HPV疫苗在預(yù)防宮頸癌領(lǐng)域的專利技術(shù)綜述

冷千里

【摘 要】宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位于女性腫瘤的第二位。預(yù)防HPV感染的最有效方式是使用HPV疫苗，特別是針對能引起宮頸癌的高危型HPV的疫苗。本文通過對HPV在預(yù)防宮頸癌的全球申請作為分析對象，并對該技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展進行介紹和總結(jié)。

【關(guān)鍵詞】HPV;宮頸癌;疫苗

中圖分類號： R737.33文獻標(biāo)識碼： A文章編號： 2095-2457（2019）17-0208-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.17.098

1 人乳頭瘤病毒與宮頸癌的基本概況

人乳頭瘤病毒（Human Papilloma virus，HPV），亦稱為人類乳突病毒，屬于乳頭瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，是嗜上皮性病毒。這種病毒具有高度的宿主特異性，僅感染人類。報道表明，全球一半以上的成人被HPV所感染。HPV病毒已分離出超過一百三十種，根據(jù)其致病性，可以分為高危型和低危型，高危型主要包括HPV16、18、33、31、45、58和52等，與宮頸癌的發(fā)病有關(guān)，低危型主要包括HPV6、11、42和44等，與生殖道疣狀物有關(guān)。宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位于女性腫瘤的第二位，每年全球大約有50萬例新發(fā)宮頸癌病例，近20萬人死于宮頸癌。分子流行病學(xué)的研究已經(jīng)證實HPV感染與宮頸癌有著十分密切的關(guān)系。HPV高危型（HPV16、18、31、45型等）的感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的重要因素，宮頸癌中HPV DNA的檢出率高達99%，其中約70%為HPV 16和HPV18型。預(yù)防與控制HPV感染的最有效方式是施用HPV疫苗，特別是針對能引起宮頸癌的高危型HPV的疫苗。2016年7月12日，國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)葛蘭素史克（GSK）公司的人乳頭瘤病毒吸附二價（HPV16/18）疫苗Cervarix的進口注冊申請;2017年11月9日，默克（默沙東）公司生產(chǎn)的四價（HPV6/11/16/18）疫苗Cardasil也獲準(zhǔn)上市;2018年4月28日，同樣是默克公司生產(chǎn)的九價（HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58）疫苗Cardasil9獲得上市許可[1]。本文旨在通過對HPV在預(yù)防宮頸癌的技術(shù)發(fā)展進行介紹和總結(jié)。

2 國內(nèi)外專利申請概況

人乳頭瘤病毒在預(yù)防宮頸癌方面的專利最早出現(xiàn)于1980s，并總體上呈現(xiàn)遞增的趨勢。2006年，宮頸癌疫苗獲得美國FDA上市，受此鼓動申請量出現(xiàn)了明顯的增加。該領(lǐng)域的申請量于2008-2010間出現(xiàn)大幅回落，2010年后再次顯示出上升趨勢。由圖1中趨勢可見，國內(nèi)相關(guān)申請相比起步較晚，于2002年提出首個申請，但發(fā)展迅猛，總體趨勢與全球趨勢相符合，截止2017年國內(nèi)申請的申請量已經(jīng)接近全球申請的半數(shù)。由此可見，雖然中國宮頸癌疫苗相關(guān)領(lǐng)域起步遲于國外，但本國科研工作者高度重視本領(lǐng)域的研究和開發(fā)，中國的相關(guān)申請在全世界已經(jīng)占得一席之地。同時，在華PCT申請數(shù)量也已超過半數(shù)，可見中國人口基數(shù)大，宮頸癌患者數(shù)量多的狀況以及其背后的中國市場引起了國外申請人的高度重視。

如圖2所示，人類乳頭瘤病毒在宮頸癌防治方面的申請主要集中在中、美兩國，兩國總和占樣本總量的71%。國內(nèi)申請量明顯超過美國以及其他發(fā)達國家，這說明近年來我國在人類乳頭瘤病毒在宮頸癌防治領(lǐng)域有較大的進展，并已經(jīng)積累了一定的技術(shù)實力。在占總樣本量的57%的國外申請中，超過一半都有在華申請。這種狀況可以在一定程度上說明，大部分申請人對于中國宮頸癌防治市場的巨大預(yù)期。結(jié)合目前商品化宮頸癌疫苗的事實現(xiàn)狀，獲得國家批準(zhǔn)的本領(lǐng)域產(chǎn)品的知識產(chǎn)權(quán)都歸于國外醫(yī)藥公司。

