SLCO1B1多態(tài)性及脂代謝與糖尿病腎病的相關性研究

趙 玲 柯亭羽 郭 佳 李孔龍 潘 毅 王 曦

糖尿病腎病是2型糖尿病的主要慢性并發(fā)癥之一，其降低了患者的生活質(zhì)量,增加了糖尿病病死率，給衛(wèi)生保健系統(tǒng)造成了沉重的負擔。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)患者出現(xiàn)腎功能不全后，其腎功能惡化的進展速度較一般腎小球腎炎快，接受腎臟替代治療時的預后也比一般慢性腎臟疾病差[1]。所以DN的早期診斷、治療及高危人群的篩查顯得尤為重要。高血糖是DN發(fā)生、發(fā)展的重要因素，但卻不是唯一因素。DN的發(fā)生、發(fā)展還與復雜的遺傳背景相關，這可能部分歸因于遺傳易感性[2]。本研究就SLCO1B1基因多態(tài)性及脂代謝在2型糖尿病腎病發(fā)病中的作用進行研究。

對象與方法

1.對象:(1)對照組：選取2016年于昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科因高血壓或者冠心病住院的患者共66例，均無內(nèi)分泌疾病及糖尿病家族史。(2)2型糖尿病非腎病及腎病組：選取2016年于昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院住院的2型糖尿病患者100例，按尿白蛋白/肌酐比值(albumin /creatinine ratio，ACR)再分為2型糖尿病未合并腎病組即DN(-)組，共60例；2型糖尿病腎病組即DN(+)組，共40例。

2.診斷標準:(1)糖尿病的診斷標準:采用1999年WHO提出的糖尿病診斷標準：①糖尿病癥狀(典型的糖尿病癥狀包括多尿、多飲和無法解釋的體重降低)，任意時間血漿葡萄糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)；②空腹(空腹是指無熱量攝入至少8h)血漿葡萄糖≥7.0mmol/L(126mg/dl)；③口服葡萄糖耐量實驗，葡萄糖(75g無水葡萄糖)負荷后2h血糖≥11.1mmol/L(200mg/dl)。(2)糖尿病腎病診斷標準:2014 年美國糖尿病協(xié)會(American Diabetes Association，ADA)與美國腎臟病基金會(National Kidney Foundation，NKF)達成共識，認為 DKD(diabetic kidney disease)是指由糖尿病引起的慢性腎病，主要包括腎小球濾過率(glomerular filtration rate,GFR)低于60ml/(min·1.73m2)或尿白蛋白/肌酐比值(ACR)>30mg/g持續(xù)超過3個月。 本研究將ACR>30mg/g定義為糖尿病腎病。

3.排除標準:(1)1型糖尿病患者。(2)嚴重的心臟、肝、腎衰竭患者。(3)藥物中毒，感染和多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、尿路感染、輸尿管結石和腫瘤、腎臟疾病等可能引起蛋白尿的疾病。(4)24h內(nèi)有劇烈運動者。(5)有放射線接觸史者。(6)孕婦或者哺乳期者。(7)各受試對象間有血緣關系。

4.標本和臨床資料的采集:(1)姓名、性別、年齡、身高(cm)、體重(kg)、計算體重指數(shù)(BMI=體重/身高2，kg/m2)、糖尿病病程、用藥史。(2)所有研究對象空腹8h后清晨采集靜脈血4ml用于測定甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、肝功能、腎功能指標。(3)采集晨尿測定尿液分析+尿沉渣定量、尿微量白蛋白。(4)尿蛋白定性及尿微量白蛋白異常的患者還收集24h尿蛋白定量結果。(5)采集2ml靜脈血加入EDTA抗凝劑，用于DNA的提取、PCR擴增，進行ApoE、SLCO1B1基因多態(tài)性分析。

5.檢測方法及原理:多重熒光定量PCR技術，基于熒光定量PCR平臺，首先針對SNP位點上下游設計特異性引物，分別針對野生型及突變型位點設計不同熒光基團標記的特異性探針，然后對引物及探針進行科學的配比組合，配置SNP位點檢測體系，通過熒光定量PCR儀對臨床樣本DNA進行PCR擴增，同時收集擴增信號，如果信號為野生型探針信號，那么樣本為純合野生型；如果信號為突變型探針信號，那么樣本為純合突變型；如果信號同時有野生型及突變型探針信號，那么樣本為雜合突變型。

