雌激素受體基因單核苷酸多態(tài)性與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的關(guān)系

李可可 王 璐 黨 潔 馬占兵 陸 宏

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指妊娠20周前重復(fù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)，發(fā)生率約為1%～5%[1～3]。除了已知的致病因素(如染色體異常、自身免疫、內(nèi)分泌、解剖等)外，目前尚有約50%的RSA病因未明[4]。臨床實(shí)驗(yàn)與觀察發(fā)現(xiàn)，妊娠的維持不僅取決于免疫平衡，還依賴于激素的支持。雌激素作為女性生殖系統(tǒng)最重要的性激素之一，其生理作用需由雌激素受體(estronge receptor, ER)來介導(dǎo)[5,6]。ER有ERα、ERβ兩種亞型(estrogen receptor α、β)，分別由位于不同染色體上的雌激素受體α和β基因(estrogen receptor α、β gene，ERα、ERβ)編碼。研究表明，ER基因(ERα、ERβ)的不同多態(tài)性位點(diǎn)(如ERα：rs2234693、rs9340799，ERβ：rs1256049、rs4986938等)可能會(huì)影響不同的雌激素依賴途徑，從而與很多女性疾病(如子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜癌等)的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)[7]。近年來，ER基因作為一種可能與RSA相關(guān)的候選基因，其上述4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與RSA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究報(bào)道亦逐漸增多，但結(jié)果不盡一致[8～16]。本研究探究ER基因單核苷酸多態(tài)性與寧夏回族自治區(qū)漢族婦女RSA是否相關(guān)。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：選取2009年1月～2015年12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院確診的RSA患者95例為病例組，患者年齡20～34歲，平均年齡27.63±3.25歲；另選取同一時(shí)期在該院正常分娩，基本信息(民族、年齡等)與病例組相當(dāng)?shù)慕】蹬?90例為對(duì)照組，年齡20～36歲，平均年齡27.37±2.50歲。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：患者及配偶均無染色體異常，男方精液正常；無成功妊娠史，流產(chǎn)次數(shù)≥3胎且孕周均<20周；排除子宮等生殖器官畸形及感染等因素；無遺傳病家族史；對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)檢查至少有1次成功妊娠史，排除有早產(chǎn)、自然流產(chǎn)、死胎及妊娠高血壓等情況的個(gè)體。對(duì)照組與病例組均為漢族，年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

2.SNPs的確定：通過文獻(xiàn)查閱，嚴(yán)格按選點(diǎn)要求篩選并確定ER基因的SNPs位點(diǎn)：以1000 Genomes及NCBI數(shù)據(jù)庫中的HapMap-HCB(中國(guó)北京漢族)分型數(shù)據(jù)為參照，選取了ER基因外顯子區(qū)及對(duì)外顯子剪切、拼接可能有影響，但生物學(xué)功能尚不明確的內(nèi)含子區(qū)域共4個(gè)SNPs(ERα：rs2234693、rs9340799，ERβ：rs1256049、rs4986938)進(jìn)行研究(表1)。

表1 入選基因及SNP位點(diǎn)定位

3.DNA提取：EDTA抗凝管無菌采集2(5ml靜脈血，存于-80℃冰箱；北京天根公司全血DNA試劑盒提取DNA，1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定DNA純度及濃度。

4.基因分型：采用美國(guó)ABI公司(http://www.lifetechnologies.com)設(shè)計(jì)并合成的TaqMan探針，通過ABI7500fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行基因初步分型。PCR反應(yīng)體系：5μl (含2×Primer Mix 2.5μl，三蒸水1.275μl，40×Taqman探針0.125μl，50×ROX 0.1μl，模板DNA 1μl)。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性20s；變性95℃ 3s；退火60℃ 30s；延伸60℃ 1min；循環(huán)40次，4℃保存。根據(jù)結(jié)果中質(zhì)量報(bào)告、散點(diǎn)圖、熒光擴(kuò)增曲線，參照NCBI(http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/)群體數(shù)據(jù)庫對(duì)初步分出的基因型進(jìn)行最終確定。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。SNPs位點(diǎn)基因型分布的群體代表性以Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗(yàn)；對(duì)照組與病例組間基因型及等位基因頻率分布的差異性比較采用χ2檢驗(yàn)；比值比(OR)和95%可信區(qū)間(95% CI)采用二元Logistic回歸計(jì)算，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.H-W平衡檢驗(yàn)：經(jīng)檢驗(yàn)，4個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在所選研究對(duì)象中的分布均符合H-W平衡(P均>0.05)，表明所選對(duì)象有群體代表性。

2.基因分型：Taqman探針基因分型結(jié)果參考NCBI上北京漢族人群相關(guān)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,rs2234693分出3種基因型，即CC、CT和TT；rs9340799分出3種基因型，即AA、AG和GG；rs1256049分出3種基因型，即AA、AG和GG；rs4986938分出3種基因型，即AA、AG和GG。

3.ER基因(ERα、ERβ)4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的分布：對(duì)照組及病例組ER基因4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布的差異性比較結(jié)果表明，ERα基因rs2234693位點(diǎn)等位基因分布頻率在兩組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隱性模型下，CC+CT和TT基因型在兩組的分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。ERα基因型頻率及ERβ基因rs1256049、rs4986938兩位點(diǎn)基因型與等位基因頻率分布在兩組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，表2、表3)。

表2 對(duì)照組與病例組ERα基因基因型及等位基因分布頻率的比較[n(%)]

討 論

人類雌激素受體是配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，盡管其亞型ERα和ERβ具有高度的同源性，但其功能可能并不完全相同[17]：ERα主要調(diào)節(jié)排卵效率、卵泡生長(zhǎng)及卵母細(xì)胞的發(fā)育，而ERβ主要在受精中起關(guān)鍵作用[8,9]。

