轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶3(TGM3)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌(HCC)增殖侵襲的潛在機(jī)制及其臨床意義

羊樟福 胡 博 付佩堯 喻敏成 徐 泱

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝腫瘤外科-復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所 上海 200032)

原發(fā)性肝癌惡性程度高,在全世界常見惡性腫瘤中發(fā)病率排第6位,死亡率居第2位,其中約有一半的新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在我國[1]。肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的類型,約占90%[2]。近年來,盡管在HCC早診、早治方面已取得巨大進(jìn)步,但患者總體預(yù)后仍較差[3-5]。由于起病隱匿,超過60%的HCC患者在首次就診時(shí)已處于中晚期,因此錯(cuò)失手術(shù)機(jī)會(huì)。接受根治性切除術(shù)的患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)率高達(dá)19%～25%,5年復(fù)發(fā)率超過70%[6-11]。因此,研究HCC發(fā)生、發(fā)展規(guī)律,探尋新的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)來提高臨床治療效果意義重大。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶家族(transglutaminases,TGMs)是一類結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)性蛋白,主要以鈣離子依賴性方式催化蛋白質(zhì)谷氨酸殘基與賴氨酸殘基形成共價(jià)交聯(lián)來完成特定蛋白的翻譯和修飾,目前已在人體中發(fā)現(xiàn)9種轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶亞型[12-13],其中包括TGM3。TGM3廣泛表達(dá)于小腸、腦、皮膚和毛囊,在角質(zhì)化細(xì)胞套膜骨架形成及毛發(fā)的生成中起重要作用[14]。TGM3表達(dá)異常與多種腫瘤發(fā)生相關(guān),包括喉癌[15]、食管鱗狀細(xì)胞癌[16]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[17]、頭頸部鱗癌[18]、皮膚基底細(xì)胞癌[19]等。Uemura 等[16]通過熒光差異雙向電泳和組織芯片研究發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌中TGM3高表達(dá)患者預(yù)后較好。Wu 等[18]發(fā)現(xiàn)外源性高表達(dá)TGM3可以抑制頭頸部鱗癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡。劉軍等[15]通過流式技術(shù)研究50例喉癌與癌旁組織TGM3表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)TGM3在喉癌中低表達(dá)并且與腫瘤轉(zhuǎn)移、分化及臨床分期相關(guān)。以上研究表明TGM3參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程,但在HCC中尚未見報(bào)道。

本文首先通過HCC根治性切除術(shù)后患者的病理標(biāo)本和隨訪資料,探究TGM3在HCC及癌旁的表達(dá)水平及其對(duì)于HCC預(yù)后的預(yù)測價(jià)值;其次通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究TGM3對(duì)于HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響;最后對(duì)TGM3在HCC發(fā)揮作用的可能分子機(jī)制進(jìn)行初步研究。

資 料 和 方 法

患者信息收集28例2018年1月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院行HCC根治性切除術(shù)患者的癌和癌旁組織,用于檢測TGM3在mRNA和蛋白水平在癌和癌旁的表達(dá)差異。同時(shí)選取從2012年1月至12月在我院行HCC根治性切除術(shù)的患者92例,分析TMA染色結(jié)果及隨訪資料。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)審查,相關(guān)患者均簽署知情同意書。

細(xì)胞培養(yǎng)人HCC細(xì)胞系(7721、Huh7、HepG2)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。人HCC細(xì)胞系(L02、MHCC97H、MHCC97L和HCCLM3)由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所提供。所有細(xì)胞均用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基(美國賽默飛世爾科技公司)置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

qRT-PCR使用RNeasy mini kit(德國Qiagen公司)提取細(xì)胞總RNA,然后使用SuperScript Ⅲ Platinum SYBR green one-step qRT-PCR kit (美國賽默飛世爾科技公司)檢測目的基因表達(dá)量。反應(yīng)體系SuperScript?Ⅲ RT/Platinum?Taq Mix 1 μL,2×SYBR?Green Reaction Mix 25 μL,上下游引物各1 μL,ROX染料 0.1 μL,總RNA 5 μL,ddH2O 16.9 μL。反應(yīng)條件:cDNA合成50 ℃、3 min;預(yù)變性95 ℃、5 min;95 ℃、15 s,60 ℃、30 s 重復(fù)40個(gè)循環(huán)。使用GAPDH作為內(nèi)參。所用引物序列如下:TGM3,F:5’-ATGGCTGCTCTAGGAGTCCAG-3’,R:5’-GTTTTGGCCTCTCCGCAAGAT-3’;GAPDH,F:5’-ATGGGGAAGGTGAAGGT-3’,R:5’-AAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。用2-ΔΔCt值表示HCC的TGM3表達(dá)水平相對(duì)于癌旁的變化。

