建立植入前遺傳學檢測人胚胎來源的無動物源性干細胞系

張 丹，王增艷，麥慶云，蔡 炳，曾艷紅，周燦權

（中山大學附屬第一醫(yī)院生殖中心//廣東省生殖醫(yī)學重點實驗室，廣東廣州510080）

建立達到藥品質量管理規(guī)范GMP標準的人胚干細胞（human embryonic stem cells，hESC）系要求hESC的原代分離、培養(yǎng)傳代和凍存的每一步都要避免動物源性成分的污染［1］。目前在成分確定的培養(yǎng)基（chemical defined medium，CDM）中的建系大多是將在含動物成分培養(yǎng)體系中建立的原代克隆，經(jīng)數(shù)次傳代后再轉移至CDM培養(yǎng)體系中，但并不清楚在這樣一個轉換過程中hESC通過適應會改變多少hESC的特性［2-4］。因此，在完全無動物源性的培養(yǎng)體系中原代建立新的hESC系就顯得尤為必要。我們之前的研究［5］已經(jīng)證實了新構建的無外源性（xeno-free，XF）培養(yǎng)體系支持hESC生長的能力優(yōu)于feeder-free培養(yǎng)體系，但是研究中培養(yǎng)的兩株hESC系也不是在XF體系中原代建立的。利用胚胎植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）患者的廢棄胚胎建立的干細胞系為單基因疾病的研究提供了最佳的細胞模型。在本研究中，我們利用在本中心行PGT的染色體平衡易位患者的廢棄胚胎，使用機械切割法獲得內細胞團（inner cell mass，ICM）并且傳代，以期建立完全沒有接觸動物成分的hESC系，為hESC向臨床的應用和單基因疾病細胞模型的建立提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 無動物源性的hESC培養(yǎng)體系

此體系為我們之前新構建的培養(yǎng)體系［5］。收集2016年8月至12月因一方染色體相互易位在我中心接受PGT治療的夫婦的廢棄胚胎共12枚，在患者簽署知情同意書后用于本實驗的干細胞建系。以上材料均得到患者知情同意并得到中山大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 無動物源性人包皮飼養(yǎng)層的制備及培養(yǎng)

無菌條件下取包皮環(huán)切術后的小兒包皮，用含雙抗的PBS沖洗3～5遍，然后在TrypLE Select（Invitrogen，美國）中4℃浸泡過夜。分離去除表皮后，用眼科剪將真皮剪碎，加入TrypLE Select于37℃消化30 min。然后加入含體積分數(shù)10%HS（Sigema，美國）、90%DMEM（Invitrogen，美國）和體積分數(shù)0.5%雙抗（HyClone，美國）的AF-HFF培養(yǎng)基中終止消化，用吸管反復吹打后1 200×g離心5 min，將上清液丟棄，用AF-HFF培養(yǎng)液重懸細胞，以（5～10）×104/mL的密度接種于培養(yǎng)皿中。待生長1周左右，當細胞生長達到90%面積以上融合時，使用TrypLE Select消化，按1∶5的比例傳代。包皮成纖維細胞培養(yǎng)至8代左右，開始用絲裂霉素滅活2 h，制備成包皮飼養(yǎng)層細胞，用于hESC的培養(yǎng)。以上材料均得到患者知情同意并得到中山大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.3 機械切割法分離ICM及其原代培養(yǎng)

12枚行PGT患者培養(yǎng)至D3的廢棄胚胎，用機械切割法去除透明帶，或者活檢后因染色體異常的廢棄胚胎發(fā)育至囊胚階段后，等待囊胚自然孵出。將去除透明帶的囊胚移入CDM（HEScGRO medium，Chemicon，美國）中，充分洗滌3次，有明顯ICM的囊胚，用1 mL的注射器針頭去除滋養(yǎng)層細胞后，將ICM種植在使用AF培養(yǎng)體系的培養(yǎng)皿中；無明顯ICM形成或ICM細胞數(shù)極少的囊胚，則將整個囊胚種植于新的培養(yǎng)皿中。每天觀察ICM的生長情況，每隔2～3 d換液。原代培養(yǎng)培養(yǎng)7～14 d后，挑出克隆中央細胞致密、未分化的團塊，用1mL的注射器針頭在解剖顯微鏡下將克隆機械地分成3～4塊，然后將小細胞團種植于新的培養(yǎng)皿中。每隔5～7 d克隆顯著增殖或者發(fā)現(xiàn)有細胞分化跡象時，使用機械切割法按照1∶3～1∶6的比例進行傳代。

