植物乳桿菌XCT-1對(duì)溫和氣單胞菌群體感應(yīng)及生物膜形成的抑制作用

呂欣然 頡 宇 林 洋 孫夢(mèng)桐 白鳳翎* 張柏林 趙宏飛 勵(lì)建榮

（1渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013

2北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京 100083）

溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）屬于弧菌科、氣單胞菌屬，廣泛分布在不同水生環(huán)境和水產(chǎn)品中，是一種典型的人魚(yú)共患病條件致病菌[1]。其感染魚(yú)、蝦等水產(chǎn)品后釋放溶血素、細(xì)胞毒素以及腸毒素等多種致病因子，引起水產(chǎn)品敗血癥[1]。人類(lèi)食用感染溫和氣單胞菌的水產(chǎn)品后會(huì)出現(xiàn)腹瀉、急性腸胃炎、慢性結(jié)腸炎等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[2]。溫和氣單胞菌的致病因子的表達(dá)受群體感應(yīng)（quorum-sensing，QS）系統(tǒng)的調(diào)控[2]。群體感應(yīng)是細(xì)菌根據(jù)自身細(xì)胞密度變化進(jìn)行自我調(diào)節(jié)的一種群體行為[3]。當(dāng)一個(gè)特定環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量增加時(shí)，細(xì)菌Lux I蛋白所合成的信號(hào)分子的濃度也會(huì)相應(yīng)的升高，當(dāng)信號(hào)分子積累到一定濃度后，就能和細(xì)胞質(zhì)中信號(hào)分子的受體蛋白結(jié)合，使受體蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)一步激活靶基因的表達(dá)，呈現(xiàn)出新的行為特征，如生物膜的形成、毒性基因的表達(dá)、生物發(fā)光和胞外多糖的合成等[4]。

群體感應(yīng)抑制劑 （quorum sensing inhibitor，QSI）通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，控制細(xì)菌生物膜的形成和毒力因子的產(chǎn)生等代謝過(guò)程，從而抑制細(xì)菌在生物體表面的生長(zhǎng)和繁殖[5]。QSI的作用機(jī)制主要包括以下4種機(jī)制：一是抑制信號(hào)分子合成酶或降低其受體蛋白活性；二是抑制信號(hào)分子合成；三是促進(jìn)信號(hào)分子的降解；四是利用信號(hào)分子類(lèi)似物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體蛋白[5-6]。目前，許多研究者從動(dòng)植物和微生物中分離提取了多種QSI，最早被發(fā)現(xiàn)的QSI為紅藻的代謝產(chǎn)物溴化呋喃，能夠有效抑制多種細(xì)菌的QS系統(tǒng)[6]。植物源QSI主要來(lái)自植物中提取的各種活性成分，如香豆素、黑色素、姜黃素、茶多酚和黃酮類(lèi)化合物等。李斌等[7]研究發(fā)現(xiàn)黑木耳提取物能夠抑制細(xì)菌群體感應(yīng)，0.3 g/L的黑木耳提取物對(duì)大腸桿菌的生物膜抑制率為72.26%。動(dòng)物源QSI主要是肉制品中提取的生物堿、腎酰轉(zhuǎn)移酶和脂肪酸等。Truchado等[8]研究表明，蜂蜜提取物對(duì)群體感應(yīng)具有顯著的抑制作用，且來(lái)自于不同地域的同一種植物的蜂蜜，群體感應(yīng)抑制活性沒(méi)有顯著性差異。微生物源QSI主要來(lái)自于一些海洋放線菌、芽孢桿菌和乳酸菌的代謝產(chǎn)物。Musthafa等[9]研究發(fā)現(xiàn)海洋源芽孢桿菌（Bacillus sp.SS4）對(duì)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1）群體感應(yīng)具有抑制活性，0.5 mg/mL芽孢桿菌SS4代謝產(chǎn)物對(duì)生物膜和胞外蛋白酶的抑制率分別為33%和65%。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類(lèi)能利用碳水化合物形成乳酸為主要代謝產(chǎn)物的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的通稱(chēng)，國(guó)際公認(rèn)的安全的食品級(jí)制劑（generally recognized as safe，GRSA），具有安全性、高效性和穩(wěn)定性等特點(diǎn)，在食品領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。目前，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)的乳酸菌群體感應(yīng)抑制劑主要有嗜酸乳桿菌 （Lactobacillus acidophilus）[10]、植物乳桿菌（Lb.plantarum）[11]和清酒乳桿菌（Lb.sakei）[12]。Park 等[12]研究表明，Lb.sakei NR28 具有群體感應(yīng)抑制活性，能夠降低大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC43894的毒力因子和抑制生物膜的形成。國(guó)內(nèi)對(duì)乳酸菌作為群體感應(yīng)抑制劑的研究較少。尋找和開(kāi)發(fā)一株乳酸菌群體感抑制劑具有重要的研究?jī)r(jià)值。

