雨生紅球藻蝦青素對糖尿病大鼠腦損傷的干預(yù)作用

賀青華 李勇超 王文娟 任 超 趙 建 張 波

（北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室 北京 100023）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由遺傳和環(huán)境相互作用引起的體內(nèi)胰島素分泌不足，導(dǎo)致糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和繼發(fā)的維生素、水、電解質(zhì)的代謝以及氧化平衡被破壞的一種全身慢性終身性疾病，其臨床表現(xiàn)主要是糖代謝和脂代謝以及各種慢性并發(fā)癥。目前在世界范圍內(nèi)，糖尿病患病率、發(fā)病率和糖尿病患者數(shù)量急劇上升，其?？梢l(fā)一些嚴(yán)重的并發(fā)癥，如腎病、眼病以及心血管系統(tǒng)病變等，嚴(yán)重危害人類的健康和生命[1-6]。隨著糖尿病及各種并發(fā)癥的有效干預(yù)及治療，患者的生存時間延長，大腦成為糖代謝異常作用的又一重要靶器官。認(rèn)知損害及癡呆也成為T2DM糖尿病患者晚期的重要并發(fā)癥。流行病學(xué)資料顯示T2DM患者發(fā)生癡呆的概率是非糖尿病患者的1.5～2.5倍[2-6]。糖尿病是一種終身性疾病，需要長期服用藥物，采用毒副作用小的藥品來控制血糖以及并發(fā)癥是非常重要的[7-8]。 蝦青（Astaxanthin，AST）全稱為 3，3、-二羥基-β 胡蘿卜素-4，4、-酮，是一種紅色的類胡蘿卜素及天然的脂溶性色素，廣泛分布在海洋細(xì)菌、藻類、甲殼類和魚類中等，其中雨生紅球藻中蝦青素的含量高達(dá)1.5%～3%，被公認(rèn)為自然界中生產(chǎn)天然蝦青素最好的原料之一。近年來國內(nèi)外對蝦青素做了大量的研究，現(xiàn)有研究表明，天然蝦青素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的自然界最強(qiáng)大的天然抗氧化劑之一，它能發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用，增強(qiáng)細(xì)胞的再生能力，維持機(jī)體的平衡和減少衰老細(xì)胞的堆積，在抗炎，抗癌，預(yù)防心血管疾病，增強(qiáng)機(jī)體的免疫，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)有著重要的作用[9-14]。本文主要研究雨生紅球藻蝦青素對2型糖尿病大鼠腦的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為糖尿病引起的腦損傷的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

雨生紅球藻蝦青素，杭州鑫偉低碳技術(shù)研發(fā)公司；鏈脲佐霉素（STZ），美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍，華裕制藥有限公司；0.1 mmol/L檸檬酸緩沖溶液，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

葡萄糖測定試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；蛋白定量測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶 （T-SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、蛋白定量測試盒，南京建成生物工程研究所；大鼠IL-1β免疫組化試劑盒、大鼠TNF-α免疫組化試劑盒，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5804 R型低溫高速離心機(jī)，德國eppendorf公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電動勻漿器，常州朗越儀器制造有限公司；移液槍，德國eppendorf公司；紫外分光光度計，美國尤尼柯儀器有限公司；電子天平（CP324S型），德國Sartorius公司；超級應(yīng)用型純水器（ZRXQ003T0），美國Millipore公司；烘干箱，德國MMMMedcenter Einrichtungen。

1.3 實驗動物

1.3.1 動物的分組與飼養(yǎng) SPF級SD雄性大鼠【許可證編號 SCXK （京）2012-0001】，體質(zhì)量（180±20）g，72只，中國食品藥品檢定研究院。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)飼養(yǎng)3 d，稱重、編號，隨機(jī)分為正常組、模型組、雨生紅球藻蝦青素低劑量組（50 mg/kg BW）、雨生紅球藻蝦青素中劑量組 （100 mg/kg BW）、雨生紅球藻蝦青素高劑量組 （200 mg/kg BW）、降糖藥物 （鹽酸二甲雙胍：0.0285 g/100 g BW）組，每組12只。試驗性大鼠在SPF屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)，溫度控制在 （20±2）℃，空氣相對濕度50%～70%，光照周期為 14 h 光照（6：00-20：00）/10 h黑暗，自由取食、飲水。

