2018年Cox-A6感染性手足口病住院患兒82例臨床特征和病原學(xué)分析*

麥慶鋒， 吳梓坤， 柴慧穎， 程歡， 楊笑涵， 劉攀△

1中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)檢驗(yàn)科(廣東深圳 518100)； 2廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心(廣東廣州 511400)

手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)是一種由人腸道病毒屬(human enterovirus，hEVs)A組成員引起的傳染病，常見于5歲以下兒童，主要以腸道病毒71(Enteroviruses 71，EV71)、柯薩奇病毒A16(Coxsackievirus 16A，Cox-16A)和Cox-A6感染為主。HFMD常見臨床癥狀為發(fā)熱，手、足和口腔/咽峽等部位出現(xiàn)皮疹/皰疹，部分患兒出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹和神經(jīng)源性肺水腫等重癥表現(xiàn)，嚴(yán)重者24 h內(nèi)死亡。自1957年首次報(bào)道以來，HFMD已成為全球尤其西太平洋地區(qū)的重要公共衛(wèi)生問題[1-4]。我國HFMD年發(fā)病率為(37.01～205.06)/10萬，病死率在(6.46～51.00)/10萬之間[2, 5]。隨著近年來流行趨勢增加，Cox-A6已經(jīng)成為導(dǎo)致HFMD爆發(fā)的主要病原體[6-9]。作為國家法定丙類傳染病的主要致病病毒之一，Cox-A6尚未納入《全國手足口監(jiān)測方案》的監(jiān)測型別，其感染導(dǎo)致的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)可能被低估。持續(xù)監(jiān)測Cox-A6感染的臨床和病原學(xué)特征有助于疾病防控及疫苗的研發(fā)。本研究對2018年深圳地區(qū)82例Cox-A6感染性HFMD住院患兒的臨床及病原學(xué)特征進(jìn)行分析，進(jìn)而為臨床的診治和疾病的防控提供依據(jù)和建議。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取2018年1—12月期間于中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院(光明)確診為Cox-A6感染性HFMD且住院治療的患兒82例，其中男53例，女29例，年齡1～52個月。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有納入對象均符合國家衛(wèi)生健康委員會辦公廳制定的《手足口病診療指南(2018年版)》中的判定標(biāo)準(zhǔn)[5]：急性起病，伴或不伴發(fā)熱，手、足、口腔和臀部出現(xiàn)斑丘疹、皰疹。重癥手足口伴隨中樞神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)如：精神差、嗜睡、頭痛、嘔吐、肢體抖動、肌陣攣、無力或急性弛緩性麻痹等。嚴(yán)重者主要表現(xiàn)為腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎，甚至出現(xiàn)肺水腫、肺出血和(或)循環(huán)功能障礙等。(2)均在醫(yī)院接受病毒檢測并確診為Cox-A6感染(試劑盒采用中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司生產(chǎn)的Cox-A6核酸熒光定量檢測試劑盒)；(3)均不含重大器官損傷；(4)均未接受外院治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)除Cox-A6外感染其他病毒的患兒；(2)伴隨消化道潰瘍的患兒；(3)合并嚴(yán)重感染的患兒；(4)在入院前接受過其他藥物治療的患兒；(5)臨床資料不全的患兒。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢測分析 以開始發(fā)熱為病程第1天，收集82例手足口住院患者的人口學(xué)信息、臨床癥狀和體征以及實(shí)驗(yàn)室血常規(guī)和生化常規(guī)等檢查結(jié)果。

1.2.2 Cox-A6 VP1基因擴(kuò)增和測序 系統(tǒng)留取患兒入院3 d內(nèi)的糞便標(biāo)本，嚴(yán)格按照 QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen，德國)的操作說明提取病毒RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(Quant cDNA第1鏈合成試劑盒，天根生化科技有限公司)，-20℃保存?zhèn)溆?。高保真?Q5? High-Fidelity DNA Polymerase，NEB，美國)擴(kuò)增Cox-A6陽性標(biāo)本的VP1全基因序列(915 bp)，引物參照文獻(xiàn)[7]。反應(yīng)體系：Q5? Master Mix 25 μL，上下游引物(0.5 μmol)各2.5 μL，模板5 μL，去離子水補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物，陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程股份有限公司測序。Genebank比對分析測序結(jié)果。

