八種肺衣屬地衣內(nèi)生真菌的鑒定及抗菌活性研究

范海云 滕夢(mèng)婷 周生亮 馬琳 李鷹 劉欣欣 丁孺孺 張鵬

摘要：采用平板分離法，從四川省黃龍、九寨溝等地采集肺衣屬（lobaria sp.）地衣中分離內(nèi)生真菌，分別對(duì)其進(jìn)行液體發(fā)酵后檢測(cè)發(fā)酵液的抑菌活性，并對(duì)具有抑菌活性的內(nèi)生真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明，分離得到37株內(nèi)生真菌，其中有8株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液具有一定的抑菌活性，分別屬于黑孢屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬和木霉屬等。

關(guān)鍵詞：肺衣屬（lobaria sp.）地衣;內(nèi)生真菌;分離鑒定;抗菌活性

中圖分類號(hào)：Q949.34;Q93? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）12-0092-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.12.021? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Using plate separation method， and endophytic fungi was isolated from Lobaria sp. lichens， which were collected from Huanglong and Jiuzhaigou of Sichuan province. These endophytic fungi were inoculated into liquid medium. The antimicrobial activity of the fermentation fluid were respectively evaluated. These fungi were identified by morphology and molecular biology method. The results showed that 37 endophytic fungi were isolated， and 8 of which had antibacterial activity， which belonged to Melanspora， Streptospora， Fusarium and Trichoderma， respectively.

Key words： Lobaria sp. lichen; endophytic fungi; separation and identification; antibacterial activity

地衣是由真菌和藻類共生的一類特殊生物，肺衣屬（Lobaria sp.）地衣屬于地卷目（Pcltigcralcs）肺衣科（Lobariaccac）。肺衣屬地衣屬于葉狀中到大型地衣，革質(zhì)或紙質(zhì)，具有不規(guī)則或二叉分裂，分裂平臥或翹起。光合共生物為球形綠藻或藍(lán)細(xì)菌[1]。肺衣屬地衣俗稱老龍皮，具有很好的藥用價(jià)值，其地衣體及提取物均可入藥，健脾利水，消食化積。目前發(fā)現(xiàn)肺衣屬地衣不但含有黃酮、蒽醌、縮酚酸、甾體、三萜酸以及芳香族化合物等類型多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，而且含有多種獨(dú)特的化合物資源[2-4]。

然而，地衣對(duì)大氣污染十分敏感。近年來，肺衣屬地衣由于受到大氣污染及酸雨等的影響而數(shù)量逐年減少，因其在世界很多地區(qū)的生存受到威脅而變得非常稀有[5]。肺衣屬地衣的生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境條件要求苛刻，導(dǎo)致其資源有限，難以大量采集，無法充分滿足醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的需求。

幾乎所有的植物中都存在內(nèi)生真菌[6]，地衣也不例外，它們與宿主共生，不引起宿主明顯病癥[7，8]。經(jīng)過與宿主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化，產(chǎn)生了與植物相同或相似的代謝物質(zhì)。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物包括生物堿[9]、黃酮化合物[10]、多酚化合物[11]、香豆素類化合物[12]、蒽醌類化合物[13]、大環(huán)內(nèi)酯類化合物[14]、新糖脂類化合物[15]、吲哚類二萜化合物[8]等大多具有一定的抗菌或抗癌活性。從與地衣共生的內(nèi)生真菌中尋找這些代謝產(chǎn)物，可以克服植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)物量少的問題，還可以有效保護(hù)珍貴的地衣資源。

肺衣屬地衣在中國吉林、云南、廣西、四川、浙江、陜西等多地都有分布，在太平洋群島及喜馬拉雅地區(qū)也廣泛存在。全世界約分布67種，中國分布22種[16]。據(jù)有關(guān)研究，不同海拔高度對(duì)同一種屬的地衣也會(huì)產(chǎn)生不同的影響[17]。黃龍位于四川省阿壩藏族羌族自治州松潘縣境內(nèi)，是中國保護(hù)完好的高原濕地。與黃龍相距100 km的九寨溝地區(qū)位于阿壩-藏族羌族自治州九寨溝縣漳扎鎮(zhèn)，是白水溝上游白河的支溝。這兩個(gè)地區(qū)的氣候條件非常適合肺衣屬地衣生存。

為進(jìn)一步開發(fā)肺衣屬地衣的藥用價(jià)值，從四川省黃龍及九寨溝地區(qū)采集了多種肺衣屬地衣標(biāo)本，從中分離內(nèi)生真菌，尋找可以替代肺衣屬地衣藥用價(jià)值的真菌，以保護(hù)珍貴的地衣資源，同時(shí)為地衣-真菌生態(tài)關(guān)系的研究提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 培養(yǎng)基? PDA固體培養(yǎng)基、PDB液體培養(yǎng)基、MHB培養(yǎng)基。

