間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體在缺血性腦卒中的研究進(jìn)展

(1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽 421000；2.益陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 益陽 413000)

目前，腦卒中已成為全世界第二位死亡原因及主要致殘疾原因，缺血性腦卒中是最主要的類型[1]。目前有效治療方法有靜脈溶栓、血管內(nèi)治療及卒中單元中的常規(guī)管理方法，但受時(shí)間窗限制，只有少部分病人能得到有效救治。因此，探尋安全、高效新療法成為目前腦卒中治療研究熱點(diǎn)。多項(xiàng)證據(jù)表明，干細(xì)胞移植可以作為一種替代傳統(tǒng)藥物的腦卒中治療方法，而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因其獨(dú)特分化及衍生能力，成為干細(xì)胞移植治療的首選細(xì)胞。最新研究發(fā)現(xiàn)，旁分泌機(jī)制可能是MSCs細(xì)胞移植治療腦卒中最重要的作用機(jī)制。在MSCs的眾多衍生分泌物中，外泌體(exosomes)已經(jīng)引起了人們廣泛的研究興趣。研究發(fā)現(xiàn)MSCs分泌的外泌體可以穿透血腦屏障到達(dá)大腦受損部位，且內(nèi)含的多種生物因子可以促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)及血管重塑[2]?；谠偕t(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，外泌體因其在體內(nèi)存在的廣泛性及獲取的便捷性等特性，已成為許多疾病診斷治療的可能方式，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)及再生醫(yī)學(xué)均具有廣大前景。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體概述

MSCs能夠分泌多種均勻大小的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，包括外泌體和微泡(microvesicles,MV)，這些EVs均攜帶有獨(dú)特的膜脂質(zhì)結(jié)合配體、蛋白質(zhì)及RNAs。并且參與細(xì)胞之間傳遞、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及在體內(nèi)通過短距離或長距離遷移來改變細(xì)胞或組織代謝，影響細(xì)胞或組織對損傷、感染和疾病的應(yīng)激反應(yīng)[3]。在過去10年中，外泌體已成為細(xì)胞間信息傳導(dǎo)的重要媒介，其在腫瘤、感染性疾病及神經(jīng)變性疾病等多種疾病中的生理病理作用被廣泛研究。通過基因修飾工程修飾外泌體的內(nèi)含生物信息，挖掘治療干預(yù)疾病的潛在新靶點(diǎn)以及大分子藥物新型定向傳遞方式已成為如今外泌體領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

MSCs衍生的外泌體是一種大小約為30～100 nm脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，具備類似于MSCs的許多特性，攜帶有多種細(xì)胞因子、生長因子、脂質(zhì)信號(hào)、mRNA和調(diào)節(jié)miRNA，在組織愈合、炎癥、免疫調(diào)節(jié)及抑制纖維化等過程中發(fā)揮效應(yīng)[4]。目前，與已知產(chǎn)生外泌體的其他細(xì)胞相比，MSCs是外泌體相對衍生量最多的一類細(xì)胞。且永生化MSCs不影響所分泌外泌體的質(zhì)量與數(shù)量[5]。MSCs源性外泌體因其與來源細(xì)胞的相似生物功能特性及良好的生物相容性，在無細(xì)胞治療再生醫(yī)學(xué)方面及藥物治療載體方面有著巨大優(yōu)勢。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體的分離與提取

MSCs源性外泌體的分離與提取通常在實(shí)驗(yàn)室條件下完成，對于目前外泌體提取的方法學(xué)研究也一直是外泌體領(lǐng)域的重點(diǎn)。MSCs源性外泌體的提取方式與其他細(xì)胞來源外泌體提取方式類似，分為傳統(tǒng)的高通量方法，如超速離心法、梯度離心法、共沉淀法、尺寸排阻色譜、場流分級(jí)法；較為新穎方法有微流控法、非接觸法、免疫吸附法[6]。由于外泌體與其他MV有著類似結(jié)構(gòu)、密度及其他生物物理學(xué)特性，為獲得純度更高的外泌體，目前大部分較為權(quán)威外泌體實(shí)驗(yàn)研究均采用超速離心法或蔗糖密度梯度超速離心法提取外泌體。外泌體的提取與分離成本高，且產(chǎn)量較低，難以滿足一次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用量要求。因此如何簡化提取分離高純度外泌體過程，是外泌體提取方法改進(jìn)的難點(diǎn)。

