反映出基因進(jìn)化過程中受到的選擇壓力。為了更好地理解作用于TaLEA3基因家族進(jìn)化的制約因素，本研究也對該家族各基因進(jìn)行了選擇壓力分析。如圖3所示，該家族在1A、1B、1D、3A、3B、3D上的基因之間Ka/Ks均小于或等于1，趨向于純化選擇或者中性選擇，說明這些基因在進(jìn)化過程中序列并未發(fā)生太大改變，相似性較高；而TaG3LEA-23和TaG3LEA-26與這6條染色體上基因之間的選擇壓力幾乎都大于1，說明這2個基因可能經(jīng)歷了較強(qiáng)的正向選擇壓力，序列變異明顯。4B染色體上的TaG3LEA-24基因與1A、1B、1D、3A、3B、3D這6條染色體上的基因間多為中性選擇，與TaG3LEA-23和TaG3LEA-26這2個基因呈正向選擇，結(jié)合之前的復(fù)制事件分析可以推測，TaG3LEA-24基因可能是TaG3LEA-23和TaG3LEA-26這2個基因的祖先，隨后經(jīng)歷了一系列的正向選擇分化得到。此外，4B染色體上的TaG3LEA-25基因是一個特殊例子，該基因與其他各基因之間均是純化-中性選擇的關(guān)系，可能具有某些重要意義。

圖1 小麥TaLEA3家族基因的染色體分布Fig.1 Chromosome distribution of TaLEA3 gene family in wheat.注：基因名加背景色的表示串聯(lián)重復(fù)，左側(cè)標(biāo)尺表示物理距離(Mb)。

圖2 小麥TaLEA3家族基因的共線性關(guān)系Fig.2 Synteny analysis of TaLEA3 gene family in wheat.注：染色體間的線條表示片段復(fù)制。

圖3 小麥TaLEA3基因家族選擇壓力分析Fig.3 Selection pressure analysis of TaLEA3 gene family in wheat.

2.3 小麥與不同物種LEA3基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)序列的相似性，采用M-L法對5個物種的LEA3基因家族進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果如圖4所示。系統(tǒng)進(jìn)化可以分為3個簇，其中Cluster3中的蛋白總數(shù)占總體的56.5%，并且大部分的小麥TaLEA3家族基因都聚類在這個簇中，同時，1個擬南芥基因、2個水稻基因和1個二穗短柄草基因也在這個簇中，說明這些基因之間可能具有相似的功能。此外，有5個基因(TaG3LEA-17、TaG3LEA-19、TaG3LEA-21、TaG3LEA-23、TaG3LEA-24和TaG3LEA-26)被聚類在Cluster2中，且5個物種的基因在Cluster2中均有分布。Cluster1中不含小麥TaLEA3家族的基因，說明小麥中TaLEA3家族與Cluster1中的基因在序列上存在較大的差異。值得說明的是，二穗短柄草作為與小麥親緣關(guān)系非常相近的物種，其LEA3家族與小麥TaLEA3家族也具有相當(dāng)高的相似性。

2.4 小麥TaLEA3家族基因結(jié)構(gòu)及啟動子區(qū)域順式調(diào)控元件分析

通過TBtools軟件對小麥TaLEA3家族系統(tǒng)進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)及motif序列分析進(jìn)行可視化繪

圖4 無根系統(tǒng)發(fā)育樹代表小麥TaLEA3家族與擬南芥、短柄草、水稻、大豆LEA3家族間的關(guān)系Fig.4 Phylogenetic tree representing relationships among LEA3 genes from Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, rice and soybean.注：不同背景色表示分成3個不同的簇?！霰硎拘←?，▲表示擬南芥，★表示水稻，●表示短柄草，√表示大豆。

圖后，結(jié)果如圖5所示。由基因結(jié)構(gòu)可知(圖5C)，小麥TaLEA3家族基因結(jié)構(gòu)相對簡單，大部分基因都含有2～3個外顯子，3B上的TaG3LEA-20基因含有4個外顯子，1B上的TaG3LEA-9基因比較特殊，含有6個外顯子，基因長度則達(dá)到6 kb。LEA_4結(jié)構(gòu)域存在于該基因家族的外顯子上，長度在30～50個氨基酸殘基左右，有些基因則含有多個LEA_4結(jié)構(gòu)域，并且串聯(lián)形成簇。在TaLEA3家族基因的結(jié)構(gòu)域中還發(fā)現(xiàn)了PTZ00121這一結(jié)構(gòu)域，很多LEA_4結(jié)構(gòu)域存在于PTZ00121結(jié)構(gòu)域內(nèi)，其氨基酸組成上可能與LEA_4結(jié)構(gòu)域存在一定相似性。

