臭鱖魚發(fā)酵工藝優(yōu)化及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

楊召俠 劉灑灑 高 寧 朱容仟 紀(jì)超凡 董秀萍 楊 松 閆曉明 林心萍*

（1大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連 116034

2國家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連 116034

3安徽省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 合肥 230000）

臭鱖魚，又稱為腌鮮魚，它是以新鮮鱖魚為原料，經(jīng)過發(fā)酵而得。鱖魚具有生長快，肉嫩味美，營養(yǎng)價值高等的特點。經(jīng)過發(fā)酵作用，魚體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪及其它有機(jī)物被降解成氨基酸、游離脂肪酸、核苷酸及其它小分子物質(zhì)，使得魚體散發(fā)出似臭非臭的氣味。再經(jīng)過烹飪，產(chǎn)生一種獨有的臭香味，臭鱖魚也因此得以聞名，成為傳統(tǒng)徽式名菜的代表。

臭鱖魚作為中國傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品，其生產(chǎn)現(xiàn)仍以家庭作坊式的自然發(fā)酵為主，周期長，發(fā)酵工藝過程研究較少，關(guān)鍵工藝參數(shù)等的描述較為模糊，產(chǎn)品品質(zhì)難以控制。市場上采用傳統(tǒng)工藝加工的臭鱖魚極少。目前大部分飯店出售的臭鱖魚都采用臭豆腐熏制而成，其風(fēng)味物質(zhì)來源于臭豆腐，而非鱖魚肉自身發(fā)酵產(chǎn)生的。對臭鱖魚加工過程的關(guān)鍵參數(shù)及其特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究，是開發(fā)臭鱖魚產(chǎn)品的前提和急待解決的問題。

本試驗中采用正交試驗設(shè)計研究臭鱖魚關(guān)鍵發(fā)酵工藝參數(shù)（發(fā)酵時間、鹽度、發(fā)酵溫度），采用感官評價篩選出品質(zhì)最優(yōu)的試驗組，并用電子鼻和SPME（固相微萃?。?GC-MS檢測臭鱖魚產(chǎn)品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，為加快臭鱖魚的工業(yè)化進(jìn)程提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱖魚，購自大連新長興市場；調(diào)味料（八角、茴香、辣椒粉、孜然、花椒、蔥姜、食鹽等），沃爾瑪超市；2，4，6-三甲基吡啶，Aladdin 公司；C6-C20 正構(gòu)烷烴，Sigma公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

PEN3型便攜式電子鼻，德國AIRSENSE公司；Agilent 7890A/5975C-GC/MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備 根據(jù)查找資料[1-5]及預(yù)試驗結(jié)果，影響鱖魚發(fā)酵及口感的因素有：發(fā)酵時間、溫度、鹽度。利用Mini tab軟件設(shè)計3因素4水平正交試驗表，做 L16（43）正交試驗。

1.3.2 感官評價方法 參考文獻(xiàn)[6]，選取具有食品感官評定基本知識的相關(guān)專業(yè)學(xué)生10名，事先進(jìn)行臭鱖魚加工知識、臭鱖魚審評標(biāo)準(zhǔn)及審評方法的培訓(xùn)。該10名學(xué)生組成感官評價小組，分別對產(chǎn)品的組織狀態(tài)、色澤、氣味、口感、滋味5個指標(biāo)進(jìn)行感官評價。感官評價標(biāo)準(zhǔn)[7-8]見表2。對感官評分結(jié)果按照組織狀態(tài)、色澤、氣味、口感、滋味分別占 0.1，0.1，0.15，0.3，0.35 的權(quán)重[7]計算分值。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Factors and levels orthogonal text

表2 臭鱖魚的感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table2 Sensory evaluation standard of the stinky mandarin fish

1.3.3 電子鼻檢測方法 發(fā)酵完成的鱖魚，蒸制10 min，取肉打漿；稱取（10± 0.1）g樣品放入 40 mL頂空瓶中，加蓋密封，放入30℃恒溫箱中待檢。檢測前，用空氣對電子鼻檢測系統(tǒng)進(jìn)行清洗。將電子鼻吸氣口插入樣品瓶中測定，測定時間70 s，可滿足所有的傳感器達(dá)到穩(wěn)定值；數(shù)據(jù)記錄的時間間隔是0.1 s[9]?？諝馇逑刺结樀臅r間為60 s，檢測完成后保存數(shù)據(jù)。

電子鼻傳感陣列如表3所示。

表3 PEN 3型電子鼻傳感器陣列Table3 PEN 3 e-nose sensor arrays

1.3.4 GC-MS檢測方法 按照1.3.3節(jié)方法處理。稱取3.0 g（精確至0.1 g）樣品貼壁放入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加蓋密封。將樣品在60℃下孵育30 min，萃取40 min完成抽取。

