鴨甲肝病毒RT-LAMP檢測方法的建立

扈琴吉 楊宏禹 路曉 于可響 孫曉軍

摘? 要：基于A型和C型鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）3D基因的6個保守區(qū)域設(shè)計了4條引物，利用Bst DNA聚合酶在60℃恒溫保持45min即可完成反轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)，由此建立了鴨甲肝病毒的一步反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（RT-LAMP）方法。該方法具有良好的特異性，除DHAV外，對其他4種常見鴨病的檢測結(jié)果均為陰性。該方法對DHAV-A和DHAV-C病毒RNA的最低檢出量均為0.1pg，是常規(guī)RT-PCR方法的10倍。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，該方法與病毒分離鑒定方法的符合率為92.5%，而且對儀器要求低，適于基層實驗室和現(xiàn)場檢測。

關(guān)鍵詞：鴨甲肝病毒;3D基因;一步反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增;儀器要求低

中圖分類號：S858.32? ? ?文獻標識碼：B? ? ?文章編號：1673-1085（2019）06-0038-05

鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）引起的鴨病毒性肝炎是困擾我國養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的主要疾病之一。該病毒主要感染3周齡內(nèi)的雛鴨，感染率高、發(fā)病快、死亡率高，若不及時治療，死亡率可達50%以上。該病波及面廣、發(fā)病率高、危害嚴重，每年都會給我國的養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。鴨甲肝病毒分為A、B、C三個基因型，它們之間無抗原交叉性，目前在我國流行的主要是A型和C型[1-3]。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)是一種新的體外擴增特異性基因的分子生物學(xué)方法[4]。該方法只需要簡單的水浴鍋，在30～90min內(nèi)即可擴增大量的目的基因，而且可以不需要核酸電泳的方法來判斷結(jié)果，僅通過在紫外線下肉眼觀察就能判斷結(jié)果，具有特異性強、靈敏度高、檢測快速、儀器要求低、成本低廉等優(yōu)點，非常適合在基層實驗室，甚至現(xiàn)場進行快速診斷[5-6]。本研究正是根據(jù)LAMP技術(shù)的原理，建立了快速檢測鴨甲肝病毒的一步反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（RT-LAMP）方法，并進行了初步的臨床應(yīng)用。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 毒株? A型鴨甲肝病毒（DHAV-A）、C型鴨甲肝病毒（DHAV-C）、新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）、新型鴨細小病毒（NDPV）、鴨瘟病毒（DPV）和鴨坦布蘇病毒（DTMUV）均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所分離、保存。

1.1.2? 試劑與材料? 病毒核酸提取試劑盒購自AXYGEN公司;RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶購自TaKaRa公司; One Step RT-PCR Kit購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司;Bst DNA聚合酶（大片段）購自NEB公司;甜菜堿（betaine）購自Sigma公司;SYBR Green I購自Invitrogen公司。其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

SPF鴨胚由山東昊泰實驗動物公司提供。

1.2? 方法

1.2.1? 病毒增殖與純化? 將A型鴨甲肝病毒和C型鴨甲肝病毒分別做1000倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種11日齡SPF鴨胚，0.1ml/枚，各5枚，棄掉24h內(nèi)死亡的鴨胚，收集24～120h死亡鴨胚的尿囊液，經(jīng)蔗糖密度梯度離心進行濃縮純化，用于病毒DNA提取。

1.2.2? 引物設(shè)計與合成? 參考GenBank已發(fā)表的DHAV-A和DHAV-C的3D基因保守區(qū)域，利用Primer5.0軟件，設(shè)計針對6個區(qū)域的4條LAMP引物，包括2條外引物（DHV-F3和DHV-B3）、2條內(nèi)引物（DHV-FIP和DHV-BIP），引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。引物序列見表1。