Western blot使用RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)裂解細(xì)胞,12 000×g離心10～15 min后收集上清,再用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度。配置SDS-PAGE凝膠后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,一抗4 ℃孵育過夜:TGM3 (1∶500)、pAKT (1∶1 000),ERK (1∶500)、pERK (1∶750)、p65 (1∶500)、Caspase 3 (1∶1 000)、Cleaved caspase 3 (1∶500)、E-Cadherin (1∶1 000)、N-Cadherin (1∶800)、Fibronection (1∶750)、Vimentin (1∶800),購自英國Abcam公司;GAPDH (1∶2 000,美國Proteintech公司);AKT (1∶800,美國CST公司);p-p65 (1∶500,美國BD公司),匹配二抗(英國Abcam公司)室溫孵育2 h,ECL化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果。使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

細(xì)胞增殖檢測取對(duì)數(shù)期細(xì)胞,消化、計(jì)數(shù)后96孔板鋪板,每孔5 000個(gè)細(xì)胞,100 μL體系,培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間后加入10 μL CCK-8(日本東仁化學(xué)研究所),孵育2 h后于450 nm波長處檢測吸光度(D),連續(xù)測量4天。

克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期細(xì)胞,消化、計(jì)數(shù)后6孔板鋪板,每孔1 000個(gè)細(xì)胞,2 mL體系,每4天換液1次,2周后去除培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定,0.05%結(jié)晶紫染色后拍照、計(jì)數(shù)。

Transwell小室細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)稀釋Matrigel (美國Corning公司)至工作濃度,包被Transwell小室。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)后加入小室上室,每個(gè)上室加入105個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)體系為100 μL 含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基,小室下室加入600 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,作為趨化因素。置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24或48 h,觀察到有適量細(xì)胞穿出到下層即可終止實(shí)驗(yàn)。取出小室,甲醇固定、結(jié)晶紫染色后拍照計(jì)數(shù),記錄200×放大倍數(shù)下10個(gè)隨機(jī)視野。遷移實(shí)驗(yàn)方法同上,但無需在小室上包被Matrigel。

TGM3敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建TGM3慢病毒敲減載體由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建,共構(gòu)建2個(gè)敲減載體shTGM3-1、shTGM3-2及一個(gè)陰性對(duì)照(Mock)。轉(zhuǎn)染前一天6孔板鋪板,每孔1×105個(gè)細(xì)胞,轉(zhuǎn)染時(shí)用含5 μg/mL聚凝胺培養(yǎng)基稀釋慢病毒至適宜濃度后與細(xì)胞混合,轉(zhuǎn)染12 h后換回常規(guī)培養(yǎng)基,3 μg/mL嘌呤霉素篩選3天后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

組織芯片與免疫組化本研究利用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)法進(jìn)行免疫組化染色。手術(shù)切除標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋、切片后保存于4 ℃。脫蠟復(fù)水和抗原修復(fù)后于4 ℃過夜孵育TGM3一抗,然后37 ℃二抗孵育30 min,最后行DAB顯色和蘇木精復(fù)染。TGM3染色結(jié)果判定方法如下,A:根據(jù)瘤細(xì)胞著色深淺分為4個(gè)等級(jí),即0(不著色)、1(淺黃色)、2(棕黃色)、3(棕褐色);B:根據(jù)顯色細(xì)胞比例也分成4個(gè)等級(jí),即1 (1%～10%)、2 (11%～50%)、3 (51%～80%)、4 (>80%);評(píng)分=A×B,0～4分:低表達(dá);5～12分:高表達(dá)。

裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)10只6周齡雄性裸鼠購于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,在SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng),適應(yīng)3天后,將裸鼠隨機(jī)分成兩組,每組5只,選擇Huh7細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分別于左側(cè)腋下注射5×106個(gè)shTGM3-2 (實(shí)驗(yàn)組)和Mock細(xì)胞(對(duì)照組),5周后頸椎脫臼法處死小鼠,取瘤測量后計(jì)算腫瘤體積,計(jì)算公式為:體積=0.5×長×寬2。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)型變量采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析,分類變量采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。用Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗(yàn)研究TGM3與患者復(fù)發(fā)時(shí)間或總生存時(shí)間(overall survival,OS)的關(guān)系。用Cox回歸模型研究多因素對(duì)于患者生存和復(fù)發(fā)的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