氣-質(zhì)譜聯(lián)用儀條件：色譜柱為HP-5 MS，30 m×250 μm×0.25 μm（美國安捷倫公司）。

氣相色譜條件：初溫30℃，保持5 min；以3℃/min升至50℃，保持3 min；5℃/min升至150℃；20℃/min升至250℃，保持5 min[10]。進(jìn)樣口溫度 260 ℃，載氣流速（He）1.5 mL/min，不分流模式進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）電離模式，電子能量70 eV；全譜掃描，質(zhì)量掃描范圍29～400 u；四極桿檢測器溫度150℃。以與樣品相同的GC-MS條件檢測正構(gòu)烷烴，計算保留指數(shù)（RI）。利用NIST11譜庫檢索（MS）及RI值比對，對化合物進(jìn)行定性分析。

RI值計算公式：

式中：X——未知化合物；Z，Z+1——分別為未知化合物流出前、后正構(gòu)烷烴所含碳原子的數(shù)目；R（X），R（Z），R（Z+1）分別表示未知化合物及碳原子數(shù)為Z，Z+1正構(gòu)烷烴的保留時間。

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定量方法

1.3.5.1 內(nèi)標(biāo)物的配制 選用2，4，6-三甲基吡啶為內(nèi)標(biāo)，利用去離子水將2，4，6-三甲基吡啶配制成50 mg/L的母液，使用時將母液稀釋100倍，即質(zhì)量濃度為0.5 mg/L，使用量為60 μL。

1.3.5.2 定量方法 通過內(nèi)標(biāo)法對臭鱖魚中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定量分析，用內(nèi)標(biāo)物的峰面積與揮發(fā)性化合物峰面積的比值計算化合物的濃度。計算公式：

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

由感官評定小組對正交試驗設(shè)計的16組試驗結(jié)果進(jìn)行感官評分，所得分?jǐn)?shù)按照方法1.3.2節(jié)所述進(jìn)行加權(quán)平均計分，結(jié)果見表4。B因素（發(fā)酵溫度）對感官評定的影響最大，其次是因素C（發(fā)酵鹽度），影響最小的為因素A（發(fā)酵時間）。感官評分最高的組合是A2B1C2，由極差得到影響感官評分的主次因素：B＞C＞A。根據(jù)正交試驗得到的最優(yōu)工藝組合為A2B3C2。綜上，臭鱖魚最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為：發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵溫度12℃、添加鹽含量為6%。

表4 臭鱖魚的感官評分結(jié)果Table4 Sensory evaluation results of the stinky mandarin fish

2.2 電子鼻檢測結(jié)果

對發(fā)酵7d的鱖魚及新鮮鱖魚進(jìn)行電子鼻檢測，用SPSS軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）。主成分分析是設(shè)法將原來眾多具有一定相關(guān)性的幾個指標(biāo)，重新組合成一組新的互相無關(guān)的綜合指標(biāo)來代替原來的指標(biāo)，以評價原來變量的信息。在PCA主成分分析圖中，距離越遠(yuǎn)的兩組差異越大，距離越近的兩組差異越小。由表5可知第一主成分的貢獻(xiàn)率為98.171%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為1.252%，累計貢獻(xiàn)率為99.423%，累計貢獻(xiàn)率大于80%可以進(jìn)行PCA分析[9]。利用Origin軟件制作PCA圖，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯鲂掳l(fā)酵7d鱖魚與新鮮鱖魚的主成分有明顯的差異，可將發(fā)酵鱖魚與新鮮鱖魚區(qū)分開。

采用雷達(dá)圖對電子鼻數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。發(fā)酵7 d的鱖魚與新鮮鱖魚相比R（5）（烴類）、R（6）（芳香類）、含硫類化合物及醇類變化明顯。提示臭鱖魚發(fā)酵前后，烴類、芳香類、含硫類化合物及醇類有較大改變。

表5 解釋的總方差Table5 Total variance explained

圖1 新鮮鱖魚與發(fā)酵7d的臭鱖魚主成分分析圖Fig.1 Principal component analyses of the fresh and stinky mandarin fish fermented 7 days

圖2 新鮮鱖魚及發(fā)酵7d的臭鱖魚電子鼻數(shù)據(jù)的雷達(dá)圖分析Fig.2 Radar map analysis of fermented 7 days and fresh Mandarin fish