1.2.3? 反應(yīng)條件優(yōu)化? 參考已報道的RT-LAMP實驗條件[7-8]，首先通過調(diào)整甜菜堿（Betaine）濃度、MgSO4濃度、擴增溫度和擴增時間對反應(yīng)體系和條件進行優(yōu)化，具體梯度如下：Betaine終濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6mol/L;MgSO4終濃度分別為1、3、5、7mmol/L;反應(yīng)溫度分別為58、60、62、64、66℃;反應(yīng)時間分別為30、45、60min。在確立初步反應(yīng)體系和條件的基礎(chǔ)上，對引物濃度進行進一步優(yōu)化，內(nèi)外引物濃度比例分別按6倍、8倍、10倍的組合進行，具體組合見表2。反應(yīng)結(jié)束后，在PCR管中加入1μl 10倍稀釋的SYBR GreenⅠ，混勻后在紫外線下觀察，若有黃綠色熒光，可判斷為陽性。

1.2.4? 特異性試驗? 分別提取A型鴨甲肝病毒、C型鴨甲肝病毒、新型鴨呼腸孤病毒、新型鴨細小病毒、鴨瘟病毒和鴨坦布蘇病毒的RNA，利用上述優(yōu)化的方法進行RT-LAMP檢測，反應(yīng)結(jié)束后，在PCR管中加入1μl 10倍稀釋的SYBR GreenⅠ，混勻后在紫外線下觀察，若有黃綠色熒光，可判斷為陽性。

1.2.5? 敏感性試驗? 分別提取A型和C型鴨甲肝病毒的RNA，利用分光光度計測定RNA的含量，并將這些RNA稀釋至20、2、0.2、0.02、0.002、0.0002pg/μl等六個濃度（即RT-LAMP檢測體系中RNA含量分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001pg），然后進行RT-LAMP反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，在PCR管中加入1μl 10倍稀釋的SYBR GreenⅠ，混勻后在紫外線下觀察，若有黃綠色熒光，可判斷為陽性。同時以上述不同含量的RNA為模板，以DHV-F3/DHV-B3為引物進行一步法RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系（25μl）如下：2×One Step mix 12.5μl，引物DHV-F3（10μmol/L）0.5μl，引物DHV-B3（10μmol/L）0.5μl，RNA模板5μl，無RNA酶水6.5μl。反應(yīng)程序為：50℃ 30min;94℃ 3min;94℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s，30個循環(huán);72℃ 5min。擴增結(jié)束后電泳觀察，出現(xiàn)大小為353bp的單一條帶判為陽性。并將這兩種方法的敏感性進行比較。

1.2.6? 臨床應(yīng)用? 從不同鴨場收集疑似病料40份，利用本研究建立的RT-LAMP方法進行檢測，同時將樣品處理后經(jīng)尿囊腔接種11日齡SPF鴨胚進行分離，盲傳3代后，利用陽性血清通過中和試驗對分離物進行鑒定，并比較兩種方法的符合性。

2? 結(jié)果

2.1? RT-LAMP反應(yīng)體系與條件優(yōu)化? 優(yōu)化后的反應(yīng)體系（25μl）為：10×Bst buffer 2.5μl、dNTP（10mmol/L）1.5μl、MgCl2（25mmol/L）3μl、betaine（5mol/L）2μl、外引物DHV-F3、DHV-B3（10μmol/L）各0.5μl、內(nèi)引物DHV-FIP、DHV-BIP（40μmol/L）各1μl、RNA酶抑制劑（40U/μl） 1μl、反轉(zhuǎn)錄酶AMV（5U/μl）1μl、Bst DNA聚合酶（8U/μl）1μl、RNA模板5μl、無RNA酶水5μl。

優(yōu)化后反應(yīng)條件為：60℃ 45min，85℃ 2min。

2.2? 特異性試驗? 利用優(yōu)化的RT-LAMP方法對A型和C型鴨甲肝病毒以及其他常見的鴨病病原進行檢測，結(jié)果顯示，僅A型和C型鴨甲肝病毒檢測結(jié)果為陽性（圖1）。

2.3? 敏感性試驗? 提取A型和C型鴨甲肝病毒的RNA，利用分光光度計測定RNA的含量分別為403ng/μl和286ng/μl，將RNA稀釋成6個不同的濃度，分別利用RT-LAMP方法和常規(guī)RT-PCR方法進行檢測。結(jié)果顯示，RT-LAMP方法對A型和C型鴨甲肝病毒RNA的最低檢出量均為0.1pg，其敏感度是常規(guī)RT-PCR方法的10倍（圖2）。