在本領(lǐng)域的研究較多集中于產(chǎn)品開發(fā)，這需要較大的資金和專業(yè)人員的投入，相比于個人和醫(yī)院，公司企業(yè)和各大高校具有更為突出的優(yōu)勢。這種申請人結(jié)構(gòu)是合理的，并可以保證本領(lǐng)域持續(xù)的申請量以及科研成果的產(chǎn)出。該技術(shù)領(lǐng)域的申請人分布相對較為分散，廈門大學(xué)在申請量方面較為領(lǐng)先，擁有15件專利申請;廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司和北京康樂衛(wèi)士生物技術(shù)股份有限公司次之，分別擁有13和8件申請;其后是北京工業(yè)大學(xué)、廣東拓譜康生物科技有限公司和艾托金生物醫(yī)藥（蘇州）有限公司等?？梢?，該技術(shù)領(lǐng)域尚不存在某個或某幾個申請人掌握具有絕大多數(shù)的申請量，不同申請人對于該領(lǐng)域的研究尚處于起步和探索階段。與國內(nèi)申請人分布較為類似地，國外申請人同樣也具有分布多樣化，申請相對分散的特點。默克公司以10件申請占據(jù)第一，葛蘭素史克公司和賓夕法尼亞大學(xué)理事會則以7件申請位居第二，其后依次是貝勒研究所，阿德瓦希斯公司，國立大學(xué)法人東京大學(xué)等?？梢钥闯?，美國默克公司和英國葛蘭素史克公司等生物醫(yī)藥巨頭非常看重國內(nèi)市場，中國長期作為其知識產(chǎn)權(quán)輸出國，具有十分重要的地位。

3 專利主要技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展

目前人類乳頭瘤病毒在宮頸癌的防治方面的應(yīng)用主要包括三個領(lǐng)域，基因克隆和蛋白純化，疫苗構(gòu)建以及病毒蛋白抗體。人類乳頭瘤病毒具有諸多亞型，因此對不同亞型的所述基因進行克隆是構(gòu)建宮頸癌疫苗的第一步，例如發(fā)明JPH0279980A，分離得到病毒16、18、31、33以及35型的52b基因;發(fā)明EP0523391A1，分離獲得病毒16型的E6和E7的多肽。隨著對病毒多肽序列的開發(fā)，準(zhǔn)確診斷病毒感染同樣是人類要解決的重要問題之一。因此，開發(fā)者將目光投向了如何準(zhǔn)確檢測病毒感染上，發(fā)明EP1656561A2公開了針對病毒L1和L2蛋白的單克隆抗體，可以迅速檢測出人乳頭瘤病毒的感染;無獨有偶，EP1487878 A2針對另一類重要的病毒蛋白E7，合成了具有特異性的單克隆抗體，用以臨床診斷。進一步，利用病毒蛋白的免疫原性誘導(dǎo)人體產(chǎn)生相應(yīng)亞型的HPV抗體，以病毒蛋白為核心的組合物作為宮頸癌疫苗進行使用在該技術(shù)領(lǐng)域中最為普遍。例如，較早的發(fā)明CN1064892A公開了一種重組病毒疫苗，所述病毒包含16型和18型的E6或E7蛋白。但是由于單一的病毒蛋白往往存在穩(wěn)定性差，抗原性弱等缺陷;并且隨著研究者對病毒蛋白結(jié)構(gòu)的研究和解析，在后續(xù)的申請中，申請人更多地開始將目光集中在天然免疫原的改進和穩(wěn)定上。例如CN1976718A公開了一種多價免疫組合物，其包括來自病毒16型、18型以及至少另一種病毒亞型的VLP或病毒殼微體。所述組合物可以同時使人體對多種亞型的HPV產(chǎn)生免疫反應(yīng)，進而預(yù)防所述病毒亞型的感染。申請人為了提升所述組合物的免疫原性和穩(wěn)定性，還進一步添加了3D MPL和氫氧化鋁。此外，EP2108657A1提供了一種含有病毒16型的E6蛋白的AP共有序列結(jié)構(gòu)域（Cys-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Xaa）的宮頸癌疫苗;CN102458440A提供了一種由包括乳頭狀瘤病毒（PV）L1蛋白的嵌合多肽組裝而成的病毒樣顆粒（VLP）組合物，所述乳頭狀瘤病毒L1蛋白中插入了由來自乳頭狀瘤病毒L2蛋白的某一序列組成的表面展示肽，可見在該發(fā)明中，不僅同時利用病毒的L1和L2蛋白，還對L2蛋白進行了人工優(yōu)化，并實驗證明其可以明顯提高所述組合物的免疫原性。雖然國內(nèi)申請在該技術(shù)領(lǐng)域起步較晚，但并不意味著中國在該技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)完全錯過，相反，2007-2008年是宮頸癌疫苗相關(guān)申請的黃金時期，該技術(shù)領(lǐng)域各種發(fā)明百花齊放，百家爭鳴。然而宮頸癌疫苗尚不完善，而國內(nèi)申請人明確這一點，并在近年來一直致力于更有效更安全的疫苗開發(fā)。由北京工業(yè)大學(xué)的申請CN103740741A公開了一種重組腺病毒疫苗，其核心在于提供了一種HPV18型病毒的E6E7蛋白融合突變體序列。所述疫苗具有較好的安全性，并且對于HBV18的感染具有極其顯著的預(yù)防作用。

