鼻咽癌標(biāo)志物臨床應(yīng)用專家共識(shí)

中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會(huì)鼻咽癌標(biāo)志物專家委員會(huì)

鼻咽癌是我國(guó)南方及東南沿海地區(qū)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，全世界約80%的鼻咽癌都發(fā)生在我國(guó)，嚴(yán)重威脅人民的生命健康。鼻咽癌對(duì)放射治療比較敏感，隨著放療技術(shù)的不斷發(fā)展，早期鼻咽癌的5年生存率已高達(dá)95%。但在臨床實(shí)踐中，由于鼻咽癌發(fā)病部位隱匿，發(fā)病癥狀與其他良性疾病難以鑒別，大部分鼻咽癌患者確診時(shí)已處于中晚期，伴隨頸部淋巴結(jié)和/或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，死亡率急劇上升［1］。因此，提高鼻咽癌的早期診斷和預(yù)后判斷水平是提升鼻咽癌整體治療水平的有效途徑。鼻咽癌標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)、應(yīng)用、評(píng)價(jià)和完善是實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的關(guān)鍵步驟。近年來(lái)，鼻咽癌特異性標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用取得了很大進(jìn)展，為了提高鼻咽癌標(biāo)志物臨床應(yīng)用的科學(xué)性、合理性和可操作性，最大限度發(fā)揮其效能，在參考國(guó)內(nèi)外權(quán)威文獻(xiàn)、征求鼻咽癌臨床和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域?qū)＜液蛯W(xué)者意見(jiàn)的基礎(chǔ)上，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)腫瘤標(biāo)志專業(yè)委員會(huì)鼻咽癌標(biāo)志物專家委員會(huì)編寫了本共識(shí)，后續(xù)將根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，適時(shí)修訂，以適應(yīng)臨床應(yīng)用的需要。

1 EB病毒相關(guān)標(biāo)志物

非角化性鼻咽癌是我國(guó)鼻咽癌的主要類型，EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染是非角化性鼻咽癌最主要的致病因素，幾乎所有的非角化性鼻咽癌患者都存在EBV感染［1-2］。因此，EBV相關(guān)標(biāo)志物是鼻咽癌標(biāo)志物的主要組成，也是目前臨床應(yīng)用最廣泛、最成熟的診斷和預(yù)后判斷標(biāo)志物。根據(jù)標(biāo)志物的生物成分，EBV相關(guān)標(biāo)志物大體可以分為血漿核酸類標(biāo)志物和血清抗體類標(biāo)志物。核酸類標(biāo)志物包括血漿中EBV DNA和EBV編碼的miRNA。抗體類標(biāo)志物則是針對(duì)EBV不同蛋白組分的抗體，包括EBV衣殼抗原IgM抗體、IgG抗體、IgA抗體，EBV早期抗原IgA抗體，EBV核抗原IgG抗體，Rta蛋白IgG抗體，Zta蛋白IgG抗體等。

1.1 血漿EBV DNA

基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的血漿EBV DNA檢測(cè)是目前臨床應(yīng)用最廣泛的鼻咽癌標(biāo)志物。血漿或血清中EBV DNA陽(yáng)性（EBV-DNA≥500 copies/mL）對(duì)鼻咽癌的診斷敏感性和特異性分別為89.1%（95%CI：87.0%~90.9%） 和 85.0%（95%CI：83.0%~86.9%），且血漿組的敏感性和特異性高于血清組［3］。同時(shí)血清EBV DNA在鼻咽癌篩查、早期診斷、治療和療效判斷等方面亦具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

