玉米自交系苗期對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制及其抗逆性

方 芳，何序晨，張志豪，張 勤，關(guān)亞靜，胡 晉，胡偉民

(浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院 種子科學(xué)中心，浙江 杭州 310058)

玉米(ZeamaysL.)是世界上重要的谷類糧食作物之一，種植面積、總產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量均居谷類作物的首位。我國(guó)是世界上主要玉米生產(chǎn)國(guó)之一，播種面積和總產(chǎn)量都居世界第二位[1]。近年來(lái)，隨著溫室效應(yīng)加劇，全球氣溫不斷升高，極端性氣候如夏季高溫，已經(jīng)成為制約玉米生產(chǎn)的重要因素之一。目前，不少學(xué)者對(duì)植物在高溫脅迫下的響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了一系列細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)方面的研究。已有研究表明，植物耐熱性與葉片顯微結(jié)構(gòu)存在一定相關(guān)性。與熱敏感品種相比，耐熱型品種葉片上表皮氣孔關(guān)閉，下表皮氣孔頻度高，氣孔體積小且開(kāi)張度??；葉片厚，葉肉組織細(xì)胞排列緊密，無(wú)胞間隙，很少出現(xiàn)質(zhì)壁分離；葉脈維管束發(fā)達(dá)，特別是木質(zhì)部導(dǎo)管數(shù)多且孔徑大，具有發(fā)達(dá)的形成層和厚壁組織，排列緊密[2]。此外，花器官也是植物開(kāi)花期對(duì)熱脅迫最敏感、最易受損傷的器官。宋春英等[3]發(fā)現(xiàn)，高溫會(huì)使玉米雌穗吐絲困難、吐絲紊亂；吐絲后的花絲易失水枯萎，壽命縮短，生活力喪失，花粉在柱頭萌發(fā)困難，造成授粉效果差，最終導(dǎo)致玉米產(chǎn)量降低。對(duì)于細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)，有研究指出，葉肉細(xì)胞中核仁對(duì)高溫最為敏感，葉綠體比線粒體對(duì)高溫更敏感，液泡膜比質(zhì)膜對(duì)高溫更敏感；在葉綠體中，類囊體膜比葉綠體被膜對(duì)高溫更敏感[4]。高溫脅迫除了影響植物生長(zhǎng)發(fā)育外，還會(huì)影響一系列生理生化反應(yīng)。高溫會(huì)打破活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生與清除間的平衡，誘導(dǎo)ROS、丙二醛(MDA)等氧化產(chǎn)物的積累，引起膜脂過(guò)氧化，從而使膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率升高[5-6]。光合作用是植物物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量代謝的關(guān)鍵，也是對(duì)高溫最敏感的生理過(guò)程之一。熱脅迫下，類囊體上的光化學(xué)反應(yīng)和葉綠體基質(zhì)上的碳代謝最先受到危害[7]。尤其是夏季高溫往往伴隨著強(qiáng)光，會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)結(jié)構(gòu)和功能的變化甚至不可逆失活[8-9]。Yamada等[10]發(fā)現(xiàn)葉綠素?zé)晒?、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和基礎(chǔ)熒光(Fo)等也與耐熱性密切相關(guān)。呼吸作用作為代謝中心，不僅為細(xì)胞各項(xiàng)生理活動(dòng)提供能量，又能為其他化合物的合成提供原料。一般情況下，在一定溫度范圍內(nèi)，呼吸速率隨著溫度升高而加快[11]。但是，當(dāng)溫度超過(guò)一定范圍，反而會(huì)引起呼吸代謝減弱[12]。

處于高溫脅迫下的植物并不會(huì)一直被動(dòng)承受傷害，而是通過(guò)主動(dòng)調(diào)節(jié)來(lái)適應(yīng)高溫逆境。植物通過(guò)激活抗氧化劑和誘導(dǎo)抗氧化酶的活性來(lái)減弱膜脂過(guò)氧化程度[13-14]。不僅如此，植物還能依賴脯氨酸、可溶性蛋白、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和激素來(lái)提高自身的耐熱性。大量研究表明，脯氨酸和可溶性蛋白作為最常見(jiàn)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境下能大量積累，具有穩(wěn)定原生質(zhì)膠體和組織內(nèi)的代謝過(guò)程，防止細(xì)胞質(zhì)脫水，保護(hù)質(zhì)膜完整性的作用[15-17]。此外，甜菜堿含量的高低與耐熱性強(qiáng)弱也有較為密切的關(guān)系[18-19]。水楊酸(SA)和脫落酸(ABA)都是響應(yīng)高溫鍛煉的重要信號(hào)分子，高溫脅迫均能誘導(dǎo)植物內(nèi)源SA和ABA的大量積累，而外施SA、ABA同樣可以提高植物的耐熱性[20-23]。熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat stress transcription factors，Hsfs)是存在于細(xì)胞內(nèi)，響應(yīng)逆境信號(hào)的重要元件，在熱脅迫下通過(guò)激活相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)提高植物的耐熱性[24-25]。熱激蛋白(heat shock protein，HSP)作為分子伴侶，在高溫脅迫下，可以阻止變性的蛋白聚集、協(xié)助變性的蛋白重新折疊或溶解聚集的變性蛋白[26]。