1.3 生物信息學(xué)分析 采用Geneious primer 2019軟件對序列進(jìn)行同源性比對分析；運(yùn)用MEGA7.0軟件中的臨近法(Neighbor-joining)和Kimura2-parameter模型構(gòu)建分子進(jìn)化樹，Bootstrap值(1 000次)評估建樹的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 患兒基本情況分析 82例Cox-A6感染性HFMD住院患兒中男53例，占64.6%。所有患兒年齡(18.6±9.8)個月，75例(91.5%)患兒<36個月，住院時間(5.6±2.6)d。81例(98.8%)患兒存在發(fā)熱，發(fā)熱時間為(2.4±1.5)d，其中熱峰>39℃占75.6%(62/82)，最高溫度達(dá)40.7℃。所有患兒(100%)均出現(xiàn)皮疹/皰疹，最常見部位為口腔/咽部(92.7%)、手(84.1%)、足(74.4%)和臀部(69.5%)；部分患兒膝蓋(25.6%)、腿部(19.5%)和背部(7.3%)也存在明顯的皮疹。見表1。

2.2 患兒臨床特征分析 與EV71和Cox-A16感染性HFMD類似，Cox-A6感染患兒也存在典型的胃腸道和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等表現(xiàn)(表1)：在82例患兒中，納差19例(23.2%)、嘔吐24例(29.3%)、腹瀉11例(13.4%)；部分病例存在神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，主要表現(xiàn)為精神差32例(39.0%)、驚厥26例(31.7%)、肢體抖動13例(15.9%)和抽搐13例(15.9%)。11例(13.4%)患兒經(jīng)臨床診斷為重癥HFMD，主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累，如精神差、嘔吐和肢體抖動等，有腦膜刺激征表現(xiàn)，伴有白細(xì)胞和血糖升高。其中7例(8.5%)患兒為病毒性腦炎，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、嘔吐和腦膜刺激征；X線顯示3例(3.7%)患兒為輕度肺水腫，表現(xiàn)為肺部局限性不規(guī)則的模糊陰影；1例患兒存在嗜睡，占1.2%。其他臨床癥狀主要包括扁桃體腫大37例(45.1%)和咳嗽45例(54.9%)。所有患兒住院治療后無后遺癥發(fā)生，無死亡病例出現(xiàn)。

表1 深圳地區(qū)82例Cox-A6感染性手足口病患者臨床特征分析

2.3 患兒實(shí)驗(yàn)室資料分析 82例患兒入院1～2 d內(nèi)均進(jìn)行了血常規(guī)和生化常規(guī)檢測(表2)。血常規(guī)結(jié)果顯示69例(84.1%)患兒WBC計(jì)數(shù)高于正常參考范圍，均值為(15.2±6.2)×109·L-1，以中性粒細(xì)胞(NEUT)和淋巴細(xì)胞(LY)增高為主，34例患兒(41.5%)出現(xiàn)血小板增高。此外，80例患兒進(jìn)行超敏CRP(hs-CRP)的測定，46例(57.5%)超出正常參考范圍。生化常規(guī)提示部分患兒存在心肌酶異常：AST升高42例(51.2%)，LDH升高55例(67.1%)，CK-MB升高36例(43.9%)。ALT、UA、CR和CK等升高不顯著或未見異常。

