Box-Behnken法優(yōu)化大葉櫸樹黃酮類超聲輔助提取方法及初步鑒定

劉曉玲，金曉玲,2，張旻桓，張亞平,3，曾 艷，柴弋霞

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省環(huán)境資源植物開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410000；3.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 551400）

大葉櫸樹Zelkova schneideriana秋葉顏色豐富，五彩繽紛，是營(yíng)造園林秋景的鄉(xiāng)土樹種[1]。對(duì)大葉櫸樹秋季葉色成色原理的研究，主要集中在葉綠素、類胡蘿卜素和花青苷的含量和變化規(guī)律上，少有涉及除花青苷外的其他黃酮類物質(zhì)[2-3]。但黃酮類作為植物體內(nèi)重要的次生代謝物質(zhì)，在植物葉片成色上起著重要作用。如‘北陸’Vaccinium corymbosum×V.angustifolium葉片變紅與黃酮醇含量顯著相關(guān)；蘆丁等單體酚是三葉海棠Malus sieboldii葉片成色的主要輔色素[4-5]。這些研究表明，除花青苷外，大葉櫸樹葉片成色或還與其余的黃酮類物質(zhì)密切相關(guān)。

然而，要對(duì)大葉櫸樹黃酮類深入研究，必須獲得其提取方法。現(xiàn)有研究中，Box-Behnken法具有可減少實(shí)驗(yàn)組數(shù)、縮短試驗(yàn)周期、能求得高精度回歸模型、還能通過(guò)響應(yīng)面圖反映因素之間的交互作用等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為比傳統(tǒng)的單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)更精準(zhǔn)可靠[6-7]，已在串葉松香草Silphium perfolialum，黃秋葵Abelmoschu sesculentus，落花生Arachishy pogaea以及艾Artemisia argyi等植物的黃酮類物質(zhì)提取中得到了很好的應(yīng)用[8-11]。

因此通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選大葉櫸樹葉片黃酮類提取的最優(yōu)條件，并通過(guò)顯色反應(yīng)初步確定大葉櫸樹葉片中的黃酮類物質(zhì)的種類，為之后進(jìn)一步研究大葉櫸樹葉片黃酮類與成色之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2017年8月26日，在湖南長(zhǎng)沙南方林業(yè)生態(tài)應(yīng)用技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室溫室，隨機(jī)采摘27株1年生大葉櫸樹嫁接苗，取每株中部成熟葉片1～3片。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大葉櫸樹葉片黃酮類提取流程 提取的基本流程：大葉櫸樹葉片→去除葉中脈與鋸齒→液氮研磨→-20℃凍干粉末→超聲波（180 W，40 KHz）下乙醇提取→10 000 r·min-1離心（TGL-20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)）→上清液→測(cè)定黃酮類提取量。

1.2.2 黃酮類提取量的測(cè)定方法 采用鋁鹽顯色法[12]，橫坐標(biāo)為槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為測(cè)定的吸光度值，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.098 4X+0.020 6（R2=0.996 1）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大葉櫸樹葉片提取液黃酮類濃度后，提取量根據(jù)如下計(jì)算公式求得：

式中，P表示黃酮類提取量（mg·g-1）；c表示提取液黃酮類濃度（mg·mL-1）；V表示提取液體積（mL）；m表示凍干粉末質(zhì)量（g）。

1.2.3 大葉櫸樹葉片黃酮類提取的單因素試驗(yàn) 以黃酮類提取量為因變量，超聲波功率固定為180 W，頻率為40 KHz，乙醇濃度、液料比、超聲時(shí)間3個(gè)因素分別以60%，20:1mL·g-1，2 h為基礎(chǔ)，依次改變其中1個(gè)因素進(jìn)行大葉櫸樹葉片黃酮類提取試驗(yàn)（試驗(yàn)平行數(shù)為3，下同）。每個(gè)因素設(shè)置7個(gè)水平梯度：乙醇濃度范圍30%～90%，梯度間隔10%；液料比范圍5:1～35:1mL·g-1，梯度間隔5:1；超聲時(shí)間范圍0.5～3.5 h，梯度間隔0.5 h。分析不同梯度對(duì)大葉櫸樹葉片黃酮類提取量的影響。按照1.2.1的方法獲得大葉櫸樹葉片黃酮類提取液，根據(jù)1.2.2的方法計(jì)算黃酮類提取量。

1.2.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素優(yōu)選出3個(gè)水平，乙醇濃度（A）為：50%，60%，70%；液料比（B）為：25:1，30:1，35:1mL·g-1；超聲時(shí)間（C）為：1.0，1.5，2.0 h，以大葉櫸樹葉片黃酮類提取量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken的中心組合方案（表1）。