1.4 免疫熒光檢測hESC表面未分化抗原

吸去培養(yǎng)液，用0.01 mol/L PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min。用0.01 mol/L PBS洗3次，再用體積分數(shù)0.1%Triton X100（Sigma，美國）打孔10 min，0.01 mol/L PBS洗3次。接下來用體積分數(shù)10%山羊血清（HyClone，美國）室溫下封閉30 min，然后分別加入4種一抗（SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81，1∶50；Chemicon，美國）。4℃孵育過夜后，再用0.01 mol/L PBS洗3次，加入熒光標記的羊抗人的對應二抗（Invitrogen，美國），室溫下孵育 1 h，加入DAPI（Sigma，美國）染核5 min，0.01 mol/L PBS洗3次。最后封片膠封片，待膠干后，在熒光顯微鏡下觀查結果。

1.5 RT-PCR檢測hESC的多能性

收集1×106的細胞量行RT-PCT，測定hESC多能性因子Octamer-binding transcription factor 3/4（OCT3/4）、anoghomeobox（Nanog）、POU class homeobox（POU5F1；表1）。參照總RNA提取試劑盒（Qiagen，美國）說明用TRIzol法提取細胞總RNA。RT-PCR依據(jù)試劑盒（Invitrogen，美國）說明進行操作。逆轉錄反應體系為20 μL，其中總 RNA 2 μL、5×RT buffer 4 μL、10 mmol/L dNTP mix 1 μL、0.5 μg/μL oligo（Dt）20 1 μL、20 U/μL RNA 酶抑制劑1 μL、200 U/μL M-MLV逆轉錄酶1 μL，剩余體積由 DEPC H2O補充，反應在42℃作用1 h，進行cDNA的延伸。95℃10 min，使酶失活，然后保存在-80℃冰箱備用。PCR反應體系 25 μL，其中模板2 μL、上下游引物各1 μL、PCR Master Mix 12.5 μL，dd H2O補充至25 μL。PCR反應條件為：95℃作用5 min；94℃ 30 s、60℃ 40 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃作用7 min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察照相。

1.6 體外分化實驗

用Ⅳ型膠原酶將hESC從人成纖維細胞飼養(yǎng)層（human fibroblast cell feeder，HFF）上消化下來，轉移至低粘附性的6孔板中培養(yǎng)。分化培養(yǎng)試劑由體積分數(shù)80%DMEM、體積分數(shù)20%FBS、1 mmol/L L-glutamine、0.1 mmol/L β-mercaptoethanol和1 mmol/L MEM nonessential amino acids組成。經(jīng)過7～10 d的懸浮培養(yǎng)后，在顯微鏡下觀察類胚體的形成。收集到類胚體后，提取RNA檢測分化相關基因 Reduced Expression 1（REX-1）、sex determining region Y-box2（SOX-2）、Lin-28 homolog A（LIN 28）、Nucleophosmin-1（NPM1）和 Growth Differentiation Factor 3（GDF3）的表達（表1）。

表1 檢測干細胞多能性和分化相關基因的RT-PCR引物序列Table 1 the primer sequence used for polymerase chain reaction and determination ofpluripotency and differentiation genes

1.7 體內分化實驗

細胞用膠原酶消化，離心，沉淀，以PBS懸浮，濃度約1×106/mL，用1 mL注射器將細胞懸液注入嚴重聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠（中山大學醫(yī)學院動物實驗中心）后腿肌肉內，每側0.1 mL（約1×106個細胞）。8～10周后可見小鼠腿部有腫塊長出，10周后處死小鼠，將畸胎瘤組織用40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色后顯微鏡下觀察是否存在內、中、外3個胚層的組織。

1.8 hESC核型的檢測

將準備用于核型檢測的hESC傳代至無飼養(yǎng)層的Matrigel包被的培養(yǎng)皿上，隔天換液。當細胞培養(yǎng)3～4 d，增殖迅速時，加入秋水仙素處理3 h，經(jīng)2.5 g/L的TrypLE Select消化成單個細胞后，常規(guī)空氣干燥法制片，Giemsa染色。