2.4? 臨床應(yīng)用? 利用RT-LAMP方法從40份臨床樣品中檢出陽性樣品22份，陽性檢出率為55.0%，而病毒分離鑒定檢出陽性樣品19份，陽性檢出率為47.5%，兩種方法的符合率為92.5%（表3）。

3? 討論

鴨甲肝病毒的實驗室診斷可以采取傳統(tǒng)的血清中和試驗，但該方法存在耗時長、不易標準化等缺點。也可以采取快速靈敏的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，如RT-PCR、熒光RT-PCR等方法，但這些方法需要PCR儀、電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)等較為復(fù)雜的儀器設(shè)備，不適合在廣大基層實驗室推廣應(yīng)用。本研究建立的鴨甲肝病毒一步RT-LAMP方法具有快速、準確、靈敏等優(yōu)點，特別是對儀器設(shè)備要求低，基因擴增和結(jié)果判斷只需要1臺水浴鍋、1臺紫外分析儀，因此非常適合在基層實驗室，甚至現(xiàn)場進行快速診斷。該方法耗時短，從收到病料到獲得結(jié)果只需2.5h：病料處理1h、核酸提取0.5h、核酸擴增0.9h、染色觀察0.1h。而常規(guī)RT-PCR檢測大約需要4.3h：病料處理1h、核酸提取0.5h、反轉(zhuǎn)錄0.8h、核酸擴增1.5h、電泳0.5h;熒光RT-PCR檢測大約需要3.5h：病料處理1h、核酸提取0.5h、核酸擴增2h。該方法對鴨甲肝病毒RNA的最低檢出量為0.1pg，其敏感度是利用相同的外引物建立的常規(guī)RT-PCR方法的10倍。這與Chen等[9]利用RT-LAMP方法檢測豬瘟病毒以及吳彤等[10]利用LAMP方法檢測鴨疫里默氏桿菌的研究結(jié)果一致。LAMP檢測方法的靈敏度與反應(yīng)體系和條件有較大的關(guān)系 [11-12]，因此我們對本方法的反應(yīng)體系與條件進行了優(yōu)化。在優(yōu)化過程中，我們發(fā)現(xiàn)，Mg2+濃度、Betaine濃度、內(nèi)外引物的濃度與比例以及反應(yīng)溫度對擴增效率影響較大。當Mg2+終濃度為1mmol/L或7mmol/L時對擴增效率有較明顯的抑制作用。Betaine最佳終濃度為0.4mol/L。通常LAMP的反應(yīng)溫度在60～65℃之間[8]，本研究中當反應(yīng)溫度為64℃和66℃時，產(chǎn)物熒光亮度相對較淡，而反應(yīng)溫度在58℃、60℃和62℃時熒光亮度差別不大。反應(yīng)時間分別設(shè)為45min和60min時，熒光亮度差別不大，而30min時熒光亮度明顯減弱。通過對不同引物濃度組合進行比較，確定了外引物的最佳終濃度為0.2μmol/L，內(nèi)引物的最佳終濃度為1.6μmol/L。

LAMP檢測技術(shù)的一個最大的缺點是容易出現(xiàn)假陽性，這主要是由于空氣中存在陽性核酸氣溶膠污染造成的，可以通過兩種途徑來解決這個問題：一是將反應(yīng)液配制區(qū)、擴增區(qū)和結(jié)果觀察區(qū)嚴格隔離開;二是每次檢測設(shè)置空白對照[13]。

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Abstract：An one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP） assay for detecting duck hepatitis A virus （DHAV） was established with four primers based on six conserved positions of the 3D gene. The process of assay was completed by using Bst DNA within 45 min at 60℃. The detect limit of the RT-LAMP assay was 0.1 pg of viral RNA， which was 10 times higher than RT-PCR， and no amplification was found with the samples of 4 other common duck diseases. The clinical application results showed the coincidence rate between the assay and the virus isolation and identification is 92.5%. The assay was a potential useful technique for DHAV detection in field condition.

Key Words：Duck hepatitis A virus; 3D gene; One-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification; Low requirement for instrument