本文從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選對(duì)溫和氣單胞菌群體感應(yīng)具有抑制活性的乳酸菌，研究其對(duì)溫和氣單胞菌生物膜形成的影響，并分析乳酸菌代謝產(chǎn)物中對(duì)群體感應(yīng)抑制的活性成分，進(jìn)而說(shuō)明乳酸菌是群體感應(yīng)抑制劑來(lái)源的重要資源，為開(kāi)發(fā)一種溫和氣單胞菌群體感應(yīng)抑制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)條件 遼寧葫蘆島腌芥菜、遼寧錦州發(fā)酵酵頭、安徽績(jī)溪酸豆角和腌雪菜、內(nèi)蒙古寧城酸辣椒和遼寧彰武酸黃瓜等傳統(tǒng)農(nóng)家發(fā)酵食品。

紫色桿菌（Chromobacterium violaceum CV026），本實(shí)驗(yàn)室保藏。菌株本身不產(chǎn)生N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類(lèi)信號(hào)分子（AHLs），當(dāng)外源AHLs存在時(shí)，菌株CV026可以產(chǎn)生紫色菌素，能夠檢測(cè)C4到C8-HSL的信號(hào)分子。

目標(biāo)菌株：溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria AS7）分離自腐敗大菱鲆，可產(chǎn)生AHLs，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；乳酸菌生化鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司；卡那霉素、DNA marker-D、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、Taq PCR Master mix，上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 儀器、設(shè)備 MS105UD電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；5804R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；GI54DS高壓滅菌鍋，至微儀器有限公司；DL-CJ-2N超級(jí)潔凈工作臺(tái)，北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；Quantity One凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；Imark酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD；E-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌菌株的分離 在無(wú)菌條件下，取適量傳統(tǒng)發(fā)酵食品汁液，用接種針接種一環(huán)劃線于1%CaCO3MRS培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)48 h，挑選有溶鈣圈的白色菌落進(jìn)行分離純化，對(duì)單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。

1.2.2 乳酸菌無(wú)細(xì)胞上清液 （cell free supernatants，CFS）的制備 將乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，以2%傳代培養(yǎng)2次后，置37℃培養(yǎng)12 h，4℃下6 000 r/min離心15 min，上清液用0.45 μm濾菌器過(guò)濾獲得CFS，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 溫和氣單胞菌AHLs的制備 將-80℃保存的溫和氣單胞菌接種于LB肉湯中，30℃培養(yǎng)12 h，以1%的接種量傳代培養(yǎng)1次后，4℃下6 000 r/min離心15 min，上清液中含有AHLs，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 乳酸菌群體感應(yīng)抑制劑的篩選 將紫色桿菌CV026過(guò)夜活化兩次后，按2%接入量接種于10 mL含有20 μg/mL卡那霉素新鮮LB肉湯中，30℃培養(yǎng)24 h后，與100 mL含有100 μL AHLs的LB培養(yǎng)基混合，倒入底層鋪有瓊脂的平板中，用牛津杯打孔，每孔加入180 μL CFS，對(duì)照組為MRS，30℃培養(yǎng)20 h。記錄孔周?chē)霈F(xiàn)的不透明的白色渾濁圈。

1.2.5 乳酸菌菌株鑒定 挑取具有抑制群體感應(yīng)抑制活性的乳酸菌菌株，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》進(jìn)行生理生化鑒定[13-14]。