2 結果

2.1 AF-hESC系的生長情況

我們前期嘗試使用Tyrode′s solution法去除透明帶和滋養(yǎng)外細胞，獲得的ICM轉移至無動物源性人包皮飼養(yǎng)層（xeno-free human foreskin fibroblast feeder layers，XF-HFF）XF-HFF/CDM條件下培養(yǎng)3～7 d，ICM逐漸分化，最終未能形成干細胞克隆團（圖1A）。而12枚PGT來源的廢棄胚胎使用機械切割法去除透明帶和滋養(yǎng)外細胞后，有1枚胚胎獲得的ICM在最初的幾次傳代中觀察到有來源于ICM的hESC樣的外生物生長，伴隨滋養(yǎng)細胞來源的分化細胞（圖1B）。隨后進一步機械傳代hESC樣細胞，分化的細胞逐漸消失，新的hESC系形成清晰的克隆邊界，細胞表現(xiàn)出典型的hESC形態(tài)學特征，即細胞間緊密連接形成鳥巢狀克隆，并有高的核質比例（圖1C）。目前建立的這一株hESC系已傳代超過40代次，仍保持正常的hESC克隆形態(tài)。

圖1 在無動物源性培養(yǎng)體系中建立的人胚胎干細胞克隆形態(tài)Fig.1 The morphology of hESC colonies cultured in xeno-free hESC culture conditions

2.2 免疫熒光檢測

對新建立的hESC系在傳代培養(yǎng)中以及解凍后進行免疫熒光染色，克隆均表達hESC未分化表面標記物SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81（圖2）。

圖2 XF/HFF-CDM培養(yǎng)體系中hESC的干細胞標志物表達Fig.2 Expression of stem cell markers in hESC grown in XF-HFF/CDM

2.3 RT-PCR檢測

hESC多能性因子和類胚體的3個胚層的表達AF-hESC系傳代至32代時，收集一定量的細胞量行RT-PCR，結果表明新建立的hESC系表達干細胞多能性因子Octamer-binding transcription factor 3/4（OCT3/4）、Nanoghomeobox（Nanog）、POU class 5 homeobox 1（POU5F1）（圖3）。為進一步檢測干細胞系的分化能力，我們將hESC在無飼養(yǎng)層的低粘附皿中用20%FBS-DMEM培養(yǎng)基經(jīng)過7～10 d的懸浮培養(yǎng)，觀察到有類胚體的形成。收集類胚體，加Trizol處理后用于RT-PCR檢測到分化相關基因REX-1、SOX-2、LIN28、NPM1和GDF3基因的表達（圖3），證實新建立的hESC系在體外具有分化的能力。

圖3 hESC多能性因子的表達Fig.3 Expression of stem cell markers

2.4 形態(tài)學結果提示分化潛能

將AF-hESC注入嚴重免疫缺陷（SCID）小鼠體內能形成畸胎瘤，包括了來源于外、中、內3個胚層的組織：皮脂腺、肌纖維和腸上皮等（圖4）。這表明AF-hESC具有多向分化潛能。

圖4 在XF-HFF/CDM培養(yǎng)體系中新建立的hESC系的體內分化實驗Fig.4 In vivo analysis of the pluripotency of hESC cultured in XF-HFF/CDM

2.5 染色體核型結果

對建立的干細胞系進行核型鑒定為46，XY，t（1；20）（p13.3；q13.1；圖 5）。分別對第 15、20、25、30代次和解凍后第36代的hESC進行了5次核型鑒定，均為同一異常核型。

圖5 在XF-HFF/CDM培養(yǎng)體系中新建立的hESC系的染色體核型鑒定Fig.5 G-banding chromosome analysis of the new hESC-line cultured in XF-HFF/CDM

3 討論

hESC建系及培養(yǎng)過程中，外源性成分主要來源于這幾個方面：①飼養(yǎng)層細胞或無飼養(yǎng)層基質的動物性成分，或者暴露于含動物蛋白的培養(yǎng)基中；②hESC培養(yǎng)基中添加的動物蛋白血清，如FBS和SR；③常用于去除滋養(yǎng)層細胞獲得ICM的免疫外科法也會使胚胎接觸動物蛋白。一直以來，研究者們就致力于優(yōu)化hESC的培養(yǎng)體系，消除培養(yǎng)體系中的動物源性成分，以期獲得完全無動物源性的hESC培養(yǎng)體系和hESC系。