1.3.2 糖尿病模型的建立和雨生紅球藻蝦青素的灌胃 正常組大鼠每日給予蒸餾水和普通飼料飼養(yǎng)4周。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、降糖藥物組每日給予蒸餾水和高脂高糖飼料飼養(yǎng)4周；禁食、不禁水12 h，正常組腹腔注射0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液；模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、降糖藥物組腹腔注射STZ（35 mg/kg BW），繼續(xù)喂養(yǎng)4周，眼眶取血測空腹血糖大于11.1 mmol/L為造模成功，繼續(xù)灌胃給予雨生紅球藻蝦青素4周。

1.4 觀察與測定指標(biāo)

每日觀察大鼠的精神狀況，活動情況。

1.4.1 大鼠腦抗氧化指標(biāo)的測定 取大鼠1/4腦，稱質(zhì)量，制成10%勻漿，用于測GSH-PX、SOD的活力和MDA的含量。GSH-PX、SOD的活力和MDA含量測定：采用谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）試劑盒測定GSH-PX酶活性，氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒測定SOD酶活性，丙二醛（MDA）試劑盒測定MDA的含量。以上均按試劑盒說明書操作。

1.4.2 大鼠腦組織組織病理學(xué)及免疫組化測定大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，打開胸腔，暴露心臟，從左心室插入灌注針頭至主動脈，剪開右心耳，快速灌注生理鹽水250～300 mL，然后改用4%的多聚甲醛 （pH 7.2～7.4）200～250 mL 灌注，先快后慢。快速斷頭、取腦，將腦組織置于4%多聚甲醛固定。將大鼠腦組織采用不同濃度乙醇系列脫水，再用二甲苯透明，然后石蠟包埋、切片，片厚約4 μm。將切片按HE染色步驟進(jìn)行染色，然后在顯微鏡下觀察大鼠腦組織形態(tài)。免疫組化測大鼠腦組織含IL-1β、TNF-α的細(xì)胞數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件分析，各組數(shù)據(jù)結(jié)果以x±s表示，并單因素方差分析。P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AST對糖尿病大鼠腦組織抗氧化指標(biāo)的影響

與正常組相比，模型組大鼠腦組織的MDA含量顯著升高 （P＜0.01），SOD和GSH-Px活性顯著下降（P＜0.01）；高劑量AST干預(yù)后與模型組相比，MDA 含量顯著下降（P＜0.01），SOD 和 GSH-Px活性顯著增高（P＜0.01），中、低劑量組AST和鹽酸二甲胍與模型組相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。高劑量AST的作用效果優(yōu)于鹽酸二甲雙胍。

2.2 AST對糖尿病大鼠腦組織病理學(xué)的影響

HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)態(tài)學(xué)變化。光鏡下觀察（×400），與正常組相比，模型組大鼠腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)層次不完整，細(xì)胞腫脹、細(xì)胞核固縮。與模型組相比，AST高劑量組大鼠腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)層次完整性顯著改善，細(xì)胞腫脹及細(xì)胞核固縮程度明顯減輕。高劑量AST和陽性組較糖尿病組均有明顯改善，結(jié)果見圖1。

表1 AST對大鼠腦組織抗氧化指標(biāo)的含量的影響（±s，n=12）Table1 Effect of AST on GSH-Px，SOD，MDA of rats brains （±s，n=12）

表1 AST對大鼠腦組織抗氧化指標(biāo)的含量的影響（±s，n=12）Table1 Effect of AST on GSH-Px，SOD，MDA of rats brains （±s，n=12）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

M D A/n m o l·m g-1 蛋 白正常組 1 2 3.5 7±9.03 167.98±21.06 5.26±0.32模型組 9 8.9 8±6.1 2** 1 0 9.4 5±1 2.9 7** 8.7 8±0.1 2**蝦青素高劑量組 1 1 3.2 1±8.1 9## 1 4 3.4 3±2 4.1 2## 6.8 3±0.6 7##蝦青素中劑量組 9 7.3 9±1 0.9 2 1 0 0.3 6±2 2.5 6 8.3 6±0.6 5蝦青素低劑量組 9 9.9 2±1 8.2 3 1 0 4.6 6±2 4.8 1 8.8 1±0.8 9鹽酸二甲雙胍組 9 3.3 9±1 3.4 1 9 8.3 6±2 5.2 5 7.2 7±0.6 1組別 G S H-P X/U·m g-1蛋白S O D/U·m g-1蛋白