2.4 VP1分子進(jìn)化樹分析 本研究隨機(jī)選取12株Cox-A6毒株測序，與GeneBank數(shù)據(jù)庫中118株參考序列構(gòu)建分子進(jìn)化樹(圖1)。結(jié)果顯示：本次調(diào)查的12株Cox-A6(SZ/CHN/2018/01～SZ/CHN/2018/12)高度同源，VP1區(qū)核苷酸(nt)和氨基酸(aa)的同源性分別為93.9%～99.9%和99.0%～100%，與Cox-A6參考序列Gdula株(Genbank號：AY421764)的同源性分別為82.7%～83.8% nt和95.8%～96.4% aa；其中9株Cox-A6高度同源且聚集成簇(同源性：99.34%～100% nt和99.02%～100% aa)，與2017年云南LC413165.1和廣東MG385820.1、MH018543.1分離株高度同源(核苷酸同源性分別為98.47%～99.45%、98.03%～99.03%和97.60%～98.58%)；其余3株分別與2017年廣東MG385761、2016年上海KY972297、廣東MG385783.1和MG385785.1參考株高度同源(核苷酸同源性分別為98.14%、96.17%、99.13%和99.56%)。

表2深圳地區(qū)82例Cox-A6感染性手足口病患兒實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果分析

項(xiàng)目參考范圍均值±標(biāo)準(zhǔn)差升高例數(shù)陽性率(%)hs-CRP(mg/L)?0～1021.4±24.54657.5WBC(×109·L-1)3.5～9.515.2±6.26984.1NEUT(×109·L-1)1.8～6.39.5±5.46073.2LY(×109·L-1)1.1～3.25.3±2.66579.3PLT(×109·L-1)125～350354.3±101.43441.5ALT(U/L)9～5029.7±21.278.5UR(mmol/L)3.1～8.03.8±3.611.2CR(μmol/L)25～10024.9±8.000UA(μmol/L)208～428291.6±101.889.8AST(U/L)15～4043.3±13.34251.2LDH(U/L)100～380586.7±240.45567.1CK(U/L)50～310117.1±60.300CK-MB(U/L)0～2529.0±18.33643.9

*82例Cox-A6感染性手足口病患兒中的2例未進(jìn)行hs-CRP測定

3 討論

近年來，Cox-A6逐漸成為導(dǎo)致手足口病爆發(fā)的主要病原體，尤其是2017年，Cox-A6占廣東地區(qū)HFMD感染總數(shù)的69.2%[6]。Cox-A6感染性HFMD爆發(fā)式增長，是HFMD防控的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。目前尚無有效治療HFMD的手段，臨床癥狀體征、實(shí)驗(yàn)室輔助檢測及病毒分型是醫(yī)生判斷病毒致病性和對癥治療降低患兒發(fā)生重癥HFMD的關(guān)鍵。此外，由于基因突變和同源重組導(dǎo)致Cox-A6亞型的多樣性，以致于不同地區(qū)存在一種或多種優(yōu)勢流行毒株[10]。因此，分子流行病學(xué)監(jiān)測對Cox-A6感染的防控、疫苗和抗病毒藥物的研發(fā)至關(guān)重要。

采用臨近法(Neighbor-joining)構(gòu)建Cox-A6 VP1區(qū)的全基因進(jìn)化樹。其中SZ/CHN/2018/01-SZ/CHN/2018/12代表本研究測序的12株Cox-A6代表株，AY421764/Gdula代表Cox-A6標(biāo)準(zhǔn)株，其他118例參考株序列均來自Genbank數(shù)據(jù)庫