TGM3在HCC中高表達(dá)檢測28例HCC患者癌和癌旁組織TGM3 mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在46.4%的HCC組織中TGM3明顯高表達(dá)(≥2倍,圖1A),進(jìn)一步檢測蛋白質(zhì)水平的變化,發(fā)現(xiàn)TGM3蛋白在HCC中的表達(dá)亦顯著升高(圖1B)。

TGM3高表達(dá)HCC患者預(yù)后較差對(duì)92例在行HCC根治性切除術(shù)患者的癌和癌旁組織組成的組織芯片進(jìn)行免疫組化分析,根據(jù)染色結(jié)果將患者分為TGM3高表達(dá)和TGM3低表達(dá)組(圖1C),結(jié)合臨床隨訪數(shù)據(jù)分析患者不同臨床病理參數(shù)與TGM3表達(dá)水平之間的關(guān)系(表1)。TGM3表達(dá)水平與埃德蒙森分級(jí)(Edmondson stage)顯著相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析表明TGM3高表達(dá)組的中位復(fù)發(fā)時(shí)間和中位生存期均較低表達(dá)組顯著縮短(15.00個(gè)月vs.49.25個(gè)月,P<0.05,圖1D;38.63個(gè)月vs.未達(dá)到,P<0.05;圖1E)。多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn),TGM3的表達(dá)高低對(duì)于復(fù)發(fā)時(shí)間和生存時(shí)間的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=2.31,95%CI:1.08～4.91,P=0.029;HR=2.78,95%CI:1.28～6.00,P=0.009;表2)。以上結(jié)果表明,TGM3表達(dá)量較高的HCC患者預(yù)后較差,TGM3是HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)和死亡的獨(dú)立預(yù)后因素。

A:Relative TGM3 expressions assessed via qRT-PCR from tumors and paired adjacent normal liver tissues of 28 HCC patients.B:Representative TGM3 protein levels assessed via Western blot from tumors (T) and paired adjacent normal liver tissues (N) of HCC patients.C:Typical IHC images of HCC specimens that define high or low expression staining for TGM3 on TMA (bar=100 μm).D:Kaplan-Meier analysis of recurrence in HCC patients with different levels of TGM3 expression.E:Kaplan-Meier analysis of OS in HCC patients with different levels of TGM3 expression.

圖1 TGM3在HCC患者癌和癌旁組織的表達(dá)水平及其對(duì)患者預(yù)后的影響
Fig 1 The expression level of TGM3 in HCC tumors and adjacent normal liver tissues and its clinical relevance with patient outcome

TGM3下調(diào)抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲分別在mRNA和蛋白水平評(píng)估HCC細(xì)胞系(L02、7721、Hep G2、Huh7、LM3、97H、97L)內(nèi)源性TGM3的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)TGM3在Huh7、LM3和97H細(xì)胞株的mRNA和蛋白表達(dá)水平都較高(圖2A)。選取Huh7和97H細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)的基因敲減實(shí)驗(yàn),分別用2個(gè)慢病毒載體(shTGM3-1和shTGM3-2)敲減細(xì)胞,Western blot檢測敲減結(jié)果(圖2B)顯示TGM3表達(dá)明顯降低。利用TGM3敲減細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照相比,下調(diào)TGM3表達(dá)顯著抑制HCC細(xì)胞的增殖(P<0.05,圖2C);與增殖實(shí)驗(yàn)一致,克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)TGM3表達(dá)可顯著抑制HCC細(xì)胞克隆形成(P<0.01,圖2D)。利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)估下調(diào)TGM3表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響,發(fā)現(xiàn)干擾后細(xì)胞遷移和侵襲能力均顯著下降(P<0.05,圖2E和2F)。以上結(jié)果表明,TGM3下調(diào)能抑制HCC細(xì)胞Huh7和97H的增殖、遷移和侵襲。

表1 入組患者臨床病理參數(shù)分析Tab 1 Correlation between clinicopathological parameters of patients enrolled

ALT:Alanine aminotransferase;AST:Aspartate transaminase;AFP:α-fetoprotein;BCLC:Barcelona clinic liver cancer.