乳酸菌基因組DNA采用細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行提取。PCR擴(kuò)增引物：27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACG GYTACCTTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：上、下游引物各 1.0 μL，DNA 模板 1.0 μL，TaqPCR Mastermix12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃，2 min，94 ℃，1 min，60 ℃，1 min，72 ℃，90 s，循環(huán)30次，72 ℃，10 min，4℃保溫。PCR純化產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析后送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。測(cè)得序列登陸GenBank進(jìn)行BLAST同源性比較，應(yīng)用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.6 乳酸菌粗提物的制備 取乳酸菌CFS 100 mL于干凈的分液漏斗中，乙酸乙酯100 mL分5次，每次加入20 mL進(jìn)行萃取，加入溶劑后沿同一方向緩慢震蕩，使兩者充分混勻，靜置5 min，待分層明顯后取上層及乳化層于三角瓶中，將5次萃取液合并后，45℃旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)，直至溶液中無(wú)殘留的乙酸乙酯。將萃取液轉(zhuǎn)存在燒杯中，真空冷凍干燥制成粉末，置于-18℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 乳酸菌粗提物對(duì)紫色桿菌CV026和溫和氣單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響 將活化后的目標(biāo)菌用LB肉湯制成約106CFU/mL菌懸液，用移液器吸取180 μL到96孔板，再加入20 μL QSI粗提物使其終質(zhì)量濃度分別為32.0，16.0，8.0，4.0，2.0 mg/mL，以不加粗提物的LB培養(yǎng)基為對(duì)照組，30℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h測(cè)其OD595nm。

1.2.8 乳酸菌粗提物對(duì)生物膜的影響 96孔板法：將活化后的目標(biāo)菌用LB肉湯制成約106CFU/mL菌懸液，吸取180 μL加入96孔板中，再加入20 μL乳酸菌粗提物，對(duì)照用MRS補(bǔ)平。30℃培養(yǎng)24 h后，移去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用200 μL無(wú)菌水清洗3～5次后，再添加200 μL 0.4%的結(jié)晶紫染色5 min，然后用無(wú)菌水清洗3次，置于60℃恒溫干燥箱干燥10 min，取出96孔板，每個(gè)孔中加入200 μL 95%乙醇，每個(gè)孔內(nèi)移除150 μL到另一96孔板內(nèi)，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定OD值。每個(gè)樣品做3個(gè)平行樣。

式中：OD對(duì)照——對(duì)照組目標(biāo)菌菌懸液的OD值；ODQSI——乳酸菌粗提物處理組的OD值。

顯微鏡：向24孔板中放入無(wú)菌蓋玻片（R=1.4 cm），再加入1 mL LB肉湯和10 μL過(guò)夜培養(yǎng)的目標(biāo)菌菌液以及100 μL乳酸菌粗提物，30°C靜置培養(yǎng)24 h后，用超純水潤(rùn)洗蓋玻片3次，0.4%結(jié)晶紫染色20 min，在油鏡下觀察。

掃描電鏡：向24孔板中放入無(wú)菌蓋玻片（R=1.4 cm），加入1 mL LB肉湯和10 μL過(guò)夜培養(yǎng)的目標(biāo)菌菌液以及100 μL乳酸菌粗提物，30℃靜置培養(yǎng)24 h后，用超純水潤(rùn)洗蓋玻片3次，2.5%戊二醛溶液中4℃固定過(guò)夜，用超純水洗滌3次，洗去殘留的戊二醛，分別用40%，70%，90%，100%乙醇脫水處理15 min，將蓋玻片真空干燥，噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.9 溫度和蛋白酶對(duì)乳酸菌粗提物的影響 酶敏感性試驗(yàn)：將乳酸菌粗提物pH分別調(diào)至酶的最適pH，加入胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶，使最終質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL，37℃水浴2 h，將乳酸菌粗提物調(diào)回初始pH，以未處理的乳酸菌粗提物為對(duì)照。參照1.2.4節(jié)測(cè)定其活性。熱穩(wěn)定性試驗(yàn)：將乳酸菌粗提物分別在40，60，80℃和100℃條件下處理30 min，未處理的乳酸菌粗提物為對(duì)照。參照1.2.4節(jié)測(cè)定其活性。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩選乳酸菌群體感應(yīng)抑制劑