中國(guó)南方地區(qū)夏秋播玉米種子在萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)期間易受到高溫脅迫，并且這種現(xiàn)象在玉米自交系特別是甜玉米自交系上表現(xiàn)得尤為明顯，往往導(dǎo)致田間出苗率和幼苗整齊度下降，進(jìn)而影響制種產(chǎn)量。本試驗(yàn)采用浙江大學(xué)選育的耐熱型和熱敏感型甜玉米自交系各2份，在室內(nèi)45 ℃條件下進(jìn)行高溫脅迫處理，測(cè)定了苗期葉片的生理生化變化，研究和分析不同抗性的甜玉米自交系的逆境生理機(jī)制，從而為抗逆材料的鑒定和選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

浙江大學(xué)選育的不同種質(zhì)來(lái)源的耐熱型和熱敏感型甜玉米自交系各2份，其中耐熱型為16號(hào)(S40-4-2-1-2-3-2，種質(zhì)來(lái)源：溫帶×熱帶)和51號(hào)(S76-9-2-2-2-1，種質(zhì)來(lái)源：熱帶)；熱敏感型為56號(hào)(T5-5-1-1-1-3-1，種質(zhì)來(lái)源：溫帶×亞熱帶)和71號(hào)(T60-1-9-2-1，種質(zhì)來(lái)源：溫帶)。4份材料的種子發(fā)芽率均在85%左右，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率無(wú)顯著差異。

熒光定量PCR試驗(yàn)所用RNA提取試劑盒購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit)購(gòu)自北京TaKaRa公司；熒光定量試劑盒(AceQ qPCR SYBR Green Master Mix)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高溫處理與取樣

采用基質(zhì)培養(yǎng)。種子播于培養(yǎng)盒內(nèi)，每盒30粒，合并3盒為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于25 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽。待玉米幼苗長(zhǎng)到一葉一心期時(shí)，取出處理組，置于45 ℃培養(yǎng)箱中處理24 h，再置于25 ℃、12 h光照培養(yǎng)箱中恢復(fù)生長(zhǎng)12 h。于高溫處理0、12、24 h，及恢復(fù)生長(zhǎng)6、12 h時(shí)取樣進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定；于高溫處理0、1、3、5、8、12、24 h，及恢復(fù)12 h取樣，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)基因表達(dá)量的測(cè)定。取樣時(shí)均取幼苗第一葉，所有測(cè)量指標(biāo)重復(fù)3次。

1.2.2 生理生化指標(biāo)測(cè)定

葉綠素含量測(cè)定。葉綠素提取參照李得孝等[27]的方法，每個(gè)重復(fù)取0.2 g葉片樣品，使用丙酮∶乙醇∶水(體積比4.5∶4.5∶1.0)提取液直接在黑暗中浸提24 h，待葉片發(fā)白取浸提液并定容至20 mL，測(cè)定663、645 nm下的吸光度。

抗氧化酶系統(tǒng)活性測(cè)定。取0.2 g葉片在pH 7.8的磷酸緩沖液(PBS)中冰浴研磨成勻漿，4 ℃，10 000g離心15 min，棄沉淀，上清液即為待測(cè)酶液。

超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[28]。3 mL NBT反應(yīng)液中加入100 μL待測(cè)酶液，光照20 min(25 ℃，4 000 lx)，以3 mL NBT反應(yīng)液加上100 μL提取緩沖液為對(duì)照。于560 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。

過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定參照趙文賽[29]的方法并略加修改。取上清液與磷酸緩沖液、愈創(chuàng)木酚、過(guò)氧化氫(H2O2)混勻，利用分光光度計(jì)在470 nm處測(cè)定1 min內(nèi)吸光值的變化。以每min吸光值上升0.1為1個(gè)酶活性單位。