Motif是蛋白質(zhì)分子具有特定功能或作為獨(dú)立結(jié)構(gòu)域一部分的二級結(jié)構(gòu)聚合體?；蚣易逯懈鞒蓡T的公共motif可能是該家族執(zhí)行重要功能或組成結(jié)構(gòu)上不可缺少的一部分。通過挖掘基因家族各成員蛋白質(zhì)中的motif信息，可以作為識別該基因家族的特征，并且解釋其響應(yīng)的功能。本研究共挖掘了TaLEA3基因家族蛋白質(zhì)的10個motif，結(jié)果如圖5B所示，大部分TaLEA3家族基因都含motif 2、motif 5或者兩者的結(jié)合。而從這2個motif內(nèi)部序列分析結(jié)果(圖6)可知，motif 2與motif 5均含有典型的LEA3基因家族11個氨基酸殘基組成的基元序列，是鑒定該基因家族的重要依據(jù)。另外，位于第3支(紅色)(圖5A)的該家族蛋白質(zhì)具有與其他組不同的motif組成，比如在N端丟失了motif 3，而獲得了motif 6和motif 9等；在C端丟失了motif 4和motif 10，獲得了motif 7和motif 8。與系統(tǒng)進(jìn)化樹分類結(jié)果(圖5A)有所不同的是，TaLEA3家族基因根據(jù)motif元件類型可以明顯分成2組，黃色和藍(lán)色類型可以被歸為一組，因?yàn)樗鼈兙哂邢嗨频膍otif組成。

圖5 小麥TaLEA3基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹、基因結(jié)構(gòu)及保守蛋白motifFig.5 Phylogenetic relationships, gene structure and architecture of conserved protein motifs in TaLEA3 gene family from wheat.注：A：利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建的小麥LEA3蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，詳細(xì)分支用不同顏色顯示。B：小麥TaLEA3基因motif組成，選擇挖掘10個motif，不同的motif用不同的顏色。蛋白質(zhì)的長度可以用底部標(biāo)尺來衡量。C：小麥TaLEA3基因外顯子結(jié)構(gòu)，綠色代表5′-3′區(qū)域，黃色代表外顯子，黑線表示內(nèi)含子。TaLEA3基因家族結(jié)構(gòu)域存在于粉紅色和墨綠色方塊中，略有重疊。最下側(cè)標(biāo)尺表示基因長度(bp)。

圖6 小麥LEA3蛋白的motif 2(上)及motif 5(下)結(jié)構(gòu)域序列Fig.6 The LEA3 protein sequence of motif 2 (upper panel) and motif 5 (lower panel) domain in wheat.

順式作用元件(cis-acting element)是存在于基因旁側(cè)序列中能影響基因表達(dá)的序列，包括啟動子、增強(qiáng)子、調(diào)控元件等，其作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控。通過選取CDS序列上游2 kb啟動子區(qū)域，挖掘TaLEA3家族基因在啟動子區(qū)域存在的順式作用元件，對于了解該基因家族的功能具有推動作用。本研究對啟動子區(qū)域進(jìn)行篩選，留下一些可能與赤霉病抗性相關(guān)的順式作用元件(圖7)，每個基因中都含有與脫落酸(abscisic acid，ABA)響應(yīng)相關(guān)的元件。在以往的研究中，有報道通過接種禾谷鐮刀菌與ABA的混合液可以促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)[31]。本研究還挖掘到了一些與茉莉酸(jasmonic acid，JA)、水楊酸(salicylic acid，SA)相關(guān)的調(diào)控元件。也有報道顯示JA[32]和SA[33]與赤霉病抗病性相關(guān)。此外，與干旱、低溫以及逆境壓力防御相關(guān)的調(diào)控元件也被發(fā)現(xiàn)，該結(jié)果說明TaLEA3家族與植物的逆境脅迫應(yīng)答有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。

圖7 小麥TaLEA3基因家族CDS序列上游2 kb啟動子區(qū)域的順式調(diào)控元件分布Fig.7 Cis-regulatory element distribution in 2 kb promoter region upstream of CDS sequence of wheat TaLEA3 gene family.