結 果

1.3組間血脂的比較:3組人群的甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇經(jīng)單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)高密度脂蛋白膽固醇比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進而采用LSD法進行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，對照組和DN(+)組(P=0.040)、DN(-)組和DN(+)組(P=0.013)高密度脂蛋白膽固醇比較，差異有統(tǒng)計學意義。DN(-)組和DN(+)組血脂比較，兩組患者的甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋膽固醇白經(jīng)兩獨立樣本t檢驗，發(fā)現(xiàn)DN(+)組高密度脂蛋白膽固醇水平低于DN(-)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表1。

2.SLCO1B1基因多態(tài)性與2型糖尿病腎病:3組人群SLCO1B1基因型頻率比較:(1)3組人群388A>G、521T>G位點基因型分布情況,詳見表2、圖1。(2)SLCO1B1基因388A>G(χ2=1.709，P=0.750)和521T>G(χ2=1.786，P=0.755)的基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 3組人群血脂比較

3組人群SLCO1B1 388A>G、521T>G位點等位基因頻率比較:(1)3組人群388A>G、521T>G位點等位基因分布情況,詳見表3、圖2。(2)3組患者組SLCO1B1等位基因頻率經(jīng)χ2檢驗，388A>G(χ2=1.279，P=0.528)和521T>G(χ2=0.103，P=0.950)等位基因比較，差異無統(tǒng)計學意義。

3組人群SLCO1B1基因單倍型分析:(1)3組人群SLCO1B1基因單倍型分布詳見表4、圖3。(2)3組人群SLCO1B1基因單倍型頻率經(jīng)χ2檢驗差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.237，P=0.872)。

表2 3組SLCO1B 1 基因型頻率比較 [n(%)]

圖1 SLCO1B1 388A>G、521T>C位點基因型頻率分布

表3 3組間SLCO1B 1388A>G、521T>G位點等位基因頻率比較[n(%)]

組別388A>G521T>GAGCT對照組34(25.76)98(74.24)15(11.36)117(88.64)DN(-)組32(26.67)88(73.33)15(12.50)105(87.50)DN(+)組16(20.00)64(80.00)9(11.25)71(88.75)合計82(24.70)250(75.30)39(11.75)293(88.25)

圖2 SLCO1B1 388A>G、521T>C等位基因頻率分布

表4 SLCO1B1基因單倍型頻率比較

組別*15*1a*1b合計對照組5(7.58)3(4.55)58(87.88)66DN(-)組4(6.67)4(6.67)52(86.67)60DN(+)組4(10.00)1(2.50)35(87.50)40合計13(7.83)8(4.82)145(87.35)166

圖3 SLCO1B1單倍體型頻率分布

討 論

OATP1B1基因是主要的肝臟轉入載體，在人體肝臟基底膜外側表達。其生理功能包括：介導肝細胞膜轉運內(nèi)、外源性物質(zhì)并對其進行代謝和消除。人類OATP1B1基因位于12號染色體的短臂21區(qū)2帶，全長108.59kb，包括15個外顯子和14個內(nèi)含子，其編碼基因SLCO1B1的cDNA包含2073個堿基，編碼697個氨基酸，具有高度遺傳多態(tài)性。其中，被研究最多也是在亞洲人群中最常見的2個非同義突變?yōu)?88A>G和521T>C，在中國人群中388A>G和521T>C的突變率分別為73.4%和14%。SLCO1B1基因(A388G)和(T521C)兩位點的非同義突變可隨機組合為3種單倍體類型：雙野生型(兩位點均沒有突變*1A(388A521T)、雙突變型(兩個位點均突變)*15(388G521C)和單突變型(只有1個位點突變)*1B(388G521T)或*5(388A521C)[3，4]。常見的521T>C位于蛋白跨膜區(qū)，可使 OATP1B1的與底物的親和力下降，轉運活性下降[5]。具有521T> C變異的單倍體，如SLCO1B1*5、*15～*17等，有相似的表型，所編碼的蛋白轉運功能下降。體內(nèi)試驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)攜帶521C等位基因的個體OATP1B1轉運活性下降，可減少多種藥物進入肝細胞的速率，阻礙藥物代謝[6]。388A>G，不僅構成SLCO1B1*1b，還存在于 SLCO1B1*15中(388G-521C)。SLCO1B1* 1b對轉運功能的影響還沒有一致的結論，部分研究認為它對蛋白的功能沒有影響，但一些研究認為會增強轉運作用。