圖1 AST對大鼠腦組織病理學(xué)的影響（HE，×400）Fig.1 Effect of AST on pathological changes in the hippocampal CA1 region of rats（HE，×400）

2.3 AST對大鼠腦組織含炎性因子 IL-1β、TNF-α細(xì)胞數(shù)量的影響

與正常組相比，糖尿病模型組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α 細(xì)胞數(shù)量均顯著升高 （P<0.01），AST各劑量組對糖尿病大鼠腦組織的IL-1β、TNF-α細(xì)胞數(shù)量較糖尿病模型組都顯著降低（P<0.01），尤其高劑量組含量降低明顯，并且效果優(yōu)于鹽酸二甲雙胍，結(jié)果見表2和圖2。

表2 AST 對大鼠腦含 IL-1β、TNF-α 細(xì)胞數(shù)量的影響（±s，n=6）Table2 Effect of AST on IL-1β、TNF-α cells in rats brains （±s，n=6）

表2 AST 對大鼠腦含 IL-1β、TNF-α 細(xì)胞數(shù)量的影響（±s，n=6）Table2 Effect of AST on IL-1β、TNF-α cells in rats brains （±s，n=6）

注：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.0。

組別 IL-1β TNF-α正常組 81.33±2.34** 113.33±5.32##模型組 254.67±6.53**## 238.67±22.29**AST高劑量組 119.33±6.77**## 123.33±15.32##AST中劑量組 191.33±6.18**## 196.67±6.29**##AST低劑量組 236.67±5.34**## 240±5.06**##鹽酸二甲雙胍組 149.33±4.50**## 122.67±10.01##

圖2 AST對大鼠腦組織炎性因子細(xì)胞數(shù)量影響（免疫組化，×200）Fig.2 Effect of AST on cells with inflammatory factor in rats brain tissue（immunihistochemistry，×200）

3 討論

糖尿病是一種終身性疾病，病程長且伴有多種并發(fā)癥，長期慢性糖代謝紊亂可損害腦組織，使腦成為糖代謝異常作用的重要靶器官，進(jìn)而導(dǎo)致腦在結(jié)構(gòu)、神經(jīng)生理等方面發(fā)生病理改變，使其氧化應(yīng)激和炎性因子水平增加[15-16]。尋求有效、安全的治療藥物或功能因子具有重要意義。最近有研究表明[17-18]，一些功能因子通過抗炎、抗氧化作用來保護(hù)大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，從而延緩糖尿病腦病的發(fā)生。

本試驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠腦中抗氧化酶SOD、GSH-PX酶活性顯著降低，MDA和 IL-1β、TNF-α水平明顯增高。SOD能夠清除自由基，保護(hù)細(xì)胞損傷，間接地反映機(jī)體清除自由基的能力；GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用；MDA是多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產(chǎn)物，與脂蛋白交聯(lián)后具有較強(qiáng)的毒性，因此MDA作為衡量體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的主要指標(biāo)，在一定程度上反映細(xì)胞受氧化損傷的程度。IL-1β和TNF-α是機(jī)體內(nèi)炎性狀態(tài)反應(yīng)最為敏感的兩種炎性因子，廣泛參與了人體組織破壞、水腫形成等多種病理損傷過程。本次試驗中發(fā)現(xiàn)高劑量AST能夠顯著提高糖尿病大鼠腦組織SOD和GSH-PX酶活性，顯著降低MDA含量，提高組織的抗氧化能力。顯著降低含IL-1β、TNF-α的細(xì)胞數(shù)量，并對糖尿病大鼠腦組織結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。提示AST改善糖尿病腦病作用的機(jī)制可能與其降低氧化應(yīng)激和炎性介質(zhì)的分泌有關(guān)。

4 結(jié)論

AST蝦青素能夠改善糖尿病大鼠腦組織的氧化應(yīng)激能力，降低炎性因子水平，從而對糖尿病大鼠腦組織具有一定的保護(hù)作用。