2.5 小麥TaLEA3家族基因的表達(dá)譜分析

利用公共的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行小麥TaLEA3家族基因表達(dá)分析，在干旱(20% (m/V) PEG-6000)和高溫(40℃)脅迫下的表達(dá)情況如圖8A所示。結(jié)果表明，26個小麥TaLEA3基因家族成員中，并非所有基因都能對干旱和高溫脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，僅TaG3LEA-1、TaG3LEA-2、TaG3LEA-6、TaG3LEA-13、TaG3LEA-22和TaG3LEA-25這6個基因?qū)Ω珊当憩F(xiàn)較為敏感，在干旱脅迫下，呈現(xiàn)差異表達(dá)且隨時間推移(1～6 h)表達(dá)量明顯升高。除TaG3LEA-25外，其他基因?qū)Ω邷氐捻憫?yīng)都不敏感，表達(dá)量均無明顯變化，即便在干旱和高溫的同時作用下，各基因的表達(dá)量均無升高，推測高溫對于TaLEA3家族基因的表達(dá)可能具有一定抑制作用。值得注意的是，該家族所有基因中，TaG3LEA-25在對照(CK)及各個處理下的表達(dá)都很高，并且在處理時間內(nèi)隨時間增加表達(dá)量明顯提升。

在接種赤霉菌條件下TaLEA3家族基因的表達(dá)情況如圖8B所示，對感病材料中國春以及抗病的中國春7EL代換系(CS-7EL)幼苗進(jìn)行接種后4 d穗軸部位基因表達(dá)量分析結(jié)果表明，TaG3LEA-25這一基因在小麥發(fā)育早期表達(dá)量較高，并且其在抗病材料CS-7EL的表達(dá)量(TPM值33.41)明顯高于感病材料中國春(TPM值10.42)，暗示著TaG3LEA-25可能是一個與赤霉病抗病性相關(guān)的基因，其余基因表達(dá)無明顯差異。

基于基因表達(dá)熱圖，選擇TaG3LEA-25基因作為研究對象，通過構(gòu)建1個抗病池和1個感病池，分別進(jìn)行赤霉菌接種和綠豆湯接種(對照)，隨后進(jìn)行qRT-PCR基因表達(dá)量分析，結(jié)果如圖9所示，在赤霉菌接種后3 d，TaG3LEA-25在不同抗、感池的處理下穗軸部位的響應(yīng)是不同的。該基因在對照接種的抗病池和感病池相對表達(dá)量差異不大，說明在未接種條件下其在各材料中均有表達(dá)；而在對抗病池進(jìn)行接種后(RFg)，其相對表達(dá)量為1.548，單因素方差分析結(jié)果P值為0.005 9(即P<0.01)，說明相較于對照接種的抗病池(RM)其表達(dá)量呈極顯著上調(diào)。在對感病池進(jìn)行接種后，其相對表達(dá)量僅為0.616，表明在赤霉菌接種后其相對表達(dá)量極顯著下調(diào)。以上結(jié)果與熱圖中結(jié)果一致，說明TaG3LEA-25基因可能參與赤霉病抗病相關(guān)的表達(dá)。綜合上述分析，qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)在趨勢上基本一致，也證明了使用RNA-seq數(shù)據(jù)評估小麥在不同處理下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平是合理可行的。

圖8 小麥TaLEA3家族基因在干旱和高溫脅迫下(A)及在接種赤霉菌接種下(B)的表達(dá)譜Fig.8 Expression profiles of the wheat TaLEA3 gene family under drought and heat stress (A) and Fusarium graminearum inoculation (B).