過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定采用過(guò)氧化氫比色法[30]。取上清液與磷酸緩沖液、H2O2混勻，用動(dòng)力學(xué)方法在240 nm下測(cè)定其活性。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性測(cè)定采用抗壞血酸比色法[31]。取上清液與磷酸緩沖液、抗壞血酸、H2O2混勻，用動(dòng)力學(xué)方法在290 nm下測(cè)定其活性。

谷胱甘肽還原酶(GR)活性測(cè)定參照Knorzer等[32]的方法并略加修改。取上清液與GSSG、NADPH混勻，于340 nm處測(cè)定3 min內(nèi)吸光值的變化。以每min吸光值下降0.1為1個(gè)酶活性單位。

脯氨酸含量測(cè)定。采用茚三酮顯色法[33]。稱取0.2 g玉米葉片，剪碎后用5 mL 3%的磺基水楊酸加塞沸水浴提取10 min(提取過(guò)程中要不斷晃動(dòng))。冷卻后過(guò)濾于干凈的試管中。取2 mL提取液，于具塞試管中加入2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮試劑，搖勻后在沸水浴中顯色30 min。冷卻后加入4 mL甲苯，搖晃30 s，靜置片刻取上層液至10 mL離心管中，3 000 r·min-1離心5 min，吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液，在分光光度計(jì)上520 nm波長(zhǎng)下比色，以甲苯為空白對(duì)照。

1.2.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)

以經(jīng)過(guò)高溫脅迫處理和正常生長(zhǎng)的玉米幼苗葉片為試驗(yàn)材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以此為模板，以ZmActin為內(nèi)參基因，用LightCycler? 96熒光定量?jī)x進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)總體積20 μL，包含100 ng cDNA(1 μL)，7.4 μL ddH2O，上、下游引物各0.8 μL，10 μL SYBR?Green Master Mix。測(cè)定ZmP5CS和ZmProDH表達(dá)水平的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共45個(gè)循環(huán)。測(cè)定ZmHSP70和ZmHSP90表達(dá)水平的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，53 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)不同抗性玉米幼苗生長(zhǎng)的影響

4份甜玉米自交系幼苗經(jīng)高溫處理后恢復(fù)生長(zhǎng)情況如圖1所示。未經(jīng)高溫處理之前，各自交系玉米幼苗處于一葉一心期，均長(zhǎng)勢(shì)良好，51號(hào)自交系葉片略有發(fā)黃，可能是葉綠素含量較低，其他自交系葉片深綠。45 ℃高溫處理24 h后，16號(hào)、51號(hào)、56號(hào)自交系葉片略微發(fā)黃，但不明顯；71號(hào)自交系部分幼苗已經(jīng)倒伏、萎蔫，未倒伏的幼苗葉片焦黃，下垂?；謴?fù)生長(zhǎng)1 d后，16號(hào)、51號(hào)自交系葉片發(fā)黃略微加重，但仍舊正常生長(zhǎng)；56號(hào)自交系幼苗開(kāi)始干枯倒伏，葉片萎蔫；71號(hào)自交系部分幼苗整株枯死，其他幼苗葉片干枯，下垂嚴(yán)重。恢復(fù)生長(zhǎng)2 d后，16號(hào)與51號(hào)自交系葉片轉(zhuǎn)綠，生長(zhǎng)良好；而56號(hào)、71號(hào)自交系基本已全部枯死。由此可見(jiàn)，16號(hào)與51號(hào)自交系耐熱性強(qiáng)，高溫處理后葉片略微發(fā)黃，恢復(fù)正常溫度后即可正常生長(zhǎng)；56號(hào)與71號(hào)自交系耐熱性差，高溫處理后再恢復(fù)無(wú)法正常生長(zhǎng)，并且在恢復(fù)生長(zhǎng)期間全部枯死；同時(shí)，與56號(hào)相比，71號(hào)自交系對(duì)高溫脅迫更敏感，71號(hào)自交系在高溫處理結(jié)束后便已經(jīng)明顯地出現(xiàn)生長(zhǎng)異常，56號(hào)自交系在恢復(fù)生長(zhǎng)1 d后才出現(xiàn)異常情況。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物

Table 1 Real-time quantitative PCR primers

基因Gene name基因登錄號(hào)GenBank accession No.正向引物序列(5'-3')Forward primer sequence反向引物序列(5'-3')Reverse primer sequenceP5CSNM_001153639GCAAGTTGATAGTGCCGCTGTGTTACTCCCTTGTCACCATTCACCACTProDHNM_001154105GCAACCGTGTTCTTCTCTCTCCAAGCGAGGGGAACGTAGAGHSP70NM_001319757TGAGGATGAGGAGCACAAGACCGCACCAACTGACGATHSP90NM_001177009GTGCGACGTGTCTTCATCATAGCTCAGCAATCTTGGTCCTActinNM_001155179CGTTACCGGCTCATTGAGGGAGCACCAGACTCAT