2.3 GC-MS檢測結(jié)果

采用頂空固相微萃取的方法結(jié)合GC-MS分析新鮮鱖魚及臭鱖魚的揮發(fā)性物質(zhì)，得到發(fā)酵7 d及新鮮鱖魚的揮發(fā)性物質(zhì)。經(jīng)過NIST譜庫檢索，發(fā)酵鱖魚中檢出67種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，各種揮發(fā)性物質(zhì)及相對含量見表6。檢出的67種揮發(fā)性物質(zhì)中有醇類17種，酮類6種，醛類5種，酸類2種，酯類3種，含氮化合物2種，含硫化合物2種，芳香族化合物11種和含碳?xì)浠衔?0種。在總的揮發(fā)性物質(zhì)中醇類的總含量為10 887.04 ng/100 g，是主要的揮發(fā)性物質(zhì)；其次是酮類4 106.79 ng/100 g，含氮化合物 3 140.08 ng/100g，醛類136.51 ng/100 g，依次為含碳?xì)浠衔铩⒎枷阕寤衔?、酯類、酸類及含硫化合物。而在新鮮鱖魚中共檢出30中揮發(fā)性物質(zhì)，依次為醛類 （3 827.61 ng/100 g），醇類 （276.49 ng/100 g），酮類（201.31 ng/100 g），芳香族類（169.10 ng/100 g），酯類（131.87 ng/100 g），含碳?xì)浠衔铮?9.28 ng/100 g），含硫化合物（17.95 ng/100 g），酸類（10.07 ng/100 g）及含氮化合物（2.13 ng/100 g）。可以看出發(fā)酵鱖魚與新鮮鱖魚相比，無論是揮發(fā)性物質(zhì)的種類還是數(shù)量都存在明顯差異。

表6 臭鱖魚揮發(fā)性化合物分析Table6 Analysis of the volatile compounds of stinky mandarin fish

（續(xù)表6）

（續(xù)表6）

由表6可知，臭鱖魚中存在著大量的醇類物質(zhì)，是新鮮鱖魚的39.38倍。其含量由高到低依次為α-松油醇、茴香甲醇、4-萜烯醇、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、1-甲基-4-（1-甲基亞乙基）-環(huán)己醇、1，3，3-三甲基雙環(huán)[2.2.1]-庚-2-醇、4，6，6-三甲基-[1S-（1α，2β，5α）]-雙環(huán)[3.1.1]庚-3-烯-2-醇、2-甲基-5-異丙基-二環(huán)[3.1.0]己烷-2-醇、2，6，6-三甲基-2-環(huán)己烯-1-甲醇、2-庚炔-1-醇、1，5-脫水-2-脫氧-D-阿拉伯-己-1-烯醇、反式-3-賴氨-2-醇、1，14-十四烷二醇、4，7，7-三甲基-雙環(huán)[4.1.0]庚-3-醇、3，7，11-三甲基-1-十二烷醇。醇類物質(zhì)被認(rèn)為是脂肪酸氧化的產(chǎn)物[11]，推測可能是鱖魚在發(fā)酵過程中，豐富的脂肪酸氧化分解為醇類物質(zhì)，使其風(fēng)味增加。該結(jié)果與發(fā)酵魚露中檢測到幾種低濃度的酯類及醇類[12]對魚露的風(fēng)味起重要作用相類似。

酮類物質(zhì)含量是僅次于醇類物質(zhì)含量的第二大類揮發(fā)性物質(zhì)。從臭鱖魚中檢測的酮類物質(zhì)總量為新鮮鱖魚的20.40倍，包括6種化合物，依次為 2-甲基-3-辛酮、胡椒酮、2（1H）-喹啉酮、對乙基苯乙酮、2，2，6-三甲基-反式-1-氧雜螺[2.5]辛-4-酮及 5，9-二甲基-2-（1-甲基乙基）-1-環(huán)癸酮。胡椒酮具有類似樟腦和薄荷的香味，C4-C9酮類物質(zhì)是通過β-氧化產(chǎn)生的，能夠產(chǎn)生較為強(qiáng)烈的氣味且有較低的閾值[13]，是食物重要的成香物質(zhì)。例如，發(fā)酵香腸[14]中2，3-辛二酮等酮類是構(gòu)成其奶油香氣，賦予其特殊風(fēng)味的重要成分。

在發(fā)酵鱖魚中檢測到5種醛類物質(zhì)，包括己醛、庚醛、壬醛、癸醛、（3，3-二甲基亞環(huán)己基）-乙醛。其中壬醛具玫瑰、柑橘等香氣，有強(qiáng)的油脂氣味。在發(fā)酵過程中，脂肪及脂肪組織發(fā)生脂解作用，產(chǎn)生的游離脂肪酸是氧化反應(yīng)的底物，脂肪氧化產(chǎn)生的主要物質(zhì)是醛類[15]。脂肪醛具有較低的閾值，大部分具有灼燒后的味道[16]，也是構(gòu)成肉制品特殊風(fēng)味的重要物質(zhì)[17-18]。