1.1.1 血漿EBV DNA與鼻咽癌篩查、早期診斷 香港中文大學(xué)CHAN等［4］進(jìn)行了血漿EBV DNA作為鼻咽癌早期篩查標(biāo)志物可行性的前瞻性研究，該研究共納入了20 174名（均為中國(guó)人，年齡范圍40~62歲）無(wú)鼻咽癌臨床癥狀的受試者并進(jìn)行隨訪。所有受試者隨訪前，均進(jìn)行外周血血漿EBV DNA拷貝數(shù)檢測(cè)，陽(yáng)性（20 copies/mL視為EBV DNA陽(yáng)性）受試者4周后再次檢測(cè)，若仍顯示陽(yáng)性則進(jìn)行針對(duì)鼻咽的內(nèi)鏡和MRI檢查，以最大限度降低研究結(jié)果的假陽(yáng)性率。研究結(jié)果顯示，第1次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1 112名（5%）受試者EBV DNA呈陽(yáng)性，4周后復(fù)檢，發(fā)現(xiàn)309名受試者仍呈陽(yáng)性而呈陽(yáng)性的309名受試者中300名接受了鼻咽內(nèi)鏡檢查，其中275名同時(shí)接受了鼻咽部MRI檢查，最后經(jīng)病理檢查確診鼻咽癌34例，Ⅰ期和Ⅱ期（Ⅰ期16例，Ⅱ期8例，Ⅲ期8例，Ⅳ期2例）患者占比高達(dá)71%，且患者的3年疾病無(wú)進(jìn)展生存率高達(dá)97%，均顯著優(yōu)于其他隊(duì)列研究結(jié)果；而血清EBV DNA陰性受試者中，僅有1例1年后確診為鼻咽癌，因此血漿EBV DNA作為鼻咽癌早期篩查標(biāo)志物的敏感性和特異性分別為97.1%和98.6%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為11%，陰性預(yù)測(cè)值為 99.995%［4］。

專家組認(rèn)為，血漿EBV DNA篩查可以顯著提高鼻咽癌的早診率，從而相應(yīng)地提高療效。在鼻咽癌高發(fā)區(qū)，推薦將EBV DNA檢測(cè)作為鼻咽癌早期篩查的常規(guī)項(xiàng)目。

1.1.2 血漿EBV DNA與鼻咽癌治療后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 鼻咽癌患者治療后腫瘤會(huì)縮小或消退，血漿EBV DNA水平亦會(huì)迅速降低至常規(guī)檢測(cè)極限值以下［5］，其中手術(shù)切除后血漿EBV DNA的中位半衰期為139 min［6］，放療后血漿EBV DNA的中位半衰期為3.8 d［7］。因此，鼻咽癌患者治療后血漿EBV DNA水平回復(fù)或持續(xù)升高可能提示腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展，而且EBV DNA水平升高的時(shí)間較影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)和進(jìn)展的時(shí)間更早。馬駿等的研究顯示，鼻咽癌局部復(fù)發(fā)患者的血漿EBV DNA陽(yáng)性率分別為56.4%和65%，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者分別為94%和96%，且血漿EBV DNA陽(yáng)性診斷時(shí)間較臨床或影像學(xué)檢查陽(yáng)性診斷時(shí)間早3.5～6 個(gè)月［8-10］。

專家組認(rèn)為，血漿EBV DNA是判斷鼻咽癌治療后腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展的理想標(biāo)志物。

治療前及治療中的血漿EBV DNA水平與鼻咽癌的治療有效性密切相關(guān)，可指導(dǎo)治療方案制定。新輔助化療的療效與治療前血清EBV DNA水平密切相關(guān)，只有治療前血漿EBV DNA高的患者才能從新輔助化療中獲益。馬駿研究組證實(shí)只有EBV DNA水平高（EBV DNA＞1 550 copies/mL）的患者，接受新輔助化療才能顯著提高疾病無(wú)進(jìn)展生存和無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率［11］。進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn)，只有非常高危的患者（N2-3期和EBV DNA＞4 000 copies/mL）才能從新輔助化療中獲益［12］。LIANG 等［13］研究同樣證實(shí)只有血清EBV DNA水平高（＞4 000 copies/mL）的患者才能從同步放化療中獲得較單純調(diào)強(qiáng)放療更好的療效。治療中血漿EBV DNA水平亦能提示治療療效，可作為綜合治療方案及時(shí)更改、確認(rèn)以及療效判斷的觀察指標(biāo)。WANG等［14］研究顯示，化療首月血漿EBV DNA清除率高的患者，治療敏感性和生存率更高，對(duì)于血漿EBV DNA清除率低的患者，可考慮適時(shí)調(diào)整治療方案。