圖1 高溫處理后甜玉米自交系幼苗的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of sweet corn inbred line seedlings after high temperature treatment

2.2 生理生化指標(biāo)

2.2.1 高溫脅迫對(duì)不同抗性玉米幼苗葉綠素含量的影響

由圖2-A可以看出，71號(hào)和56號(hào)自交系的葉綠素a含量在高溫處理和恢復(fù)生長(zhǎng)期間始終呈下降趨勢(shì)，變化顯著，至恢復(fù)生長(zhǎng)12 h后下降幅度分別達(dá)到63.4%和70.4%。51號(hào)和16號(hào)自交系高溫處理12 h，葉綠素a含量略微上升，之后至恢復(fù)生長(zhǎng)6 h期間，葉綠素a含量均呈下降趨勢(shì)；但是在恢復(fù)生長(zhǎng)12 h后，51號(hào)自交系與16號(hào)自交系的變化相比存在極大的差異，51號(hào)自交系葉綠素a含量急劇升高，比恢復(fù)生長(zhǎng)6 h時(shí)的葉綠素a含量增加了129.7%，而16號(hào)自交系葉綠素a含量仍呈略微下降的趨勢(shì)，總降幅為44.1%。

葉綠素b含量的變化趨勢(shì)與葉綠素a類似(圖2-B)。71號(hào)自交系與56號(hào)自交系基本呈下降趨勢(shì)，總降幅分別達(dá)56.5%和62.6%。16號(hào)自交系高溫處理12 h葉綠素b含量上升，之后下降，總降幅為31.8%。51號(hào)自交系在高溫處理12、24 h時(shí)，葉綠素b含量略微上升；恢復(fù)生長(zhǎng)6 h下降，總降幅為5.93%；但在恢復(fù)生長(zhǎng)12 h后含量急劇上升，與恢復(fù)生長(zhǎng)6 h相比上升幅度達(dá)162.2%。

葉綠素a與葉綠素b的比值反映了植物對(duì)光能利用的能力。從圖2-C可以看出，71號(hào)與56號(hào)自交系的葉綠素a/b值呈下降趨勢(shì)，總降幅分別為12.4%和29.4%。16號(hào)自交系的葉綠素a/b值變化趨勢(shì)與葉綠素含量的變化趨勢(shì)相反，在高溫處理12 h下降，高溫處理24 h后開(kāi)始上升，但仍比未處理前略微下降。51號(hào)自交系的變化與16號(hào)自交系有所不同，在高溫處理12 h時(shí)，葉綠素a/b值上升，之后呈下降趨勢(shì)，這可能與51號(hào)自交系在處理前幼苗葉綠素含量較低、高溫脅迫初始階段反應(yīng)相對(duì)敏感有關(guān)。

智能電網(wǎng)的出現(xiàn)，同時(shí)也意味著繼電保護(hù)技術(shù)的研究和發(fā)展也非常的重要。在智能電網(wǎng)的建設(shè)當(dāng)中，對(duì)于繼電保護(hù)技術(shù)的應(yīng)用也越來(lái)越困難。在對(duì)繼電保護(hù)技術(shù)進(jìn)行研究的過(guò)程當(dāng)中，結(jié)合了電子技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)技術(shù)、控制技術(shù)以及信息技術(shù)等高科技專業(yè)技術(shù)，通過(guò)技術(shù)的相互融合和創(chuàng)新，讓我國(guó)的繼電保護(hù)技術(shù)水平得到了很大的提升。

不同字母表示同一自交系不同處理間在0.05水平差異顯著。數(shù)據(jù)以鮮質(zhì)量計(jì)。下同。The different letters indicated significant difference at 0.05 level between treatments. Data were detected based on fresh weight. The same as below.圖2 不同甜玉米自交系在高溫脅迫和恢復(fù)生長(zhǎng)期間葉綠素含量與脯氨酸含量的變化Fig.2 Changes of chlorophyll content and proline content in different sweet corn inbred lines during high temperature stress and recovery stage