1.1.2? 供試菌株? 大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocu saureus ATCC29213）、黑曲霉（Aspergillus niger CGMCC3.06327）、白色念珠菌（Monilia albican ATCC64547）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa CGMCC1.10274）。

1.2? 方法

1.2.1? 內(nèi)生真菌的分離純化? 取地衣樣本，用自來水沖洗干凈后用無菌手術(shù)刀切成1 cm2左右的小塊，用70%乙醇表面消毒1 min，再用3%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，最后用無菌水沖洗3～4次。在無菌條件下，用鑷子夾取上述處理過的樣品，放在PDA固體平板中，每皿5塊，使其表面充分接觸培養(yǎng)基。在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，每日觀察，在菌絲從植物組織長(zhǎng)出后，從邊緣挑取菌絲移至另一PDA平板上進(jìn)行純化。

1.2.2? 菌株的發(fā)酵及次生代謝產(chǎn)物的提取? 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基采用PDA液體培養(yǎng)基，在每個(gè)三角瓶中加入30 mL培養(yǎng)基，在高壓蒸氣滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后。在無菌條件下，將菌種接入其中，移至恒溫培養(yǎng)箱中，30 ℃培養(yǎng)20 d。

1.2.3? 抗菌活性的檢測(cè)? 將得到的發(fā)酵液先加2 mL于離心管中，以12 000 r/min離心5 min，然后分別吸取50.00、25.00、12.50、6.25、3.13 μL上清液加到96孔板上，使用MHB培養(yǎng)基補(bǔ)足發(fā)酵液體至50 μL。制備菌懸液并在波長(zhǎng)為600 nm處測(cè)定其吸光度值，將吸光度值為1.0的菌懸液稀釋2 500倍備用。添加50 μL菌懸液到96孔板。37 ℃培養(yǎng)12～18 h后檢測(cè)發(fā)酵液最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.4? 菌株的鑒定

1）菌株的形態(tài)觀察。將菌株接種到PDA固體培養(yǎng)基表面，30 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落正反面特征并拍照記錄。菌株的菌絲長(zhǎng)短、粗細(xì)、顏色、性狀及孢子的形態(tài)特征通過載玻片培養(yǎng)法在顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

2）菌株的DNA提取與分子鑒定。挑出適量的菌絲體除去多余水分，放在研缽中，加入液氮研磨菌體至粉末狀，將研磨后的菌體移入離心管中。在離心管內(nèi)加入300 μL消解液[1 mol/mL Tris-HCl，0.5 mol/L 二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na·2H2O），10%十二烷基磺酸鈉（SDS）]混合均勻，放在55 ℃孵育? ? 5 min，然后在混合液中加入100 μL 5 mol/L的氯化鈉，混合均勻后，再加入100 μL的CTAB/NaCl溶液，振蕩搖勻后放在65 ℃孵育10 min，取出后加入700 μL的氯仿，顛倒混勻，然后以13 000 r/min離心10 min，取出上清液放入新的離心管中，再加入等量的氯仿混勻，接著以13 000 r/min離心5 min，繼續(xù)取上清液加入新的離心管中，再加入等體積的80%異丙醇，將混勻的液體放入-20 ℃的冰箱中放置過夜。13 000 r/min離心10 min后，去除上清液，用70%的乙醇洗滌沉淀2次，然后將其55 ℃干燥后加入去離子水溶解。

3）ITS序列擴(kuò)增。以內(nèi)生真菌的總DNA為模板，用真菌的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAAC

CTGCGG-3′，ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系為PCR Mix 15 μL、引物? 2 μL、模板2 μL、無菌水11 μL，總體積為30 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。最后將PCR產(chǎn)物委托生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank進(jìn)行Blast同源性比較，以Glustal進(jìn)行多序列對(duì)比后，運(yùn)用MECA 5.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 菌株的分離

利用組織分離法將采集的肺衣屬地衣在無菌操作的情況下，接種到PDA固體培養(yǎng)基上，從中共分離純化得到37株內(nèi)生真菌。具體的采集信息以及分離得到的內(nèi)生真菌的數(shù)量如表1所示。