圖9 通過qRT-PCR分析TaG3LEA-25基因在赤霉病壓力脅迫下的表達(dá)情況Fig.9 qRT-PCR analysis of TaG3LEA-25 gene in response to FHB treatment.注：數(shù)據(jù)通過TaActin基因校準(zhǔn)，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。RFg上的**表示與RM相比差異極顯著;SFg上的**表示與SM相比差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

LEA3蛋白早在1993年就有研究[34]，且被證實(shí)與生物抗逆性密切相關(guān)[35]。近年來，對于LEA3蛋白的研究已經(jīng)深入到各大植物中，已分離的LEA3基因主要有小麥WRAB19基因[36]、Wrab17基因[37]、TaLEA3基因[38]，大麥HVA1基因[39]，水稻OsLEA3基因[40]，玉米ZMLEA3基因[41]，大豆PM2基因[42]等，均涉及到對干旱、低溫等逆境的響應(yīng)。迄今為止，LEA3家族成員已在水稻[13]、擬南芥[17]、大豆[23]及二穗短柄草[14]等植物中得到了系統(tǒng)的鑒定，但是在小麥中還未見相關(guān)報道。隨著小麥參考基因組數(shù)據(jù)的公布，從全基因組水平鑒定這一基因家族成為可能。本研究基于已公布的小麥參考基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，運(yùn)用生物信息學(xué)手段對小麥TaLEA3基因家族進(jìn)行了綜合分析和相關(guān)驗(yàn)證。

LEA3基因在小麥中包含一個大的家族，通過HMMER 3.0搜索和TBlastn這兩種方法分別進(jìn)行全基因組鑒定，確定了26個基因?yàn)樵摶蚣易宄蓡T，確保了鑒定的全面性和準(zhǔn)確性。該家族基因的分布集中在1A、1B、1D、3A、3B、3D、4A、4B和4D 9條染色體上，呈現(xiàn)出多拷貝的分布特征。染色體分布顯示，在1A、1B和1D染色體上各存在1個串聯(lián)重復(fù)區(qū)塊，涉及14個基因，這種基因組中的串聯(lián)復(fù)制(segmental duplication, SD)導(dǎo)致數(shù)量上的擴(kuò)增，也間接證明了LEA3基因在進(jìn)化過程中的擴(kuò)張。除了串聯(lián)重復(fù)，還存在片段復(fù)制(tandem duplication，TD)的現(xiàn)象，共線性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)12對旁系同源基因由片段復(fù)制產(chǎn)生，涉及15個基因，占該家族總基因的57.7%，說明該家族大部分基因是通過染色體的復(fù)制、加倍事件持續(xù)擴(kuò)張的，最早可能起源于1A、1B和1D染色體。達(dá)爾文選擇壓力分析也證實(shí)，位于1A、1B、1D與3A、3B、3D上的基因相互之間大都趨向于純化選擇或中性選擇，其序列未發(fā)生較大變異；3A、3B、3D上的基因相互之間開始發(fā)生了一些正向選擇；而4A、4B、4D上的基因(除TaG3LEA-25外)在其內(nèi)部為純化至中性選擇，與其他染色體上的基因則均為正向選擇，發(fā)生較大變異，推測TaG3LEA-25基因可能作為銜接這些染色體上基因之間的紐帶而發(fā)揮一定的功能。

相當(dāng)多的證據(jù)表明LEA3基因在植物生長發(fā)育過程中對非生物脅迫耐受性具有重要作用，比如冷和干旱等[10,35,43]。根據(jù)小麥中LEA3基因在干旱和高溫脅迫下以及在赤霉菌接種下的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaG3LEA-25這一基因在各條件下都顯著表達(dá)，說明該基因與小麥抵抗逆境有關(guān)，并且發(fā)揮著相當(dāng)重要的功能。RT-qPCR的驗(yàn)證結(jié)果也顯示，TaG3LEA-25基因可能是一個與赤霉病抗病相關(guān)的基因，在抗病品系接種赤霉菌的條件下呈現(xiàn)出較高的表達(dá)。

本研究通過結(jié)合同源性分析、系統(tǒng)發(fā)育和基因表達(dá)，比較系統(tǒng)地分析了小麥TaLEA3基因家族的序列組成和特征，為更好理解小麥TaLEA3家族基因的生物學(xué)功能提供了寶貴資源。這種綜合分析有利于選擇候選LEA3基因進(jìn)行進(jìn)一步的功能鑒定，為小麥抗赤霉病抗性遺傳改良提供更多選擇。