與永生化腫瘤細(xì)胞系不同，MSCs的擴(kuò)增能力有限，其一次外泌體產(chǎn)量難以滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需求，而MSCs源性外泌體大規(guī)模獲取仍有一定難度。有研究者用mys轉(zhuǎn)染MSCs使其永生化，而未改變MSCs外泌體產(chǎn)的數(shù)量與性質(zhì)[5]。此外，通過改變來源細(xì)胞的培養(yǎng)微環(huán)境，也能一定程度上影響外泌體的量與活性。Haraszti RA等[7]通過結(jié)合MSCs微載體的三維(3D)細(xì)胞培養(yǎng)及MSCs外泌體正切流動(dòng)過濾(tangential flow filtration,TFF)提取優(yōu)勢，并比較了來自2D與3D培養(yǎng)物的外泌體物理化學(xué)特性，以及由差異超速離心與TFF產(chǎn)生的外泌體的物理化學(xué)特征，結(jié)果表明，3D培養(yǎng)結(jié)合TFF可將MSCs源性外泌體的產(chǎn)量提高140倍,且這些外泌體在治療性小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)移至原代神經(jīng)元的活性提高了7倍。這些高效、大量的MSCs外泌體分離提取方法將極大地促進(jìn)外泌體無細(xì)胞療法向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的可能性。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體在缺血性腦卒中的應(yīng)用與機(jī)制

缺血性腦卒中后的恢復(fù)基于受損部位的神經(jīng)突觸可塑性及新血管生成，神經(jīng)突觸的可塑性是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立和維持正常信息傳導(dǎo)的核心。當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)，大腦皮質(zhì)會(huì)發(fā)生一系列神經(jīng)突觸重塑，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞被激活，分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，參與新生血管的形成[8]，然而，大腦自我修復(fù)程度有限，不能達(dá)到臨床滿意效果。但大腦的這種自我重塑能力為使用外源性干預(yù)治療措施提供了可能性。

基于MSCs的細(xì)胞療法已經(jīng)得到廣泛研究者的證實(shí)，甚至得到了許多臨床數(shù)據(jù)的支持。盡管MSCs介導(dǎo)的修復(fù)效應(yīng)機(jī)制不完全明了，既往證據(jù)表明，MSCs可能通過線粒體轉(zhuǎn)移、旁分泌和直接分化為神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮損傷修復(fù)作用[9]。最新研究認(rèn)為，MSCs移植治療缺血性腦卒中并不需要細(xì)胞遷移至腦損區(qū)域，MSCs可能主要通過分泌攜帶有一定生物信息的外泌體來發(fā)揮內(nèi)源性修復(fù)作用。此外，在缺血性腦卒中發(fā)生后，外泌體也可在腦細(xì)胞中合成與釋放，通過血腦屏障，并且可在外周血或腦脊液中被檢測到[10]。外泌體本身不具備分化能力，且具備良好的生物相容性，幾乎不會(huì)被機(jī)體免疫機(jī)制清除。因此，基于MSCs源性外泌體移植的無細(xì)胞治療擺脫了細(xì)胞移植療法的排異性及致瘤性短板，為無細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中的再生醫(yī)學(xué)帶來了一道新的曙光。見圖1。

3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體促進(jìn)神經(jīng)修護(hù)