病毒蛋白選擇直接決定了疫苗的效率，早期蛋白E6、E7以及晚期蛋白L1、L2是疫苗免疫原選擇的主要靶標(biāo)，特別是早期蛋白E7，相比于變異率高的E6，其更為保守，并且其在病變組織中具有極高的表達，針對其結(jié)構(gòu)和功能的研究眾多，因此其往往成為疫苗首選的靶抗原[2]。與此同時，如上所述，近年來針對多種病毒蛋白的宮頸癌疫苗層出不窮，例如將E6、E7進行融合表達、將L1、L2進行串聯(lián)表達或者將所述病毒蛋白進行不同形式的組合以提高免疫有效性也是該技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展的主流趨勢。

HPV16和18型這兩個導(dǎo)致了70%宮頸癌發(fā)生的高危型病毒必然是研究和針對的重點。如中國食品藥品監(jiān)督總局批準(zhǔn)上市的二價宮頸癌疫苗，即是針對這兩種病毒亞型。排在第三位的是58型病毒，針對其的相關(guān)申請具有僅次于16、18型的申請量也是有其重要原因的。HPV58型同樣是高危型人乳頭瘤病毒，HPV58雖在全球范圍內(nèi)感染率不高（陽性率僅2%，位于第7位），但在亞洲和非洲卻呈現(xiàn)出特殊的流行狀況（陽性率高達6%-30%，最高位于第2位，僅次于HPV16）。中國內(nèi)地是全球HPV58 高發(fā)區(qū)之一，1996-2007年多次報道宮頸癌患者中HPV58 陽性率僅次于HPV16，某些地區(qū)甚至高于HPV16 和HPV18，遠高于同期國外文獻報道的數(shù)字。在上海、江蘇、四川、廣東等地，高發(fā)態(tài)勢尤為明顯[3-4]。因此結(jié)合果然HPV感染的具體特點，針對58型病毒感染的預(yù)防也是國內(nèi)申請人在該技術(shù)領(lǐng)域的一大研究重點。

4 國內(nèi)申請人在宮頸癌疫苗領(lǐng)域的創(chuàng)新

國內(nèi)申請人并非僅僅是在追逐歐美的腳步，而是獨立自主，并有所突破。我們知道，很多宮頸癌疫苗僅能預(yù)防HPV的感染，但對于已經(jīng)感染的人群效果很差甚至毫無效果，可防不可治的尷尬局面亟待解決。因此在已經(jīng)開發(fā)出預(yù)防性疫苗的當(dāng)下，一種以HPV蛋白為免疫原，具有殺傷HPV陽性的宮頸癌細胞，治療宮頸癌的治療性疫苗顯示出巨大的市場需要。2015年，由廣東拓譜康生物科技有限公司開發(fā)的攜帶人乳頭瘤病毒16型多點突變型E7mm的重組腺相關(guān)病毒載體誕生（CN105177048 A）。這種重組腺病毒載體是通過將具有致瘤性的HPV-16的E7抗原基因多點突變?yōu)闊o致瘤性的E7抗原基因，再將該突變后基因插入已經(jīng)剔除結(jié)構(gòu)基因的腺相關(guān)病毒載體中而獲得的。該重組腺相關(guān)病毒可將其攜帶的突變型HPV-16 E7mm抗原基因輸送入單核細胞-樹突狀細胞系中，被用于刺激免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細胞。被該組腺相關(guān)病毒感染的DC所誘導(dǎo)的CTL在體外和患者體內(nèi)均可有效地抑制HPV-16 E7陽性細胞的生長或者殺滅HPV-16 E7陽性的細胞，且無致瘤性?？梢娽槍m頸（下轉(zhuǎn)第158頁）（上接第209頁）癌細胞幾乎都未HPV陽性的特點，同樣利用病毒蛋白，靶向免疫細胞對腫瘤細胞的殺滅，并且安全無二次致瘤的風(fēng)險。

5 小結(jié)

結(jié)合HPV感染人群眾多，且宮頸癌患者眾多的現(xiàn)實情況，在不斷完善預(yù)防性疫苗的同時，治療性免疫藥物相關(guān)會迎來新的一輪高潮。我國宮頸癌疫苗潛在市場空間將達到千億級別，其在該技術(shù)領(lǐng)域的研發(fā)應(yīng)該還會進一步持續(xù)。

【參考文獻】

[1]“從默沙東九價HPV疫苗8天獲批上市談起”，ailsa，中國生物技術(shù)信息網(wǎng)，2018年5月7日.

[2]“人乳頭瘤病毒E7蛋白的研究”，范雪莉等，微生物與感染，第28卷第1期，第8-11頁，2005年10月20日.

[3]“人乳頭瘤病毒58 型的系統(tǒng)地理學(xué)分析”，李燕云等，中國科學(xué)C輯：生命科學(xué)，第39卷第7期，第654-661頁，2009年12月31日.

[4]“Worldwide genomic diversity of the high-risk human papillomavirus types 31， 35， 52，and 58， four close relatives of human papillomavirus type 16”，Calleja-Macias I E等，J Virol，第79卷第21期，第13630-13640頁，2005年11月30日.