2.2.2 高溫脅迫對(duì)不同抗性的玉米幼苗脯氨酸含量的影響

從圖2-D可以看出，高溫脅迫處理后，4個(gè)自交系的脯氨酸含量均有不同程度的上升。其中71號(hào)自交系在高溫處理12 h后，脯氨酸含量上升，而高溫處理24 h后，脯氨酸含量下降，恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)期，脯氨酸略微下降；56號(hào)自交系在高溫處理期間脯氨酸含量急劇上升，至高溫處理完成，脯氨酸含量上升至最高點(diǎn)，上升幅度達(dá)230.8%，在恢復(fù)生長(zhǎng)6 h，脯氨酸含量迅速下降，下降幅度為38.9%，之后無(wú)顯著變化；51號(hào)自交系的脯氨酸含量在整個(gè)處理期間變化不大，高溫脅迫12 h略微下降，高溫脅迫24 h略有上升，恢復(fù)生長(zhǎng)期間緩慢下降；16號(hào)自交系在高溫處理期間脯氨酸含量急劇上升，與處理前相比上升幅度為153.7%，到恢復(fù)生長(zhǎng)6 h迅速下降，與高溫處理24 h相比降幅為39.9%，之后較為平穩(wěn)。

2.2.3 高溫脅迫對(duì)不同抗性玉米幼苗POD活性的影響

耐熱性不同的4個(gè)自交系的POD活性在高溫處理24 h后均呈下降趨勢(shì)，71號(hào)、56號(hào)、51號(hào)、16號(hào)下降幅度分別為59.8%、70.7%、55.8%和13.3%(圖3-A)。在恢復(fù)生長(zhǎng)期，耐熱性不同的自交系其POD活性變化有較大差異。71和56號(hào)自交系的POD活性基本趨于穩(wěn)定，無(wú)顯著變化。51號(hào)和16號(hào)自交系的POD活性在恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)期迅速回升，與高溫處理24 h相比，至恢復(fù)生長(zhǎng)12 h時(shí)POD活性分別上升了473.2%和54.2%。

圖3 不同甜玉米自交系在高溫脅迫和恢復(fù)生長(zhǎng)期間POD、SOD、CAT、APX和GR活性的變化Fig.3 Changes of POD， SOD， CAT， APX and GR activities in different sweet corn inbred lines during high temperature stress and recovery stage

2.2.4 高溫脅迫對(duì)不同抗性玉米幼苗SOD活性的影響

SOD是生物體內(nèi)唯一以自由基為底物的抗氧化酶，因此在抗氧化酶體系中居于核心地位?？剐圆煌淖越幌翟诟邷孛{迫下SOD活性變化有很大差異(圖3-B)。71號(hào)自交系在高溫處理12 h，SOD活性略微上升，之后迅速下降，至恢復(fù)生長(zhǎng)6 h降至最低點(diǎn)，比處理前下降了68.6%，在恢復(fù)生長(zhǎng)12 h略微回升。56號(hào)自交系一直呈下降趨勢(shì)，至恢復(fù)生長(zhǎng)6 h降至最低點(diǎn)，比處理前下降了71.7%，在恢復(fù)生長(zhǎng)12 h時(shí)也略微回升。51號(hào)自交系在高溫處理12 h，SOD活性略有下降，之后呈上升趨勢(shì)，恢復(fù)生長(zhǎng)6 h至最高點(diǎn)，之后迅速回落。16號(hào)自交系在整個(gè)處理期間SOD活性保持穩(wěn)定，且一直處于較高水平。

2.2.5 高溫脅迫對(duì)不同抗性玉米幼苗CAT活性的影響

如圖3-C所示，4份甜玉米自交系的CAT活性在高溫處理期間均呈下降趨勢(shì)，71號(hào)、56號(hào)、51號(hào)、16號(hào)下降幅度分別為94.6%、61.6%、70.8%和58.7%?；謴?fù)生長(zhǎng)期間根據(jù)耐熱性不同，幼苗CAT活性也表現(xiàn)出明顯差異。71號(hào)和56號(hào)自交系的CAT活性在恢復(fù)生長(zhǎng)期間仍保持下降趨勢(shì)；而51號(hào)自交系自高溫處理完成后CAT活性開(kāi)始上升，與高溫處理24 h相比，恢復(fù)生長(zhǎng)12 h時(shí)上升幅度達(dá)4 260%；16號(hào)自交系在恢復(fù)生長(zhǎng)6 h達(dá)到最低點(diǎn)，之后開(kāi)始回升。