1.2.5 大葉櫸樹葉片黃酮類物質(zhì)的初步鑒定 根據(jù)Box-Behnken的最佳提取方案獲得提取液，通過(guò)顯色反應(yīng)對(duì)黃酮類物質(zhì)進(jìn)行初步鑒定，試驗(yàn)方法參照參考文獻(xiàn)13。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2007，SPSS 19和Design-Expert.V8.0.6，作圖采用Origin 8.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 單個(gè)因素對(duì)黃酮類物質(zhì)提取量的影響

2.1.1 乙醇濃度對(duì)黃酮類提取量的影響 乙醇濃度對(duì)大葉櫸樹葉片黃酮類提取量的影響顯著（P＜0.05，下同）（圖1）。隨著乙醇濃度的升高，黃酮類提取量呈先增大后減少的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，提取量最大30.39mg·g-1，而在60%～90%時(shí)顯著減少。根據(jù)實(shí)驗(yàn)，選取60%乙醇作為大葉櫸樹葉片黃酮類提取的最佳濃度值。

2.1.2 液料比對(duì)黃酮類提取量的影響 從圖1可知，液料比對(duì)大葉櫸樹葉片黃酮類提取量有顯著的影響。隨著液料比增大，黃酮類提取量呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，當(dāng)液料比為 30:1mL·g-1時(shí)，提取量最大 29.75mg·g-1。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黃酮類提取量的影響 提取時(shí)間與大葉櫸樹葉片黃酮類提取量的相互關(guān)系見圖1。隨著提取時(shí)間的增加，大葉櫸樹葉片中黃酮類的提取量先增大而后減少，在1.5 h時(shí)，提取量最大24.09mg·g-1。超過(guò)1.5 h后，提取量反而下降，因此選擇1.5 h為超聲處理最佳時(shí)間。

圖1 乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間對(duì)大葉櫸樹葉片黃酮類提取量的影響Figure1 Effect of ethanol concentration,liquid ratio and extracting time on flavonoid yield from Z.schneideriana leaves

2.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)提取方法的優(yōu)化

2.2.1 大葉櫸樹葉片黃酮類提取的回歸模型 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，對(duì)A（50%，60%，70%），B（25:1，30:1，35:1）mL·g-1，C（1.0，1.5，2.0 h）這3個(gè)因素及對(duì)應(yīng)的水平，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及效應(yīng)值Table1 Box-Behnken design and effect

根據(jù)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到大葉櫸樹葉片黃酮類提取的回歸模型為：

y=30.54+1.48A+1.39B+2.22C-0.54AB-0.25AC-0.26BC-2.36A2-3.50B2-2.19C2。

2.2.2 回歸模型方差分析 對(duì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

由表2可知，該回歸模型差異顯著（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)R2=0.921 9。表明92.19%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以用該模型進(jìn)行解釋，證明預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值有較高的相關(guān)性。失擬項(xiàng)P值0.217 2＞0.05，差異不顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)誤差小。因此，該模型對(duì)于大葉櫸樹葉片黃酮類提取量實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度。

表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Figure2 ANOVA on experiment result

2.2.3 Box-Behnken的優(yōu)化結(jié)果 圖2a為提取大葉櫸樹葉片黃酮類物質(zhì)的乙醇濃度與液料比響應(yīng)面圖，圖2b為乙醇濃度與提取時(shí)間響應(yīng)面圖，圖2c為液料比與提取時(shí)間的響應(yīng)面圖。響應(yīng)面圖開口向下，表明各因素作用增大時(shí)，響應(yīng)面值增大，達(dá)到最高點(diǎn)后，各因素作用增大，響應(yīng)面值減小。由圖2可以得出，3個(gè)因素兩兩之間形成的響應(yīng)面圖開口均向下，說(shuō)明其對(duì)提取率的影響都是先增大后減少。

圖2 各因素之間響應(yīng)面圖Figure2 The response surface between various factors

圖3a為提取大葉櫸樹葉片黃酮類物質(zhì)的乙醇濃度與液料比等值線圖，圖3b為乙醇濃度與提取時(shí)間等值線圖，圖3c為液料比與提取時(shí)間的等值線圖。等值線圖從圓到扁的變化，表示兩個(gè)因子之間相互關(guān)系從弱到強(qiáng)程度，越扁表示兩因素交互影響越強(qiáng)。由圖3中等值線形狀可見，兩兩因素之間的交互作用對(duì)大葉櫸樹黃酮類提取量的影響次序是：乙醇濃度與液料比＞乙醇濃度與提取時(shí)間＞液料比與提取時(shí)間。

2.2.4 最佳提取方法的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)二次線性回歸模型得出，大葉櫸樹葉片黃酮類提取的最優(yōu)條件為：乙醇濃度62.7%，液料比30.8:1mL·g-1，提取時(shí)間1.74 h，黃酮類的預(yù)測(cè)提取量為31.383 mL·g-1，但考慮實(shí)際可操作性，確定大葉櫸樹葉片黃酮類的提取方法為：乙醇濃度63%，液料比31:1mL·g-1，提取時(shí)間1.7 h，根據(jù)此條件，設(shè)置平行數(shù)為6的重復(fù)試驗(yàn)，得到大葉櫸樹葉片黃酮類的提取量平均值為（31.067±0.11)mL·g-1，與模型所預(yù)測(cè)的基本一致，說(shuō)明模型能較好預(yù)測(cè)實(shí)際值。