越來越多的研究表明，microRNAs是新血管生成調(diào)節(jié)的重要決定因素，也是中風(fēng)發(fā)病機(jī)制的重要因素。下調(diào)局灶性腦缺血小鼠模型中miRNA-15a(miR-15a-)能增加內(nèi)皮生長因子水平，VEGF在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面與其受體(VEGFR-1或-2)結(jié)合可激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶，并觸發(fā)促進(jìn)血管生成的多種下游信號(hào)(PI3K/Akt及MEK/ERK信號(hào)通路)[11]。Shabbir A等[12]將被PKH26標(biāo)記的三組不同劑量MSCs源性外泌體與定量人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞共孵育6 h，結(jié)果顯示MSCs源性外泌體可在體外誘導(dǎo)人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞的管狀分化，形成新生血管雛形，且新生血管形成數(shù)量及長度與MSCs源性外泌體劑量相關(guān)。Chen KH等[13]的研究還表明靜脈移植脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體能明顯縮小急性缺血性卒中后梗死體積以及對梗死部位具有神經(jīng)保護(hù)作用，而Doeppner T等[14]通過直接對比MSCs細(xì)胞、MSCs源性外泌體與生理鹽水移植治療缺血性腦卒中大鼠有效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSCs外泌體能增加缺血紋狀體部位神經(jīng)元密度及促進(jìn)缺血后血管生成，其療效持續(xù)時(shí)間與MSCs細(xì)胞移植組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示MSCs源性外泌體可誘導(dǎo)缺血后的長期神經(jīng)保護(hù)作用。

圖1 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體改善腦卒中可能機(jī)制簡圖注：MSC-EXO：間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體；Immune cell：免疫細(xì)胞；Vascular endothelial cell：血管內(nèi)皮細(xì)胞；Neurons：神經(jīng)元細(xì)胞

MSCs能分泌多種神經(jīng)因子來刺激內(nèi)源性腦修復(fù)過程，主要分泌的神經(jīng)因子包括：肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、VEGF、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF,FGF-2)、胰島素生長因子1(insulin growth factor-1，IGF-1)等[15-16]。由于MSCs外泌體結(jié)構(gòu)的特殊性，可以將MSCs源性外泌體進(jìn)行基因工程修飾，使MSCs源性外泌體中包含特定種類及特定量的細(xì)胞因子或含有特殊小分子或大分子藥物，通過靜脈移植或定向移植入腦受損部位，大大增加其神經(jīng)修護(hù)效果。Xin H等[3,17-18]發(fā)現(xiàn)，通過將MSCs源性外泌體經(jīng)靜脈移植給藥至大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠模型后，實(shí)驗(yàn)組缺血部位神經(jīng)恢復(fù)加速，并刺激正常組織和缺血組織之間邊界區(qū)的軸突密度增加及血管生成。同組實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)基因工程誘導(dǎo)后過表達(dá)miR-133b的MSCs源性外泌體(MSCs_miR-133b+)移植組增強(qiáng)了卒中大鼠中神經(jīng)功能的恢復(fù)，而基因敲除miR-133b的MSCs源性外泌體(MSCs_miR-133b-)移植組無明顯神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象。同時(shí)，他們在反向驗(yàn)證過程中發(fā)現(xiàn)，MSCs_miR-133b+移植組缺血邊界區(qū)內(nèi)結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)(miR_133b的靶標(biāo))的表達(dá)顯著降低，而MSCs_miR-133b-移植組CTGF表達(dá)保持不變。最終得出結(jié)論，MSCs外泌體的miR-133b參與介導(dǎo)缺血性卒中的神經(jīng)功能恢復(fù)。在同研究組的另一項(xiàng)研究中，他們還證明了MSCs衍生的外泌體可以自主遷移至鄰近細(xì)胞。MSCs外泌體包含的miRNA遠(yuǎn)不止一種。隨著研究的深入，越來越多mRNA被發(fā)現(xiàn)與腦卒中神經(jīng)功能恢復(fù)相關(guān)，Xin H等[19]最新研究表明，用高表達(dá)miR-17-92 MSCs源性外泌體治療缺血性腦卒中可增加卒中后的神經(jīng)可塑性和功能恢復(fù)，其可能機(jī)制是通過靶向抑制PTEN(經(jīng)驗(yàn)證的miR-17-92簇靶基因)激活PI3K/Akt/mTOR/GSK-3β信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮作用。