Pineda等[12]對(duì)ERα基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與西班牙女性RSA的相關(guān)研究表明，病例組rs2234693和rs9340799位點(diǎn)TT基因型和AA基因型的分布頻率與對(duì)照組相比較均顯著增高，推測(cè)ERα基因這兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與該地區(qū)女性RSA有關(guān)。關(guān)菁等[13]對(duì)中國(guó)北京女性RSA患者ERα基因相關(guān)研究結(jié)果亦顯示，rs2234693的基因型分布頻率在病例組和對(duì)照組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但rs9340799位點(diǎn)多態(tài)性在兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故認(rèn)為rs2234693位點(diǎn)多態(tài)性與北京婦女RSA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有一定關(guān)聯(lián)。不同的是，Aléssio等[14]對(duì)巴西RSA患者ERα基因上述2個(gè)SNPs進(jìn)行的研究結(jié)果顯示，ERα基因多態(tài)性與當(dāng)?shù)貗D女RSA無關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs2234693位點(diǎn)基因型及rs9340799位點(diǎn)基因型和等位基因在病例組與對(duì)照組的分布頻率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但rs2234693位點(diǎn)等位基因(C、T)頻率在兩組的分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.131，P=0.024，OR=1.498，95% CI：1.055～2.126)，提示 T等位基因與RSA呈正相關(guān)(OR>1)，攜帶T等位基因型可能會(huì)增加女性發(fā)生RSA的風(fēng)險(xiǎn)，且隱性模型下，CC+CT和TT基因型在RSA患者組的分布頻率分別為76.8%、23.2%， 而其在對(duì)照組中的分布頻率分別為84.7%、15.3%，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，攜帶TT基因型的女性發(fā)生RSA的風(fēng)險(xiǎn)是(CC+CT)基因型女性的1.86倍，提示，攜帶TT基因型的患者更容易發(fā)生RSA，呈T隱性遺傳模式。以上結(jié)果說明ERα基因rs2234693多態(tài)性位點(diǎn)與寧夏回族自治區(qū)漢族女性RSA有一定關(guān)聯(lián)。以往研究表明，ER基因敲除的成年雌鼠生殖功能嚴(yán)重缺陷，出現(xiàn)子宮、宮頸和卵巢發(fā)育不全，卵泡發(fā)育過程中閉鎖提前，成熟卵泡減少，并表現(xiàn)出不孕[18]。可見ER基因功能異?？蓪?dǎo)致生殖系統(tǒng)發(fā)育的一系列異常，在女性可能影響其妊娠結(jié)局。由此推測(cè)，本研究結(jié)果中ERα基因rs2234693位點(diǎn)多態(tài)性的變化可能使ERα基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平失調(diào)，影響了基因的表達(dá)，從而妨礙了雌激素的生化作用及其與ER間功能效應(yīng)，導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常及排卵障礙，使卵細(xì)胞的受孕能力及胚胎分化發(fā)育能力降低，同時(shí)使子宮內(nèi)膜容受性與受精卵發(fā)育不同步，最終使胚胎不能正常發(fā)育致使流產(chǎn)的發(fā)生，但真正原因尚需更多研究證實(shí)。本研究結(jié)果驗(yàn)證了Pineda等[12]和關(guān)菁等[13]的相關(guān)研究結(jié)果，但與Aléssio等[14]對(duì)巴西婦女的結(jié)果不同，提示ERα基因2個(gè)SNPs的分布可能存在種族及地區(qū)差異。

表3 對(duì)照組與病例組ERβ基因基因型及等位基因分布頻率的比較[n(%)]

以往對(duì)ERβ基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與不同地區(qū)、不同種族女性RSA的研究顯示，ERβ基因 rs1256049、rs4986938 2個(gè)單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性與伊朗婦女RSA的發(fā)生有一定關(guān)系，但與韓國(guó)、巴西等婦女RSA并無顯著關(guān)聯(lián)[12,19，20]。郭春燕等[16]對(duì)中國(guó)重慶地區(qū)婦女的相關(guān)研究亦未發(fā)現(xiàn)ERβ基因上述2個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與當(dāng)?shù)嘏訰SA的發(fā)病有關(guān)。由于ERβ基因rs1256049位點(diǎn)基因型分布在亞洲人和高加索人間的存在差異，而伊朗人群該基因型的分布頻率接近于高加索人群，因此，與韓國(guó)及中國(guó)研究結(jié)果一致[12,16,19]。本研究通過比較分析ERβ基因2個(gè)SNPs位點(diǎn)(rs1256049、rs4986938)多態(tài)性在寧夏回族自治區(qū)漢族女性的分布特征發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率在病例組與對(duì)照組的分布頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，進(jìn)一步在顯性模型及隱性模型下對(duì)其分布特征進(jìn)行比較，仍未發(fā)現(xiàn)其分布頻率在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故說明寧夏回族自治區(qū)漢族女性RSA的發(fā)生與ERβ基因多態(tài)性可能無明顯關(guān)聯(lián)，具體原因尚無法解釋。與ERα基因類似，此結(jié)果從某種程度上也提示，ERβ基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)可能也具有種族和地區(qū)差異性。

綜上所述，本研究結(jié)果一定程度上提示ERα基因rs2234693位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與寧夏漢族女性RSA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有一定相關(guān)性，若此結(jié)果可被諸多同行在不同地區(qū)及不同人群得以驗(yàn)證，則可為RSA的早期預(yù)防和診斷提供有利的參考信息。但是，ER基因其他位點(diǎn)與RSA間是否存在關(guān)聯(lián)并未得到證實(shí)，尚需今后開展深入研究闡明。