飼養(yǎng)層為hESC的生長所不可或缺。已有證據(jù)表明與飼養(yǎng)層有關的多種信號通路參與了hESC多能性的維持。例如飼養(yǎng)層細胞分泌多種生長因子，包括生長因子家族（FGFs）、轉化生長因子、激活素A、Wnt family member 3（Wnt3）、骨形態(tài)生成蛋白（BMP）拮抗信號等。這些因子通過相互協(xié)同作用，可以維持hESC在feeder-free培養(yǎng)體系中的未分化狀態(tài)生長［2，3，6-11］。與昂貴的成分確定的基質膠相比，人包皮成纖維細胞來源及制備方便，并可長期傳代反復利用，已被證實是支持hESC未分化生長的最佳飼養(yǎng)層以及制備條件培養(yǎng)基的飼養(yǎng)層細胞之一［12-14］。我們建立的AF-HFF在飼養(yǎng)層來源和培養(yǎng)基方面都去除了動物成分的影響，并且使用時間長，在體外培養(yǎng)可長達一個月，仍具有支持hESC生長的能力，大大減低了飼養(yǎng)層制備的繁瑣。

建立新的臨床級hESC系，分離ICM非常重要。免疫外科法是較為常用的獲取ICM的經(jīng)典方法，成功率高［15］。但是該法是將胚泡與動物血清（兔抗小鼠的血清）共同孵育，直接接觸了動物成分。機械法是待囊胚自然孵出或機械切除透明帶后種植于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)5 d后分離出擴大增殖的ICM細胞進一步傳代。此方法避免了接觸動物成分，但操作困難，不容易完全去除滋養(yǎng)細胞，而且內胚層樣細胞形成使得hESC增殖能力低且極易分化，因而成功率低。對于ICM不明顯、細胞數(shù)極少的ICM，可在去除透明帶后行全囊胚培養(yǎng)。本研究中采用機械切割法或全囊胚法來獲得ICM來建立hESC系，以避免ICM分離過程中動物蛋白的污染。血清是培養(yǎng)體系中的關鍵物質，hESC首先是建立在添加了血清的培養(yǎng)基以及飼養(yǎng)層上的［15-17］，這與當初鼠胚胎干細胞（mESC）系建立的培養(yǎng)條件及其相似。盡管如此，能維持hESC和mESC自我更新的因子之間存在很大的差異。例如，白血病抑制因子（LIF）通過結合LIF受體和gp130來激活JKA/Stat3信號通路［18-20］，而激活的Stat3信號足以維持mESC在含有血清的培養(yǎng)基中增殖和未分化生長。還有研究認為在去除血清的培養(yǎng)基中，BMPs可以協(xié)同LIF誘導表達Id基因來維持mESC的自我更新［21-23］。但是添加LIF與或激活Stat3信號通路卻不足以維持hESC自我更新［6，24］。

在飼養(yǎng)層體系中，以往對免疫外科法和機械法建系率的報道分別為1.8%～37.5%和9.1%～26%。對在添加不同血清的培養(yǎng)基中的建系率也不盡相同（FCS：5.6%；SR：1.8%～20%；HS：9.1%）。本研究采用機械切割法分離ICM以及不含血清的CDM來培養(yǎng)原代hESC克隆，最終囊胚建系率均較低（1/12）。分析其原因除了上面提到的機械法的缺點所導致外，在本實驗中影響建系效率的因素還可能有：①用于建系的廢棄胚胎本身來源于染色體異常的患者，胚胎存在染色體異?？赡苄源螅虎趶U胚質量較差，主要為D3小于6細胞的廢棄胚胎，或者是行活檢后因染色體異常廢棄的胚胎，胚胎質量和活檢對胚胎的損傷以及囊胚孵出率都有可能影響建系效率；③既往的建系大多是在有血清的培養(yǎng)體系中進行，而本研究中從原代克隆開始就在無血清條件下培養(yǎng)。無血清條件對原代克隆生長的影響可能導致了低的建系率。雖然本研究的建系率低，但不失為一種全新的嘗試，建立的hESC系從原代開始就未接觸過血清及動物源性物質。在以后的研究中，我們需要借鑒前人的經(jīng)驗，并對培養(yǎng)體系的因子組成進行進一步調整優(yōu)化，以進一步提高建系效率，有望為批量化建立臨床級的hESC系提供可行方案。