2.2.6 高溫脅迫對(duì)不同抗性玉米幼苗APX活性的影響

71號(hào)和56號(hào)自交系的APX活性在高溫處理及恢復(fù)生長(zhǎng)期間一直呈下降趨勢(shì)，至恢復(fù)生長(zhǎng)12 h，降幅分別為90.4%和85.8%(圖3-D)。51號(hào)自交系的APX活性在高溫處理12 h下降到最低，之后開(kāi)始升高。16號(hào)自交系的APX活性在高溫處理及恢復(fù)生長(zhǎng)期間一直呈上升趨勢(shì)，與處理前相比，至恢復(fù)生長(zhǎng)12 h，上升幅度為63.8%。

2.2.7 高溫脅迫對(duì)不同抗性玉米幼苗GR活性的影響

在整個(gè)高溫處理和恢復(fù)生長(zhǎng)期間，71號(hào)、56號(hào)和51號(hào)自交系均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而16號(hào)自交系呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)(圖3-E)。熱敏感型自交系71號(hào)和56號(hào)的GR活性在高溫處理12 h達(dá)最高，隨后急劇下降，與高溫處理12 h相比，恢復(fù)生長(zhǎng)12 h時(shí)降幅分別為55.7%和72.4%。耐熱型自交系51號(hào)的GR活性在高溫處理24 h后達(dá)最高，恢復(fù)生長(zhǎng)期間逐步下降，降幅僅為14.1%。

2.3 不同耐熱型玉米自交系高溫脅迫和恢復(fù)生長(zhǎng)期間相關(guān)基因的表達(dá)

2.3.1 脯氨酸合成和降解相關(guān)基因

已有研究表明，Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)是谷氨酸途徑合成脯氨酸的關(guān)鍵酶，而脯氨酸脫氫酶(proline dehydrogenase，ProDH)是脯氨酸降解的主要限速酶[34-36]。如圖4所示，耐熱性不同的玉米自交系脯氨酸合成和降解相關(guān)基因的表達(dá)存在明顯差異。耐熱性強(qiáng)的51號(hào)自交系在高溫處理6 h后ZmP5CS的表達(dá)量迅速上升，至12 h表達(dá)量達(dá)最高，顯著高于處理前的水平，之后開(kāi)始迅速回落，恢復(fù)生長(zhǎng)12 h后略高于處理前的水平；而熱敏感型自交系71號(hào)在高溫處理12 h期間ZmP5CS的表達(dá)量呈現(xiàn)先緩慢上升后下降的趨勢(shì)，至24 h表達(dá)量達(dá)到峰值，恢復(fù)生長(zhǎng)12 h后表達(dá)量低于處理前的水平。ZmProDH的表達(dá)量在兩個(gè)自交系中的表現(xiàn)大體一致，51號(hào)和71號(hào)自交系在高溫處理后驟然上升，均在高溫處理6 h后達(dá)到峰值，顯著高于處理前的表達(dá)水平，上升幅度分別為192.0%和210.6%，隨后開(kāi)始顯著下降，至高溫處理24 h時(shí)，71號(hào)的表達(dá)量與處理前相比無(wú)顯著差異；2個(gè)自交系在恢復(fù)生長(zhǎng)12 h后的表達(dá)量均保持在較低水平，并顯著低于處理前水平。綜合看來(lái)，與熱敏感型自交系相比，耐熱性強(qiáng)的自交系在高溫脅迫期間，脯氨酸合成酶基因的表達(dá)水平更高，降解酶基因的表達(dá)水平較低。

2.3.2 熱激蛋白相關(guān)基因

研究發(fā)現(xiàn)，熱激蛋白在高溫、干旱、過(guò)氧化、重金屬等逆境下能大量表達(dá)[26]。如圖4所示，抗性不同的甜玉米自交系，其熱激蛋白表達(dá)水平在高溫脅迫期間表現(xiàn)出明顯差異。經(jīng)高溫處理后，耐熱型51號(hào)自交系ZmHSP70和ZmHSP90大量表達(dá)并分別于12 h和3 h達(dá)到峰值，且顯著高于處理前水平。而熱敏感型71號(hào)自交系ZmHSP70的表達(dá)與處理前相比雖有顯著升高，但與51號(hào)自交系相比，仍維持在較低水平；ZmHSP90在高溫處理5 h內(nèi)上升幅度較大，在高溫處理1 h時(shí)即達(dá)到峰值，但高溫處理3 h后的表達(dá)量均低于51號(hào)自交系。這與Scafaro等[37]在水稻上的研究結(jié)果一致。

圖4 高溫脅迫下不同甜玉米自交系相關(guān)基因的表達(dá)Fig.4 Expression of related genes in different sweet corn inbred lines under high temperature stress