在新鮮鱖魚中檢出1種酸類化合物，在發(fā)酵鱖魚中檢出2種酸類化合物，酸類化合物大部分來自碳水化合物分解的產(chǎn)物[19]，還有一部分來自脂肪的氧化和氨基酸的微生物發(fā)酵[16]。在發(fā)酵鱖魚中的兩種酸類分別是油酸和棕櫚酸，這些長鏈脂肪酸是滋味和風(fēng)味物質(zhì)的前提物質(zhì)，而在腌制食品中不能直接提高產(chǎn)品的感官[20]。

發(fā)酵7d鱖魚與新鮮鱖魚中酯類含量相差不多，種類成分明顯差異。通常，酯類物質(zhì)會賦予產(chǎn)品香甜的果香味[21]。酯類是微生物利用醇和酸進(jìn)行酯化作用產(chǎn)生的[19]。其中甲酸庚酯、己酸甲酯具有堯尾和玫瑰底香果香，有似梅子的甜的香韻[22]。這些酯類物質(zhì)賦予臭鱖魚獨特的酯香味。

含氮化合物在發(fā)酵的鱖魚中共檢測到2種，含量很高。 吲哚（3 097.71 ng/100 g），4-（氨基甲基）-1-乙基吡啶（42.37 ng/100 g），吲哚的含量較高，并具有較低的閾值，在新鮮鱖魚中檢測到少量的吲哚（2.13 ng/100 g），推測吲哚為發(fā)酵鱖魚的特征性風(fēng)味物質(zhì)，主要存在于花油中，呈花香味。在發(fā)酵的鱖魚中共檢測出1種含硫化合物二甲基四硫醚（12.31 ng/100 g），主要是在發(fā)酵過程中微生物分解蛋氨酸產(chǎn)生的[19]，含硫化合物使食品產(chǎn)生不愉快的味道。

芳香族化合物檢測到11種，含量依次為茴香腦、苯酚、雙戊烯、4-甲基苯酚、鄰二甲苯、萘、乙基苯、異丙烯基甲苯、苯甲醛、（1-甲氧基-4-甲基-3-戊烯基）-苯。茴香腦又稱茴香烯，是植物中的一種化學(xué)物質(zhì)，存在于八角小茴香中，帶有甜味，具有茴香特殊的香味[23]。其中雙戊烯又稱為檸檬烯，具有檸檬香味，從干發(fā)酵香腸中檢測出雙戊烯[24]。一些酚類化合物具有藥香味[16]。這些化合物賦予發(fā)酵鱖魚特有的發(fā)酵的味道。

發(fā)酵7 d，從鱖魚中共檢測到20種碳?xì)浠衔?，為新鮮鱖魚的30.20倍。其中β-羅勒烯、松油烯、水芹烯、羅漢柏烯、α-柏木萜烯及反-菖蒲烯是植物中的化學(xué)物質(zhì)具有特殊的香味[23，25]。在發(fā)酵的鱖魚中檢測到這種香味，可能是由于發(fā)酵時放入的植物香料在發(fā)酵過程中釋放到發(fā)酵體系中，后被發(fā)酵體系中的鱖魚吸收。

在所有檢測到的化合物中，變化最明顯的是醇類化合物、酮類化合物及烯烴類化合物，推測這些風(fēng)味成分的改變可能與臭鱖魚的特殊風(fēng)味有關(guān)。

3 結(jié)論

利用正交試驗對臭鱖魚發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵工藝條件：發(fā)酵時間7 d、發(fā)酵溫度12℃、添加鹽含量6%，在此條件下生產(chǎn)的臭鱖魚魚肉呈獨特的蒜瓣狀，具有獨特的香臭味及回香味。利用電子鼻可明顯區(qū)分新鮮鱖魚和發(fā)酵后鱖魚，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中烴類、芳香類、含硫類化合物及醇類有明顯的變化。采用SPME-GC-MS對鱖魚的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測，共檢測到67種揮發(fā)性物質(zhì)，其中包括醇類17種，酮類6種，醛類5種，酸類2種，酯類3種，含氮化合物2種，含硫化合物1種，芳香族化合物11種和含碳?xì)浠衔?0種。鱖魚發(fā)酵前、后醇類化合物增加了39.38倍，酮類化合物增加20.40倍，碳?xì)漕惢衔镌黾?0.20倍，含氮化合物1471.00倍，推測這些風(fēng)味成分的改變可能與臭鱖魚的特殊風(fēng)味有關(guān)。