3.2 MSCs外泌體調(diào)節(jié)免疫炎性反應(yīng)

當(dāng)血管壁內(nèi)或周圍發(fā)生的異常免疫炎性反應(yīng)可促進(jìn)血栓的形成，最終導(dǎo)致腦卒中的發(fā)生。且免疫炎性反應(yīng)可以促進(jìn)腦卒中的進(jìn)展，其中多種淋巴細(xì)胞及其衍生的蛋白質(zhì)分子是導(dǎo)致梗死范圍擴(kuò)大的重要原因。因此，探索免疫干預(yù)也為治療急性缺血性腦卒中提供可能性。

相對于MSCs而言，其來源的外泌體分子量小，且其囊泡性質(zhì)使得其移植免疫排斥及其微小。Doeppner TR等[14]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過對比假手術(shù)組與MSCs外泌體移植治療MACO大鼠組外周白細(xì)胞亞群及淋巴細(xì)胞亞群總數(shù)，后者外周血中B細(xì)胞，NK細(xì)胞、T細(xì)胞減少及樹突狀細(xì)胞的活化增加，提示MSCs源性外泌體能夠調(diào)節(jié)局灶性缺血對外周血系統(tǒng)的細(xì)胞組成及其細(xì)胞活化狀態(tài)，并能一定程度逆轉(zhuǎn)腦卒中后誘導(dǎo)的外周免疫抑制。在Chen等[13]的研究中表明，MSCs外泌體能顯著降低梗死部位基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、IL-1β、TNFα、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，RANTES)、NF-κB、CD11和CD68等炎性反應(yīng)因子，提示MSCs源性外泌體抑制了缺血部位的免疫炎性反應(yīng)。

4 小結(jié)與展望

MSCs移植治療腦卒中的有效性得到許多動(dòng)物研究甚至臨床研究的驗(yàn)證，但MSCs的致瘤性及低存活率在一定程度上限制了MSCs的治療空間。而MSCs分泌的外泌體因其微小的納米尺寸及脂質(zhì)外層結(jié)構(gòu)，可作為天然的生物信息及藥物載體，其獨(dú)特的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)能有效保護(hù)其內(nèi)在生物信息的穩(wěn)定，避免在遷移的過程中被分解，其微小納米尺寸可允許外泌體直接穿過血腦屏障，誘導(dǎo)其在梗死區(qū)發(fā)揮作用，且避免免疫排斥反應(yīng)和微小毛細(xì)血管的阻塞。

現(xiàn)已證明MSCs外泌體所含的多種miRNA參與多種疾病的生理調(diào)節(jié)及損傷組織修復(fù)，其中不僅僅包括缺血性腦卒中，還包括缺血性心肌梗死、肝纖維化、腫瘤等疾病，然而其基本的分子機(jī)制與具體miRNA靶點(diǎn)信息特征并不完全清楚[20]。基于MSCs源性外泌體所含miRNA多樣性，在探索驗(yàn)證與缺血性腦卒中修復(fù)信息相關(guān)miRNA后，可以直接基因誘導(dǎo)編輯MSCs源性外泌體所含生物信息，高表達(dá)某種生物修復(fù)因子或敲除某一基因，靜脈輸注移植或定點(diǎn)移植入梗死區(qū)域，改善缺血性腦卒中癥狀或?qū)⑵渥鳛槿芩ê筝o助治療的一種可能方式。目前對于MSCs外泌體移植治療缺血性腦卒中仍處于起步階段，其臨床應(yīng)用也許還需很長時(shí)間的研究，但MSCs源性外泌體在其他學(xué)科基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用研究中的不斷突破給腦血管病新治療療法奠定了基礎(chǔ)。