紫色桿菌CV026是AHLs信號(hào)分子合成酶基因缺失突變體，培養(yǎng)時(shí)加入適量外源AHLs信號(hào)分子，能誘導(dǎo)其產(chǎn)生紫色菌素。若乳酸菌的代謝產(chǎn)物中含有群體感應(yīng)抑制因子，其將抑制紫色桿菌CV026產(chǎn)生紫色素，在抑制劑周?chē)蜁?huì)出現(xiàn)白色、渾濁不透明的抑制圈。本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離獲得206株乳酸菌，通過(guò)牛津杯打孔法獲得16株對(duì)溫和氣單胞菌群體感應(yīng)具有抑制活性的菌株，其中菌株XCT-1（遼寧葫蘆島腌芥菜）和菌株LT2-2（遼寧省錦州發(fā)酵酵頭）對(duì)溫和氣單胞菌具有較強(qiáng)的群體感應(yīng)抑制作用，抑菌圈直徑分別為13.29 mm和12.55 mm（圖1）。后續(xù)試驗(yàn)主要研究菌株XCT-1。

圖1 乳酸菌對(duì)紫色桿菌 CV026產(chǎn)紫色素的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of LAB on violacein production of C.violaceum CV026

2.2 乳酸菌菌株鑒定

菌株XCT-1的生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。查閱文獻(xiàn)13和14可初步斷定XCT-1為植物乳桿菌（Lb.plantarum）。

表1 菌株XCT-1的生理生化鑒定結(jié)果Table1 Physiological and biochemical test results of strain LZH2-5

圖2是菌株XCT-1的16S rRNA基因擴(kuò)增電泳圖，可以看出菌株XCT-1核酸序列在1 400 bp左右出現(xiàn)特異性亮帶，表明目標(biāo)片段被成功擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物被送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將菌株測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。菌株XCT-1與植物乳桿菌IMAU80150（GU125572.1）在同一個(gè)分支上，置信度為95%，菌株XCT-1被鑒定為植物乳桿菌 （Lb.plantarum），Genbank號(hào)為KX538913。

2.3 乳酸菌粗提物對(duì)紫色桿菌CV026和溫和氣單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響

圖2 菌株XCT-1的16S rRNA基因擴(kuò)增電泳圖Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA gene of strain XCT-1

圖3 菌株XCT-1的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree for sequences of strain XCT-1

為了進(jìn)一步確證乳酸菌的活性是群體感應(yīng)抑制活性，而非抑菌作用，研究了乳酸菌粗提物對(duì)紫色桿菌CVO26和溫和氣單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響。從圖4可以看出，菌株XCT-1粗提物質(zhì)量濃度為32 mg/mL和16 mg/mL時(shí)，紫色桿菌CV026和溫和氣單胞菌AS7的生長(zhǎng)被完全抑制；菌株XCT-1粗提物質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，紫色桿菌CV026和溫和氣單胞菌AS7的OD值降低了0.47和0.46；菌株XCT-1粗提物質(zhì)量濃度為4 mg/mL和2 mg/mL時(shí)，紫色桿菌CV026和溫和氣單胞菌AS7的生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致。由此說(shuō)明菌株XCT-1粗提物質(zhì)量濃度為4 mg/mL和2 mg/mL時(shí)，對(duì)紫色桿菌CV026和溫和氣單胞菌AS7沒(méi)有抑菌活性。后續(xù)試驗(yàn)中選擇菌株XCT-1粗提物質(zhì)量濃度為4 mg/mL。

圖4 菌株XCT-1粗提物對(duì)紫色桿菌CV026（a）和溫和氣單胞菌AS7（b）生長(zhǎng)曲線的影響Fig.4 Effect of crude extract from strain XCT-1 on growth curves of C.violaceum CV026 （a） and A.sobria AS7 （b）

2.4 乳酸菌對(duì)生物膜的影響

生物膜是指由附著于惰性或?qū)嶓w表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹著細(xì)菌的水合性基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌菌落[3]。生物膜的形成受QS系統(tǒng)調(diào)控，如果QS系統(tǒng)缺失，形成的生物膜比較稀薄，細(xì)菌致病性減弱。96孔板法的研究表明，4 mg/mL菌株XCT-1粗提物對(duì)溫和氣單胞菌生物膜的抑制率為38%。