2.2? 內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抗菌活性的篩選

將分離到的37株內(nèi)生真菌接種到PDB培養(yǎng)基中進(jìn)行液體發(fā)酵，20 d后收集發(fā)酵液，經(jīng)過無菌處理后檢測(cè)它們的抗菌活性。結(jié)果表明，有8株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液對(duì)不同的細(xì)菌或真菌有一定的抗菌活性。這8株內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抗菌活性結(jié)果如表2所示。HL031B2、HL218A1和YSSL31A1都對(duì)金色葡萄球菌有抑菌活性，其中HL031B2和YSSL31A1表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性;而HL217A2、YSSL31A2、HL058-2和HL058-4對(duì)黑曲霉表現(xiàn)出較好的抑菌效果;HL218C1對(duì)綠膿桿菌有較好的抑菌活性。

2.3? 菌株的鑒定

2.3.1? 形態(tài)學(xué)鑒定? 將具有抗菌活性的地衣內(nèi)生真菌接種到PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5～7 d后進(jìn)行觀察拍照，記錄其菌落特征。同時(shí)將菌株接種，利用玻片培養(yǎng)法在顯微鏡下觀察其菌絲及孢子形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。內(nèi)生真菌YSSL31A-2的菌絲初期為灰白色，3 d后顏色逐漸變深，菌絲由中心向外呈輻射狀生長(zhǎng)。菌絲有橫隔，分生孢子呈梨形或橢圓形，內(nèi)著生3～10個(gè)孢子。內(nèi)生真菌YSSL31A-1的菌落為白色絮狀，菌絲疏松，分生孢子無色，彎曲呈鐮刀狀，兩端略尖。

2.3.2? 分子生物學(xué)鑒定? 提取具有抗菌活性菌株的DNA，以ITS1和ITS4為引物對(duì)其ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增，送至生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果上傳到NCBI進(jìn)行Blast，結(jié)果如表3所示。HL031B2、HL058-2、YSSL31A2內(nèi)生真菌對(duì)應(yīng)的相近物種相似度達(dá)到100%，分別被鑒定為深綠木霉（Trichoderma atroviride）、黑孢霉（Nigrospora oryzae）和細(xì)極鏈格孢菌（Alternaria tenuissima），其余菌株與相近物種的相似度均為99%。

測(cè)序結(jié)果用Blast軟件在GenBank進(jìn)行同源性比較，以Glustal進(jìn)行多序列對(duì)比，運(yùn)用MECA 5.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。YSSL31A2與HL217A2親緣關(guān)系較近，同為木霉屬;HL058-4與HL218A1親緣關(guān)系較近，為同一屬;此外，HL058-2與HL218C1也表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系;其余菌株的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

3? 小結(jié)與討論

近年來，隨著抗生素的大量使用，耐藥性的快速增長(zhǎng)成為人們?nèi)找骊P(guān)注的問題之一，對(duì)新型抗菌物質(zhì)的研究也成為人類不得不解決的問題。肺衣屬地衣內(nèi)生真菌含有大量具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物。竇艷麗[18]從網(wǎng)肺衣（Lobaria retigera）中分離獲得的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物包括14個(gè)蒽醌類化合物、3個(gè)氧雜蒽酮類化合物、5個(gè)生物堿類化合物、3個(gè)甾體類化合物以及1個(gè)混源萜類化合物。這些代謝產(chǎn)物可以幫助宿主抵抗病原和昆蟲的攻擊、增強(qiáng)抗應(yīng)激和抗病能力[19，20]。此外，這些化合物中有些已經(jīng)被證明可以作為新藥發(fā)現(xiàn)的先導(dǎo)化合物[21-23]。內(nèi)生真菌及其次生代謝物對(duì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了積極的影響，為抗菌藥物的研究也提供了更加豐富的資源。

從四川地區(qū)的肺衣屬地衣中分離得到37株內(nèi)生真菌，分屬于8個(gè)屬，有木霉屬、錐毛殼屬、鏈格孢屬、鐮刀菌屬、黑孢屬等。對(duì)內(nèi)生真菌發(fā)酵液中的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，結(jié)果表明，它們對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、白色念珠菌、綠膿桿菌都有一定的抑菌效果。肺衣屬地衣內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性，其中部分具有較好的抑菌效果。下一步將對(duì)這8種內(nèi)生真菌進(jìn)行大批量發(fā)酵，并對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，以研究其中發(fā)揮抗菌活性的具體成分及其抗菌機(jī)制，有望從中發(fā)現(xiàn)新的抗菌活性物質(zhì)。

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收稿日期：2018-11-21

作者簡(jiǎn)介：范海云（1995-），女，河北張家口人，在讀本科生，（電話）18252161076（電子信箱）2074968664@qq.com;通信作者，張? 鵬，男，