圖3 各因素之間等值線圖Figure3 The contour between the factors

2.3 大葉櫸樹葉片黃酮類物質(zhì)提取液的初步鑒定

用簡(jiǎn)單的顯色反應(yīng)可以初步鑒定大葉櫸樹葉片提取物中黃酮類物質(zhì)的存在，參照對(duì)野生百合Lilium brownievar.viridulum顯色反應(yīng)對(duì)應(yīng)的結(jié)果分析[13]，大葉櫸樹葉片提取液通過(guò)濃鹽酸-鋅粉反應(yīng)，溶液呈現(xiàn)紫紅色，說(shuō)明大葉櫸樹葉片中可能含有黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物；大葉櫸樹提取液與三氯化鋁反應(yīng)，呈現(xiàn)淡黃色，表明存在黃酮；與醋酸鉛反應(yīng)，出現(xiàn)黃色沉淀，說(shuō)明具有鄰二酚羥基或兼有3-OH，4=O或5-OH，4=O的化合物，大葉櫸樹黃酮類提取液中不含查耳酮和橙酮；與氨性氯化鍶反應(yīng)產(chǎn)生黃棕沉淀，意味著色素分子中有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物。與硼酸反應(yīng)，顏色變化不明顯，說(shuō)明大葉櫸樹葉片含有少量或不含5’-羥基黃酮及2’-羥基査爾酮。

3 結(jié)論與討論

優(yōu)化后大葉櫸樹黃酮類提取方法為：乙醇濃度63%，液料比31:1mL·g-1，提取時(shí)間1.7 h，提取量為（31.067±0.11)mL·g-1；3個(gè)因素中，乙醇濃度與液料比之間的交互作用最強(qiáng)。通過(guò)對(duì)大葉櫸樹葉片黃酮類提取液的顯色鑒定，其成分含有黃酮、具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物以及具有鄰二苯酚羥基或兼有3-OH，4=O或5-OH，4=O的化合物；可能有黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇等；不含查爾酮和橙酮。

為了更有效的提取植物組織中的黃酮類物質(zhì)，可采取多種措施。如物理方式：超聲波、微波等[14-15]；生物方式：添加果膠酶、纖維素酶等[16-18]，可以加速物質(zhì)運(yùn)動(dòng)或破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使黃酮類物質(zhì)更好的溶于提取液中。已有研究表明，使用微波輔助，能更有效提取辣木Moringaoleifera葉中黃酮類[19]；在提取香椿Toonasinensis老葉中的黃酮類時(shí)，纖維素酶的添加可提高提取量[20]。在本實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)階段發(fā)現(xiàn)，超聲波作用0.5 h，大葉櫸樹黃酮類提取量顯著高于常溫浸提24 h，說(shuō)明采用超聲波輔助提取大葉櫸樹黃酮類物質(zhì)，是理想的措施。

在實(shí)驗(yàn)的3個(gè)因素中，對(duì)于大葉櫸樹黃酮類提取量，乙醇濃度與液料比之間的交互影響最大?？赡懿煌瑵舛纫掖嫉臉O性不同，在乙醇溶液極性與大葉櫸樹黃酮類最接近時(shí)，黃酮類溶解度大，獲得的提取量高，當(dāng)乙醇濃度增大時(shí)，大葉櫸樹葉片黃酮類提取量下降，這除提取液極性減小，相溶性減弱外，葉片中質(zhì)體色素、非黃酮類醇溶性物質(zhì)等也會(huì)析出溶于溶液，影響黃酮類的提取；而在液料比比值較高時(shí)，大葉櫸樹葉片材料中黃酮類少，溶劑量多，同樣非黃酮類的醇溶性物質(zhì)會(huì)溶出，使提取量降低[21]。兩個(gè)因素在導(dǎo)致提取量降低上有共同成因，所以在大葉櫸樹葉片黃酮類提取中，這兩者交互作用最強(qiáng)。

黃酮類物質(zhì)多達(dá)幾千種[22]，確定植物葉片中具體存在的黃酮類物質(zhì)種類有一定困難。目前，有關(guān)大葉櫸樹葉片黃酮類具體種類的報(bào)道鮮見，若直接采用高效液相色譜（HPLC）和色-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）等方法，在標(biāo)準(zhǔn)品的選擇、時(shí)間程序的確立上，耗時(shí)久，費(fèi)用高[23]。通過(guò)本研究中系列顯色反應(yīng)，高效便捷的篩選出大葉櫸樹葉片中含有黃酮和具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，并可排除查爾酮和橙酮，既縮短了時(shí)間，又節(jié)省了經(jīng)費(fèi)，也為后期深入研究其中具體物質(zhì)指明了方向。