圖5是溫和氣單胞菌生物膜的顯微鏡和掃描電鏡圖片，進(jìn)一步分析了菌株XCT-1粗提物對(duì)溫和氣單胞菌生物膜形態(tài)的影響?？梢钥闯觯瑢?duì)照組溫和氣單胞菌生物膜有濃密的細(xì)菌菌落，而試驗(yàn)組細(xì)菌菌落密度明顯稀疏，表明菌株XCT-1粗提物能夠抑制溫和氣單胞菌生物膜的形成（圖5a和圖5b）。對(duì)照組溫和氣單胞菌生物膜濃密且結(jié)構(gòu)緊密，而試驗(yàn)組的生物膜稀薄疏松，說(shuō)明菌株XCT-1粗提物不僅抑制溫和氣單胞菌生物膜的生成量，而且使其生物膜結(jié)構(gòu)疏松（圖5c和圖5d）。Younis等[15]研究表明，15 mg/mL海洋鏈霉菌的粗提物對(duì)奇異變形桿菌 （Proteus mirabilis）UCB4生物膜的抑制率為63%。顯微鏡和掃描電鏡結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明海洋鏈霉菌的粗提物使變形桿菌生物膜生物膜結(jié)構(gòu)疏松。本研究結(jié)果與Younis等[15]的研究結(jié)果一致。

圖5 菌株XCT-1粗提物對(duì)溫和氣單胞菌AS7生物膜形態(tài)的影響Fig.5 Effect of crude extract from strain XCT-1 on biofilm microscopic of A.sobria AS7

2.5 溫度和蛋白酶對(duì)乳酸菌粗提物的影響

圖6顯示菌株XCT-1粗提物對(duì)蛋白酶的敏感性結(jié)果。菌株XCT-1粗提物經(jīng)胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶處理2 h后對(duì)溫和氣單胞菌群體感應(yīng)抑制活性完全喪失，說(shuō)明菌株XCT-1粗提物中對(duì)溫和氣單胞菌群體感應(yīng)有抑制活性的物質(zhì)是蛋白類(lèi)。此外，從表2可得出，該蛋白類(lèi)物質(zhì)經(jīng)40，60，80℃和100℃處理30 min后，其活性與對(duì)照組未發(fā)生顯著性改變，表明該蛋白質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性。Kang等[16]研究表明，殺黃孢鏈霉菌 （Streptomyces xanthocidicus）KPP01532中含有抑制群體感應(yīng)的活性物質(zhì)，通過(guò)一系列色譜分離純化，鑒定該活性物質(zhì)是蛋白類(lèi)殺粉蝶霉素 （piericidin A）和糖殺碟菌素（glucopiericidin A）。本文研究結(jié)果與其相類(lèi)似。

3 結(jié)論

本文從遼寧葫蘆島農(nóng)家腌芥菜中篩選出1株對(duì)溫和氣單胞群體感應(yīng)有較強(qiáng)抑制活性的乳酸菌菌株XCT-1，經(jīng)生理生化和16S rRNA鑒定為植物乳桿菌 （Lb.plantarum）。4 mg/mL菌株XCT-1代謝產(chǎn)物的粗提物對(duì)溫和氣單胞菌生物膜的抑制率為38%。顯微鏡觀察其能夠抑制細(xì)菌生物膜的形成。掃描電鏡分析表明菌株XCT-1粗提物不僅降低了溫和氣單胞菌生物膜的生成量，而且使其生物膜結(jié)構(gòu)疏松。菌株XCT-1粗提物經(jīng)100℃30 min后其抑制活性保持不變，而經(jīng)胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶處理后活性完全喪失。初步確定菌株XCT-1粗提物中的群體感應(yīng)抑制成分為蛋白類(lèi)物質(zhì)，具有熱穩(wěn)定性。

表2 溫度對(duì)菌株XCT-1粗提物活性的影響Table2 Effect of temperature on the activity of crude extract from strain XCT-1

圖6 菌株XCT-1粗提取對(duì)蛋白酶的敏感性Fig.6 Effects of protease on the activity of crude extract from strain XCT-1