二甲戊靈對輪葉黑藻生理特性的影響

朱凌 李蒙英 成中芹 謝立群

摘? ? 要：通過測定輪葉黑藻（Hydrilla verticillata）抗氧化酶（SOD和POD）活性，以及丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）和可溶性蛋白含量的變化，比較了不同濃度二甲戊靈對輪葉黑藻生理特性的影響，結(jié)果表明，輪葉黑藻經(jīng)0.10～2.00 mg·L-1二甲戊靈處理2 d后，體內(nèi)的SOD和POD活性顯著降低，但低濃度二甲戊靈對植物造成的氧化脅迫不足以引起SOD的防御機(jī)制形成，因而在短時(shí)間內(nèi)SOD活性快速下降，一段時(shí)間后上升;而4.00 mg·L-1二甲戊靈處理后2 d， SOD活性下降不明顯，說明高濃度二甲戊靈引起SOD的防御機(jī)制形成，誘導(dǎo)植物體內(nèi)抗氧化酶活性升高。輪葉黑藻經(jīng)4.00 mg·g-1處理后8 d，MDA含量出現(xiàn)了較其他試驗(yàn)組高的峰值;經(jīng)不同濃度二甲戊靈處理后10 d，1.00 mg·g-1以上使輪葉黑藻Pro含量顯著增加，2.00 mg·g-1以上使可溶性蛋白含量顯著下降，說明1.00 mg·g-1以上濃度二甲戊靈即顯著影響輪葉黑藻的重要生理學(xué)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：二甲戊靈;輪葉黑藻;生理特性

中圖分類號：Q178? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.07.003

Abstract： The effects of different concentrations of pendimethalin on the physiological characteristics of Hydrilla verticillata were studied by measuring the activities of antioxidant enzymes （SOD and POD）， the content of MDA， proline （Pro） and soluble protein. The results showed that the activity of SOD and POD in Hydrilla verticillata decreased significantly after the treatment with 0.10 to 2.00 mg·L-1 of pendimethalin for 2 days. However， the oxidative stress caused by low concentration pendimethalin on the plant was not enough to cause the formation of SOD defense mechanism， so SOD activity decreased rapidly in a short time and increased after a period of time. SOD did not decrease significantly at 2 d after treatment with 4.00 mg·L-1，this indicating that high concentration of pendimethalin caused the formation of SOD defense mechanism and induced the increase of antioxidant enzyme activity in the plant. After treatment with 4.00 mg·g-1 for 8 days， the content of MDA in the plant showed a high peak. At different concentrations for 10 days， the Pro increased significantly when the pendimethalin more than 1.00 mg·g-1. And the soluble protein notable decreased when pendimethalin above 2.00 mg·g-1. The results indicated that the concentration of pendimethalin above 1.00 mg·g-1 could significantly affect the important physiological indexes of Hydrilla verticillata.

Key words： pendimethalin; Hydrilla verticillata; physiological characteristics

為提高農(nóng)作物產(chǎn)量，大量不同品種的農(nóng)藥被用于控制農(nóng)業(yè)病蟲害和雜草生長。根據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局的數(shù)據(jù)，2007—2015年我國農(nóng)藥使用量逐年上升，2012年突破1 800 kg。由于噴施的農(nóng)藥只有少量停留在作物上發(fā)生效用，大部分進(jìn)入土壤[1]，隨著灌溉或雨水徑流匯入附近河、湖等地表水體，不但污染河、湖水體，也嚴(yán)重威脅河、湖水體中多種生物生存[2]。沉水植物作為河、湖等水體中重要的生物群，在增加水體溶解氧、為水生動(dòng)物提供食物和生長繁殖場所、凈化水體等方面發(fā)揮著必不可少的作用，是維持河、湖水體生物多樣性和穩(wěn)定性最基礎(chǔ)的一環(huán)[3-4]。然而，近年來河、湖等地表水環(huán)境中沉水植物衰退情況日益嚴(yán)重[5]，這種現(xiàn)象除與水體富營養(yǎng)化[6-8]、重金屬污染[9]等因素有關(guān)外，與除草劑污染也有著密切的關(guān)系，但目前關(guān)于除草劑對沉水植物的影響程度仍缺乏廣泛深入的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室條件下建立良好的沉水植物生長條件，培養(yǎng)輪葉黑藻，以世界第三大除草劑二甲戊靈[10]作為逆境條件，探究二甲戊靈對輪葉黑藻抗氧化酶SOD和POD活性，以及丙二醛MDA、脯氨酸Pro和可溶性蛋白含量的影響，以期為農(nóng)藥面源污染對沉水植物的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 取樣與試驗(yàn)條件