圖1Cox-A6衣殼蛋白VP1區(qū)(915bp)系統(tǒng)發(fā)育樹

早期Cox-A6感染主要導(dǎo)致皰疹性咽峽炎(herpangina，HA)，以發(fā)熱、咽峽皰疹為主要臨床表現(xiàn)[11-12]。但近年來，Cox-A6感染患兒病程早期即出現(xiàn)皮疹。本研究顯示，82例Cox-A6感染性HFMD患兒，均出現(xiàn)廣泛性皮疹(大小從1～3 mm)，伴有或不伴有瘀斑，主要分布主要見于口腔、手足和臀部。廣泛的皮膚受累提示Cox-A6可直接感染表皮細(xì)胞，導(dǎo)致其接觸性傳播的風(fēng)險(xiǎn)增大，這一發(fā)現(xiàn)與之前的研究[6,8,13-14]一致。與EV-71等型別相比，Cox-A6住院患兒偏小，3歲以內(nèi)占91.5%(75/82)，其原因可能與患兒年齡小、免疫系統(tǒng)不完善和病毒變異[15]。另外，男性患兒占64.6%，明顯高于女性，可能與性別導(dǎo)致的手足口基因易感性有關(guān)[15]。幾乎所有患兒出現(xiàn)明顯發(fā)熱癥狀，且以39℃或以上高熱為主，熱峰較EV71和Cox-A6所致HFMD高，這提示臨床需及時監(jiān)測患兒體溫并采取適當(dāng)?shù)慕禍卮胧苊飧邿釋?dǎo)致患兒不良情況發(fā)生。

大多數(shù)HFMD癥狀輕微，幾天內(nèi)恢復(fù)正常，只有部分重癥患兒會出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，這在EV71感染性HFMD中尤為明顯[16]。而本研究中，13.4%(11/82)的患兒被確診為重癥HFMD，主要臨床表現(xiàn)為抖動、驚跳、抽搐、精神差等。3例患兒合并神經(jīng)源性肺水腫，這提示Cox-A6可能會透過血腦屏障，造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷，該合并癥報(bào)道較少[7-8, 14]，需要腦脊液的病毒學(xué)檢測予以證實(shí)。這證實(shí)2018年深圳地區(qū)流行的Cox-A6可以透過血腦屏障從而損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有較強(qiáng)的致病性，其原因可能與CoxV-A6感染患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不完全和病毒的變異有關(guān)[16]，也提示對HFMD中Cox-A6感染監(jiān)測的重要性。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果顯示患兒除了hs-CRP、WBC和PLT增高外，AST和CK-MB也出現(xiàn)增高，這提示部分Cox-A6患兒可能存在心肌損傷。

腸道病毒VP1為最重要的抗原決定簇，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生型特異性抗體，因此被作為區(qū)分腸道病毒型別的主要基因[1]。由于抗原漂移和基因重組，Cox-A6進(jìn)一步分為6個亞群(A～D、E1、E2)，目前E2已成為優(yōu)勢流行亞群[6-7]。本研究基于系統(tǒng)發(fā)育樹首次分析了2018年深圳地區(qū)Cox-A6 VP1基因，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)主要以E2亞型流行為主，除了其中1株與2016年上海KY972297參考株高度同源外，其他的均與2017年云南、廣東和廣西等地分離的病毒具有高度同源性。這表明Cox-A6 E2譜系在我國南部地區(qū)持續(xù)循環(huán)和進(jìn)化，而不是局限在部分地區(qū)流行，提示除了監(jiān)測原有EV71和Cox-A16外，開展Cox-A6的流行監(jiān)測和病原學(xué)研究對HFMD的防控具有十分重要的意義。

綜上所述，本研究首次通過對2018年Cox-A6感染性HFMD住院患兒的臨床和實(shí)驗(yàn)室特征分析，發(fā)現(xiàn)Cox-A6感染性HFMD患兒年齡小，以男性為主，臨床癥狀以高熱、皮疹、咳嗽、扁桃體腫大、納差、嘔吐為主，13.4%被確診為重癥HFMD，其中3例出現(xiàn)存在肺水腫等嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。實(shí)驗(yàn)室資料顯示患兒除了WBC、PLT和hs-CRP增高外，還存在心肌損傷表現(xiàn)。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示2018年深圳地區(qū)Cox-A6屬于E2亞型并在中國南部地區(qū)持續(xù)循環(huán)和進(jìn)化。因此，加強(qiáng)對Cox-A6臨床癥狀的監(jiān)測、對其開展分子病原學(xué)的研究和完善Cox-A6感染性HFMD監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)對于疾病的預(yù)防和控制具有十分重要的意義。