目前，對SLCO1B1基因的研究主要集中于SLCO1B1基因多態(tài)性對藥物代謝、治療效果及相關不良反應方面的研究，其中以研究他汀類降脂藥及口服降糖藥療效的研究居多。而目前SLCO1BI與疾病相關性的研究甚少，有研究顯示SLCO1B1基因 388A>G和521T>C基因多態(tài)性與云南白族人群冠心病發(fā)病之間可能無相關性[7]。另一項研究同樣也顯示SLCO1B1 388A>G和521T>C的基因型和等位基因頻率以及SLCO1B1基因單倍體頻率在冠心病組和對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義[8]。本研究顯示SLCO1B1 388A>G和521T>C的基因型和等位基因頻率以及SLCO1B1基因單倍體頻率在DN(-)、DN(+)組和對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義，研究認為SLCO1B1 388A>G和521T>C位點基因多態(tài)性與2型糖尿病、2型糖尿病腎病無明顯的相關性。

糖尿病腎病的主要病理變化是腎臟高灌注、高濾過、腎小球基膜增厚以及腎小球系膜區(qū)為主的細胞外基質(zhì)積累，導致彌漫性或結節(jié)性腎小球硬化。目前研究發(fā)現(xiàn)腎小球硬化與動脈粥樣硬化有相似的病理生理過程，均與血脂異常有關[9]。大量研究顯示2型糖尿病患者血脂紊亂和DN之間有著高度的相關性。研究發(fā)現(xiàn)合并高TG血癥及高LDL-C血癥的早期DN患者的尿微量白蛋白明顯高于未合并以上血脂紊亂者[10]。有研究顯示，糖尿病腎病各組與無腎病組比較，HDL-C明顯降低，隨著腎臟損害的加重，血脂紊亂加劇，表現(xiàn)為TG、TC、LDL-C、Apro-B逐步升高，而HDL-C、Apro-A逐漸降低[11]。本研究得到了與上述研究類似的結果，與DN(-)組比較，DN(+)組的高密度脂蛋白膽固醇明顯降低，Logistic回歸分析顯示，HDL-C降低是2型糖尿病腎病發(fā)病的危險因素。脂代謝紊亂導致糖尿病腎病的主要機制可能有以下幾種：(1)LDL-C與腎小球內(nèi)膜下基質(zhì)結合，發(fā)生氧化修飾與被巨噬細胞吞噬，引起泡沫細胞的形成，導致脂質(zhì)沉積，與動脈硬化相似，腎小球硬化與巨噬細胞轉化為泡沫細胞有密切的聯(lián)系[12]。(2)HDL-C具有抗動脈粥樣硬化的作用。它能促進膽固醇的排泄，加速極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)的代謝，防止動脈壁脂質(zhì)的沉積，因此是防止動脈粥樣硬化的保護因子。當HDL-C降低時，可能促進腎動脈粥樣硬化的發(fā)生，導致糖尿病腎病。(3)纖溶酶活性可被脂蛋白競爭性抑制，通過腎小球毛細血管凝血和血栓形成，改變腎小球血流動力學，從而使缺氧、缺血加重[13]。(4)氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox LDL)有細胞毒性、促炎癥和免疫特性，可通過細胞毒性誘導細胞凋亡[14]。

近年來，研究者相繼發(fā)現(xiàn)了一些與糖尿病腎病有關的遺傳易感基因和易感染色體位點，這不僅有助于在分子水平認識糖尿病腎病的發(fā)病機制，同時還可能鑒定出高危人群，以利于早期診斷及防治、個體化藥物治療甚至進行基因治療[15]。因此，從遺傳學角度闡述2型糖尿病腎病對疾病的預診斷以及臨床治療意義重大。