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)4份不同抗性的甜玉米自交系在高溫脅迫和恢復(fù)生長(zhǎng)期間的表現(xiàn)情況，發(fā)現(xiàn)高溫脅迫過(guò)程中脯氨酸的積累、抗氧化酶活性和熱激蛋白基因表達(dá)的增強(qiáng)是玉米幼苗耐熱性形成的響應(yīng)機(jī)制。而本試驗(yàn)中葉綠素a、b含量，葉綠素a/b值和脯氨酸含量變化存在的差異，及脯氨酸合成與分解相關(guān)的基因表達(dá)與脯氨酸含量變化不一致等現(xiàn)象，可能與高溫脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響機(jī)制比較復(fù)雜等有關(guān)。此外，本試驗(yàn)主要目的在于分析甜玉米自交系在幼苗生長(zhǎng)期間對(duì)高溫脅迫的反應(yīng)情況，但苗期耐熱性的形成是否與幼穗分化期、開(kāi)花期耐熱性具有一致表現(xiàn)尚有待更多的研究證明，而這也可能為耐熱型甜玉米自交系的選育提供新的思路。

3.1 高溫脅迫對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響

目前，關(guān)于玉米自交系苗期耐熱性鑒定尚未形成較為一致的方法，本試驗(yàn)在綜合前人研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合南方甜玉米夏播制繁種的實(shí)際情況和試驗(yàn)前期田間和室內(nèi)預(yù)處理結(jié)果，為了增強(qiáng)試驗(yàn)的脅迫壓力，采用45 ℃、24 h室內(nèi)較高溫度強(qiáng)化處理進(jìn)行苗期耐熱鑒定，以便選取苗期耐熱性更好的甜玉米自交系。通過(guò)本次試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，耐熱型自交系16號(hào)、51號(hào)幼苗在經(jīng)過(guò)高溫處理后僅表現(xiàn)出葉片略微發(fā)黃，葉片的形態(tài)并未發(fā)生顯著性變化，恢復(fù)生長(zhǎng)后，葉片會(huì)恢復(fù)深綠；而耐熱性最差的71號(hào)自交系在高溫處理期間葉片即發(fā)生萎蔫、干枯、下垂，部分幼苗已經(jīng)死亡，至恢復(fù)生長(zhǎng)后全部枯死；從形態(tài)上看，56號(hào)自交系的耐熱性比71號(hào)略好，高溫處理結(jié)束后僅有個(gè)別幼苗形態(tài)發(fā)生改變，但在恢復(fù)生長(zhǎng)期間也全部枯死。

3.2 高溫脅迫對(duì)光合作用的影響

光合作用是植物最重要的生理反應(yīng)之一，極易受到高溫影響。本次試驗(yàn)表明，51號(hào)自交系的葉綠體耐熱性強(qiáng)，經(jīng)高溫脅迫后的恢復(fù)能力也較強(qiáng)。16號(hào)自交系在高溫處理和恢復(fù)生長(zhǎng)期間葉綠素含量整體呈下降趨勢(shì)，下降幅度顯著小于56號(hào)和71號(hào)，但恢復(fù)生長(zhǎng)后葉綠素含量的繼續(xù)下降可能與種子貯存的養(yǎng)分相對(duì)較少、后期供應(yīng)不足有關(guān)。因此，葉綠素含量的變化與植物的耐熱性存在一定相關(guān)性，這與前人的研究結(jié)果相一致[6]。總體來(lái)看，高溫脅迫會(huì)加速葉綠素的分解，導(dǎo)致葉綠素含量的大幅下降。然而也有研究表明，高溫脅迫導(dǎo)致葉綠素含量下降的同時(shí)葉片也在不斷蒸騰失水，從而導(dǎo)致葉綠素相對(duì)含量增加[38]。

葉綠素a/b的值反映了植物對(duì)光能利用的程度，比值越大說(shuō)明對(duì)光能的利用能力越強(qiáng)，這種現(xiàn)象在番茄和甘蔗的耐熱性品種中均能觀察到[9，39-40]。也有研究認(rèn)為，葉綠素a/b代表類囊體的垛疊程度，比值越高，耐熱性越強(qiáng)[41]。本試驗(yàn)中，熱敏感型56號(hào)和71號(hào)自交系的光合能力受到極大破壞。16號(hào)自交系在高溫處理期間葉綠素a/b值緩慢下降，恢復(fù)生長(zhǎng)12 h后由于葉綠素b含量較葉綠素a下降更多，其比值回升至處理前水平。51號(hào)自交系葉綠素a/b的值總體呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明其對(duì)光能的利用能力在下降，但其通過(guò)提高葉綠素a、b的含量增加了對(duì)光能的利用。