試驗(yàn)用輪葉黑藻（Hydrilla verticillata）取樣自蘇州大學(xué)獨(dú)墅湖校區(qū)北區(qū)池塘，該池塘屬于校方物業(yè)部門管理，據(jù)了解，在取樣前2個(gè)月未施二甲戊靈等除草劑。取樣于2017年6月20日進(jìn)行。

試驗(yàn)用二甲戊靈（Pendimethalin）為標(biāo)準(zhǔn)樣品（純度99.8%），購自 Sigma-Aldrich公司。試驗(yàn)用培養(yǎng)液采用1/6濃度的霍格蘭氏營養(yǎng)液，二甲戊靈處理濃度是指二甲戊樂靈標(biāo)準(zhǔn)樣品加入培養(yǎng)液中配置成的溶液終濃度。根據(jù)在自然條件河流中檢測到的二甲戊靈除草劑的濃度范圍[11]，設(shè)置試驗(yàn)組溶液濃度為0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，4.00 mg·L-1。將輪葉黑藻用蒸餾水沖洗凈后，放入培養(yǎng)液中馴化培養(yǎng)7 d，再放入含有濃度為0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，

4.00 mg·L-1的二甲戊靈試驗(yàn)組和對照組中，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，溫度為20～25 ℃，光暗時(shí)間比為12 h∶12 h，照度為3 600 Lx。各處理每48 h取樣測定1次;連續(xù)測定5次。

1.2 生理特性的測定方法

每48 h對輪葉黑藻植株取樣。各樣品用蒸餾水洗凈后用吸水紙吸干，稱取0.5 g，加入少量50 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH值=7.0）在冰浴中研磨成勻漿，再定容至5 mL后轉(zhuǎn)移至離心管，2 000 rpm離心15 min取上清液， 4 ℃冷藏備用，重復(fù)3次。

SOD活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定，上述3種試驗(yàn)方法參照李合生[12]方法進(jìn)行，SOD活性測定反應(yīng)液略有改進(jìn)，采用的混合反應(yīng)液見表1。Pro含量的測定，采用磺基水楊酸提取，茚三酮比色法進(jìn)行[13]?？扇苄缘鞍缀康臏y定，以1 mg·mL-1牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合法[14]測定。

對試驗(yàn)組與對照組的SOD和POD活性、MDA、Pro和可溶性蛋白含量的平均數(shù)進(jìn)行新復(fù)極差多重比較分析;使用Microsoft Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度二甲戊靈對輪葉黑藻SOD和POD活性的影響

處理前，輪葉黑藻葉片內(nèi)SOD值為（1 233.33±28.87） U·g-1，處理后2 d，各試驗(yàn)組中SOD活性見表2，隨二甲戊靈濃度從0.10 mg·L-1增加至2.00 mg·L-1，SOD活性相逐步降低，但濃度為4.00 mg·L-1時(shí)，SOD活性比其他試驗(yàn)組高;處理后4 d，4.00 mg·L-1濃度條件下SOD活性出現(xiàn)較大幅度下降，相比處理后2 d下降了24.08%;

而POD值，處理前為（8.78±1.67）（U·g-1），處理后POD均呈上升趨勢（表3），處理后2 d，0.1～2.00 mg·L-1濃度條件下，POD活性與對照組之間差異顯著，但是4.00 mg·L-1濃度條件下，POD活性與對照組之間無顯著差異，結(jié)果同SOD活性。