TGM3下調(diào)抑制HCC細(xì)胞皮下成瘤通過Huh7細(xì)胞裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究TGM3對(duì)HCC成瘤能力影響。將實(shí)驗(yàn)組(shTGM3-2)和對(duì)照組(Mock)細(xì)胞各5×106個(gè)分別接種于兩組小鼠左側(cè)腋下,5周后處死小鼠取瘤,觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積顯著小于對(duì)照組(P<0.05,圖3),提示TGM3表達(dá)降低可以抑制HCC細(xì)胞系Huh7的皮下成瘤能力。

TGM3下調(diào)抑制HCC細(xì)胞生長、遷移相關(guān)信號(hào)通路并促進(jìn)調(diào)亡PI3K/AKT、MAPK/ERK及NF-κB信號(hào)通路處于細(xì)胞信號(hào)通路網(wǎng)的重要節(jié)點(diǎn),在細(xì)胞的生長、增殖、分化、代謝、凋亡、運(yùn)動(dòng)等過程中起重要作用,它們的調(diào)控異常與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[20-22]。利用Western blot驗(yàn)證相關(guān)信號(hào)通路蛋白的變化(圖4A),探究TGM3影響HCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及皮下成瘤能力的具體機(jī)制,發(fā)現(xiàn)TGM3下調(diào)后AKT及ERK的磷酸化水平均下降,同時(shí)引起下游p65磷酸化水平降低。同時(shí)檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase 3的變化水平,發(fā)現(xiàn)其在TGM3下調(diào)的細(xì)胞中表達(dá)升高。以上結(jié)果表明,TGM3下調(diào)后可能通過PI3K/AKT、MAPK/ERK及NF-κB信號(hào)通路減弱HCC的生長和轉(zhuǎn)移,同時(shí)促進(jìn)凋亡。

表2 復(fù)發(fā)與死亡的多因素Cox回歸分析Tab 2 Multivariate Cox proportional regression analysis of factors associated with recurrence and deadth

BCLC:Barcelona clinic liver cancer;HR:Hazard ratio.

A:TGM3 expression in HCC cell lines assessed by qRT-PCR and Western blot;B:Validation of TGM3 depletion assessed by Western blot in Huh7 and 97H cells;C:Proliferation of Huh7 and 97H cells with TGM3 depletion assessed by CCK-8 assays;D:Proliferation of Huh7 and 97H cells with TGM3 depletion assessed by colony formation assays (bar=5 μm);E:Migration of Huh7 and 97H cells with TGM3 depletion evaluated by Transwell assays without Matrigel (bar=100 μm);F:Invasion of Huh7 and 97H cells with TGM3 depletion evaluated by Transwell assays with Matrigel (bar=100 μm).(1)vs.mock,P<0.05.

圖2 常見HCC細(xì)胞系內(nèi)源性TGM3表達(dá)水平及TGM3下調(diào)后對(duì)于HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響
Fig 2 The endogenous TGM3 expression levels of common HCC cell lines and the influence of TGM3 depletionon cell proliferation,migration and invasion

TGM3下調(diào)抑制HCC細(xì)胞EMT過程EMT與細(xì)胞的遷移侵襲能力密切相關(guān)[23],我們已經(jīng)通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGM3下調(diào)后HCC細(xì)胞遷移、侵襲能力下降。Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白變化(圖4B)結(jié)果表明,TGM3敲減后,上皮表型標(biāo)志物E-鈣黏素表達(dá)水平上調(diào),間葉表型標(biāo)志物N-鈣黏素、纖維連接蛋白及波形蛋白均下調(diào),表明TGM3下調(diào)后能抑制HCC細(xì)胞EMT過程。

A:Macrograph of subcutaneous tumors;B:Statistic of tumor volumes.

圖3 TGM3下調(diào)后對(duì)Huh7細(xì)胞皮下成瘤能力的影響
Fig 3 The influence of TGM3 depletion of Huh7 on subcutaneous xenotrans planted tumorigenesis

A:Effect of TGM3 depletion on the activation status of AKT,ERK,p65 and caspase 3 assessed by Western blot in Huh7 and 97H cells.B:Effect of TGM3 depletion on the expression of EMT markers assessed by Western blot in Huh7 and 97H cells.