3.3 高溫脅迫對(duì)脯氨酸代謝的影響

植物體內(nèi)游離脯氨酸含量在一定程度上可以表示植物對(duì)逆境的抵抗能力。本試驗(yàn)中，71號(hào)自交系在高溫處理期間脯氨酸含量?jī)H略微上升，之后緩慢下降，說(shuō)明其耐熱性最差。熱脅迫期間脯氨酸的大量積累可能是56號(hào)自交系的耐熱性優(yōu)于71號(hào)自交系的原因之一，這與2個(gè)自交系在高溫處理結(jié)束后存在較大差異相一致。16號(hào)自交系在高溫脅迫期間脯氨酸含量的變化趨勢(shì)與56號(hào)自交系類似，說(shuō)明脯氨酸是應(yīng)對(duì)高溫脅迫的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。但16號(hào)自交系在恢復(fù)生長(zhǎng)期間脯氨酸含量下降的原因可能是多余的游離脯氨酸無(wú)需再維持滲透勢(shì)，轉(zhuǎn)而參與植物的代謝過(guò)程；而56號(hào)自交系在恢復(fù)生長(zhǎng)期間逐漸枯死從而導(dǎo)致脯氨酸含量的下降。51號(hào)自交系脯氨酸含量一直維持在較低水平，變化幅度小，說(shuō)明脯氨酸的滲透調(diào)節(jié)可能不是51號(hào)自交系應(yīng)對(duì)高溫脅迫的主要調(diào)節(jié)途徑，這也符合某些學(xué)者的論點(diǎn)，即高溫脅迫可以誘導(dǎo)游離脯氨酸的積累，但其含量的高低與耐熱性強(qiáng)弱沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)的關(guān)系[18，42]。

此外，本次試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，脯氨酸合成途徑的關(guān)鍵基因ZmP5CS的表達(dá)受高溫誘導(dǎo)，在高溫處理期間其表達(dá)量有所上升，這與前人研究的P5CS基因受脫落酸、干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)，不受高溫或低溫所誘導(dǎo)這一結(jié)論不相符[43]。同時(shí)，耐熱性不同的自交系ZmP5CS和ZmProDH在高溫脅迫期間的表達(dá)趨勢(shì)與自交系幼苗內(nèi)脯氨酸含量的變化趨勢(shì)并不一致，可能是脯氨酸合成的谷氨酸途徑中P5CS雖為限速酶，但高溫還會(huì)對(duì)該途徑涉及的中間代謝物和其他酶類產(chǎn)生較大影響。最近研究結(jié)果也表明，P5CS和谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)才是逆境脅迫下植物體內(nèi)脯氨酸合成的關(guān)鍵酶[34-36]。此外，干旱和低溫均能活化脯氨酸合成的2條途徑，且干旱脅迫下脯氨酸的積累更依賴于鳥(niǎo)氨酸途徑[36，44]。因此，高溫脅迫對(duì)鳥(niǎo)氨酸途徑造成的影響或許也會(huì)導(dǎo)致這一現(xiàn)象發(fā)生。

3.4 高溫脅迫對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)的影響

抗氧化酶系統(tǒng)被認(rèn)為是植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)重要的防御體系。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，耐熱性弱的自交系經(jīng)高溫處理后SOD活性下降，而耐熱性強(qiáng)的自交系其SOD對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)較強(qiáng)，這也與前人的研究結(jié)果“SOD活性的升高通常與植物對(duì)環(huán)境下脅迫的耐受性有關(guān)”一致[45]，由此推測(cè)，SOD較高的穩(wěn)定性和活性水平是其抵御高溫脅迫的主要途徑之一。同樣，POD、CAT、APX和GR在高溫下也能增強(qiáng)植物的耐熱性，并且在耐熱型自交系中其熱穩(wěn)定性和恢復(fù)能力更強(qiáng)。

3.5 高溫脅迫對(duì)熱激蛋白基因表達(dá)的影響

真核細(xì)胞中，熱激蛋白HSP90是真核生物所必需的，其含量豐富，約占總蛋白的1%～2%，且在熱脅迫下，HSP90含量可增加到總蛋白的4%～6%[46]。HSP70基因家族可以分為4個(gè)亞家族，分別定位于胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)體和線粒體，其中，胞質(zhì)HSP70已被證明參與植物耐熱性的建成[47]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比耐熱性不同的自交系發(fā)現(xiàn)，耐熱性強(qiáng)的自交系熱激蛋白基因的表達(dá)水平更高，同時(shí)高溫脅迫下熱激蛋白基因的高表達(dá)能提高植物的耐熱性。