2.2 不同濃度二甲戊靈對輪葉黑藻MDA含量的影響

處理前，輪葉黑藻MDA含量為（16.17±2.02）（μmol·g-1），處理后變化情況見表4，對照組MDA的含量基本穩(wěn)定，但輪葉黑藻經(jīng)0.10～4.00 mg·L-1二甲戊靈處理后，與對照相比MDA含量總體出現(xiàn)增加趨勢。2.00 mg·L-1和4.00 mg·L-1二甲戊靈濃度處理峰值分別達(dá)到23.84和25.99，比其他試驗(yàn)組的峰高。

2.3 不同濃度二甲戊靈對輪葉黑藻Pro含量的影響

輪葉黑藻經(jīng)不同濃度二甲戊靈處理后10 d，低濃度處理組（0.10，0.20和0.50 mg·L-1）的脯氨酸（Pro）含量與對照組差異不顯著（圖1），高濃度處理組（1.00，2.00和4.00 mg·L-1）Pro含量顯著高于對照組。

2.4 不同濃度二甲戊靈對輪葉黑藻可溶性蛋白含量的影響

輪葉黑藻經(jīng)不同濃度二甲戊靈處理后10 d，隨著二甲戊靈處理濃度的增加，輪葉黑藻中可溶性蛋白含量呈下降趨勢，高濃度處理組（2.00 mg·L-1和4.00 mg·L-1）的可溶性蛋白含量有較大程度下降，與對照組之間呈顯著差異。

3 結(jié)論與討論

抗氧化酶SOD和POD是植物體中重要的保護(hù)機(jī)制基礎(chǔ)[15-16]，本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)輪葉黑藻在0.10～2.00 mg·L-1二甲戊靈處理時(shí)，可能該濃度范圍尚未觸發(fā)植物細(xì)胞合成SOD的保護(hù)機(jī)制，反而因?yàn)槎孜祆`的處理造成超氧自由基增多，影響了SOD的正常代謝，導(dǎo)致SOD活性降低;而4.00 mg·L-1濃度處理?xiàng)l件下，二甲戊靈的強(qiáng)烈脅迫誘使植物細(xì)胞加快合成SOD，從而該濃度條件下的SOD活性較高;但細(xì)胞合成SOD的能力是有限的，不足以將二甲戊靈作用所產(chǎn)生的超氧自由基清除到危害下限內(nèi)，SOD活性在處理后4 d也出現(xiàn)下降。趙士誠等[17]在鎘脅迫對植物SOD酶活影響的研究中，也發(fā)現(xiàn)用5 μmol·L-1鎘處理植株，SOD活性大部分時(shí)間低于對照和兩個(gè)高鎘處理，說明低濃度鎘對植物造成的輕微氧化脅迫不足以引起SOD防御機(jī)制的形成。但是需要強(qiáng)調(diào)的是，酶液樣品的SOD活性在4 ℃保存條件下的變化仍然明顯[18]，故測定的試驗(yàn)結(jié)果的橫向比較有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

MDA是膜脂過氧化物最終分解產(chǎn)物，積累越多表明組織的保護(hù)能力越弱[19-20];當(dāng)處理二甲戊靈濃度增大到4.00 mg·L-1，可能是由于植物體內(nèi)的SOD和POD的活性不能持續(xù)保持在較高的水平，導(dǎo)致對膜質(zhì)過氧化作用加強(qiáng)，細(xì)胞膜遭到進(jìn)一步破壞，進(jìn)而出現(xiàn)膜質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量的升高[21]。

脯氨酸Pro是植物體內(nèi)維持滲透壓的重要物質(zhì)之一，同時(shí)，作為植物體內(nèi)的一種貯氮機(jī)制，可以防止游離氨的積累，起到對植物的保護(hù)作用[21]，本試驗(yàn)表明，二甲戊靈在較高濃度下對Pro影響較大，這與Foolad和Jones[22]的研究吻合;可溶性蛋白含量在二甲戊靈濃度2.00 mg·L-1以上處理10 d后顯著降低，同樣表明植物體生長發(fā)育受到抑制的程度顯著升高[23-24]。

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