圖4 TGM3下調(diào)對(duì)HCC細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡和EMT相關(guān)標(biāo)志物的影響
Fig 4 The influence of TGM3 depletion on the markers of HCC signaling pathways,apoptosis and EMT

討 論

TGM3廣泛表達(dá)于小腸、腦、皮膚和毛囊,在角質(zhì)化細(xì)胞套膜骨架形成及毛發(fā)的生成中起重要作用。TGM3表達(dá)異常與多種腫瘤發(fā)生相關(guān),在喉癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌及頭頸部鱗癌中的研究顯示TGM3在腫瘤組織中低表達(dá),可能是腫瘤抑制因子[15-18]。TGM3在HCC中的作用尚未見報(bào)道。本文旨在研究TGM3對(duì)于HCC的發(fā)生、發(fā)展有無影響。首先,通過比較TGM3在HCC及癌旁組織的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn),TGM3在HCC中高表達(dá),進(jìn)一步結(jié)合臨床隨訪數(shù)據(jù),利用Kaplan-Meier及Cox回歸分析發(fā)現(xiàn),TGM3表達(dá)水平是HCC術(shù)后復(fù)發(fā)和死亡的獨(dú)立影響因素,TGM3高表達(dá)的患者術(shù)后復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)更高。所以在臨床實(shí)踐中,如果HCC患者術(shù)后病理提示TGM3高表達(dá),臨床醫(yī)師可采取更加積極的治療措施來預(yù)防患者的復(fù)發(fā)和死亡。但這只是單中心少量樣本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果,在臨床中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值還需要多中心及更大樣本量的數(shù)據(jù)支持。

為研究TGM3對(duì)HCC的生物學(xué)作用,我們利用shRNA降低HCC細(xì)胞系中TGM3的表達(dá)水平,通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TGM3下調(diào)后HCC細(xì)胞的增殖能力減弱,裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)論。Transwell小室實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了下調(diào)TGM3的表達(dá)能夠減弱HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。以上結(jié)果表明,TGM3可能通過影響細(xì)胞增殖和遷移等相關(guān)信號(hào)通路促進(jìn)HCC的生長和轉(zhuǎn)移。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生命活動(dòng)中起重要的調(diào)控作用,通過與其他信號(hào)通路的相互作用共同影響細(xì)胞生長、增殖、代謝、遷移等多種病理生理過程,PI3K/AKT及MAPK/ERK信號(hào)通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[20-21,24]。本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGM3下調(diào)后可以抑制HCC細(xì)胞AKT和ERK的磷酸化水平。AKT下游可以激活NF-κB信號(hào)通路,而NF-κB信號(hào)通路的異常激活在腫瘤侵襲和凋亡方面起重要作用[25-26]。本研究通過Western blot證實(shí)TGM3下調(diào)后p65蛋白的磷酸化水平降低,凋亡蛋白cleared caspase 3水平升高。

PI3K/AKT、MAPK/ERK、NF-κB信號(hào)通路都能對(duì)EMT過程起調(diào)控作用,而EMT與腫瘤的侵襲密切相關(guān)。在EMT過程中,上皮表型標(biāo)志物E-鈣黏素下調(diào),間葉表型標(biāo)志物N-鈣黏素、纖維連接蛋白及波形蛋白上調(diào)。EMT能使上皮細(xì)胞失去極性及細(xì)胞間黏附,獲得遷移和侵襲性質(zhì),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[27-28]。Transwell小室實(shí)驗(yàn)已證實(shí)下調(diào)TGM3表達(dá)能減弱HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力,通過Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白的變化,證實(shí)TGM3下調(diào)能抑制EMT過程。

我們認(rèn)為TGM3可能通過激活PI3K/AKT、MAPK/ERK、NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)EMT過程和抑制凋亡來促進(jìn)HCC的發(fā)生和發(fā)展,TGM3可能是腫瘤促進(jìn)因子,這與既往文獻(xiàn)有一定差異。由于腫瘤遺傳及代謝的高度異質(zhì)性,同一個(gè)基因在不同腫瘤中可能存在不同的功能,甚至在同一類型腫瘤的不同階段也會(huì)產(chǎn)生不同作用[29]。因此,TGM3在不同腫瘤中可能扮演著不同的角色。

本研究的不足之處在于:首先,TGM3是如何參與調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路并影響下游重要信號(hào)分子的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的闡明;其次,TGM3作為臨床預(yù)后指標(biāo)的價(jià)值還需要更大樣本量的驗(yàn)證。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)TGM3可能通過影響多條信號(hào)通路和EMT過程促進(jìn)HCC的增殖和侵襲,TGM3可作為HCC患者潛在的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。