使用無血清的CDM來建立hESC系，就需要了解和滿足原代克隆生長所需的條件和機制。許多研究中使用CDM的成分不一，但共用的因子有白蛋白、轉鐵蛋白、胰島素和bFGF，說明這些因子是維持hESC的自我更新中的關鍵性因子。本研究中使用的CDM培養(yǎng)基就是主要由DMEM/F12、人胰島素、轉鐵蛋白、人血清白蛋白和bFGF（20 ng/mL）等組成。胰島素一種是胎兒期所需的重要生長因子，過高或過低的胰島素都會影響新生兒的生長發(fā)育：胰島素受體的變異可引起嚴重的新生兒生長受限，而暴露于高濃度的胰島素可導致巨大胎兒。bFGF和Wnt家族成員對哺乳動物的生長發(fā)育和ESC的信號傳達起著重要作用。白蛋白是血清中主要的蛋白，作為一種載體蛋白，其主要作用是調節(jié)類固醇、甲狀腺素和其它親脂類激素。另外，它還有抗氧化作用，可以結合脂肪酸、離子、藥物以及代謝產(chǎn)物。而且膽固醇還是甾體激素的前體。Meng等［25］在2008年嘗試構建同樣一個hESC培養(yǎng)體系，但研究者的目的在于驗證他們建立的AF-HFF系是否具有支持hESC生長的能力，并未對該培養(yǎng)體系進行深入的分析，也沒有進一步建立完全無動物源性的hESC系。而我們在證實了這個培養(yǎng)體系能維持hESC長期未分化增殖能力后，進一步證實了這個培養(yǎng)體系具有支持原代克隆生長的能力，成功地獲得了新的hESC系，為臨床級的hESC的獲得提供了更優(yōu)化的培養(yǎng)體系和更大的可能。但是，我們的結果顯示，該培養(yǎng)體系的建系率要遠低于其他含血清的培養(yǎng)體系，提示該培養(yǎng)體系仍存在某些缺陷，在將來的研究中還需要努力去完善。

hESC在體外長期培養(yǎng)、傳代和凍存可造成染色體突變，因此，hESC經(jīng)長期體外培養(yǎng)后鑒定其核型的穩(wěn)定性非常重要。常用的hESC傳代為酶消化法傳代，它具有傳代速度快的優(yōu)點。但是用于細胞傳代的酶中常含有動物成分，而且酶長期消化細胞容易引起細胞基因的缺失，而機械法在去除動物成分和維持正常的核型上避免了酶法傳代的缺陷，但缺點是勞動強度大，耗時長，不適用于擴增臨床治療大批量hESC。Ludwing等［26］在一個成分確定的完全無動物源成分的培養(yǎng)系統(tǒng)TesR1中建立了兩個新的hESC系，但是兩個hESC系在該系統(tǒng)傳代過程中先后發(fā)生了染色體畸變，可能為長期酶法傳代或者長期處于超生理濃度的生長因子（如100 ng/mL bFGF）的刺激下所致，也可能與培養(yǎng)體系中存在某些促進染色體變異或者缺少某些維持核型穩(wěn)定的因子有關。我們從細胞系建立后第15代起，每傳代5代直至45代次均對AF-hESC進行核型鑒定，證實均為同一異常核型46，XY，t（1；20）（p13.3；q13.1），并且與該胚胎的活檢核型相符。因此我們認為該xeno-free體系具有讓新建立的hESC系長期保持核型穩(wěn)定的能力。近年來，多潛能誘導性的干細胞（induced pluripotent stem cell，iPS）的出現(xiàn)為干細胞系的來源提供了另一種的途徑，并且避免了倫理學爭議等問題，已成為干細胞研究的熱點。但是，iPS細胞系仍然存在許多問題。人胚胎干細胞中尚未解決的問題，如干細胞自我更新和分化等行為的調控機制、體外定向分化誘導等，iPS同樣不能解決。而另一方面，iPS細胞又引入了諸多新的問題，例如誘導體細胞重編程的分子機制尚不明確、逆轉錄病毒和慢病毒的載體有誘發(fā)腫瘤的潛在風險、基因轉染也存在感染的潛在風險、iPS細胞的轉染率等等。由此看來，人胚胎干細胞特別是PGT來源的攜帶遺傳性疾?。ɡ绲刂泻Ｘ氀?、脊髓肌萎縮、遺傳性耳聾等一系列單基因疾?。┑膆ESC系的建立，在臨床應用及研究等方面仍具有不可替代的優(yōu)勢，臨床級的人胚胎干細胞在臨床治療和基礎研究領域仍具有廣闊的應用前景［27］。

但是，建立符合臨床標準的hESC系只是臨床治療的第一步，并不是終極目標。hESC在疾病治療中是扮演活性藥物成分還是原材料的角色，或者只是中間產(chǎn)物，到目前還沒有明確定位。在hESC系建立以后，大規(guī)模的生產(chǎn)繁殖以及定向分化，還存在著更大的挑戰(zhàn)。