專家組推薦將治療前和治療中的血漿EBV DNA水平作為鼻咽癌治療方案制定和調(diào)整的依據(jù)。

1.1.3 血漿EBV DNA與鼻咽癌的預(yù)后判斷 眾多研究表明，治療前、治療中和治療后的血漿EBV DNA水平與鼻咽癌預(yù)后密切相關(guān)。鼻咽癌根治性治療后1年內(nèi)腫瘤進(jìn)展的患者，其治療前血漿EBV DNA拷貝數(shù)顯著高于未進(jìn)展患者，且拷貝數(shù)與死亡率呈正相關(guān)（拷貝數(shù)每增加10倍其疾病相關(guān)死亡率上升1.1～3.1倍）［15］。同時(shí)，治療前血漿EBV DNA較TNM分期具有更好的預(yù)后判斷效能，血漿EBV DNA水平高（＞4 000 copies/mL）和血漿EBV DNA水平低的患者（＜4 000 copies/mL）5年無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率相差10%；N0和N1期中血漿EBV DNA拷貝數(shù)高的患者與N2和N3期拷貝數(shù)低的患者初診遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率無(wú)顯著差異，Ⅰ/Ⅱ期血漿EBV DNA水平高的患者總生存率與Ⅲ期患者相似，Ⅲ期血漿EBV DNA水平低的患者其預(yù)后與Ⅰ期患者相似［16］。同時(shí)，以1 500 copies/mL為閾值，發(fā)現(xiàn)血漿EBV DNA是總生存率、疾病無(wú)進(jìn)展生存率、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率的獨(dú)立預(yù)后因素；EBV DNA拷貝數(shù)小于1 500 copies/mL的Ⅳ期患者與EBV DNA拷貝數(shù)大于1 500 copies/mL的Ⅲ期患者預(yù)后無(wú)顯著差異［10］。新輔助化療2個(gè)周期后血漿EBV DNA是無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率的獨(dú)立預(yù)后因素［17］。放療4周后血漿EBV DNA陽(yáng)性是無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率、無(wú)進(jìn)展生存率和總生存率的危險(xiǎn)因素，74%治療失敗的患者與治療中血漿EBV DNA陽(yáng)性相關(guān)［18］。治療過(guò)程中，EBV DNA清除快、半衰期短的患者預(yù)后更好。鼻咽癌根治性治療后血漿中的EBV DNA水平在預(yù)后判斷中發(fā)揮重要作用。CHAN等［19］研究發(fā)現(xiàn)，治療后血漿EBV DNA拷貝數(shù)（閾值：500 copies/mL）是總生存率和疾病無(wú)進(jìn)展生存率最重要的預(yù)后因素，其判斷效能優(yōu)于治療前血漿EBVDNA拷貝數(shù)（閾值：4000copies/mL）和臨床分期。馬駿等采用分類決策樹(shù)分析將血漿EBV-DNA整合進(jìn)現(xiàn)有的TNM臨床分期，提出了鼻咽癌新臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：R1期（T1N0）、RⅡA期（T2-3N0或T1-3N1且 EBV DNA≤2 000 copies/mL）、RⅡB期（T2-3N0或 T1-3N1且 EBV-DNA＞2 000 copies/mL）、RⅢ期 （T1-3N2且 EBV-DNA＞2 000copies/mL或T4N0-2），RⅣ期（TanyN3），每分期對(duì)應(yīng)的患者 5 年生存率分別是100%、87.9%、76.7%、68.7%和50.4%，發(fā)現(xiàn)新分期系統(tǒng)能更好地區(qū)分不同危險(xiǎn)分層鼻咽癌患者的預(yù)后，指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療［20］。

專家組認(rèn)為，綜合考慮治療全程的血漿EBV DNA水平和TNM分期，可更加準(zhǔn)確地判斷預(yù)后，為腫瘤治療后進(jìn)展的患者提供早期干預(yù)依據(jù)。

1.1.4 血漿EBV DNA檢測(cè)的影響因素和局限性Allen Chan在證實(shí)血漿EBV DNA可作為無(wú)癥狀人群鼻咽癌早期篩查標(biāo)志物后，進(jìn)一步分析了影響EBV DNA檢測(cè)結(jié)果的因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)年齡、吸煙及采血時(shí)的環(huán)境溫度是影響EBV DNA檢測(cè)陽(yáng)性率的獨(dú)立因素，EBV DNA檢測(cè)陽(yáng)性率與環(huán)境溫度呈負(fù)相關(guān)（每降低5℃，EBV DNA陽(yáng)性檢出率上升0.85%），與受試者年齡呈正相關(guān)（每增長(zhǎng)5歲，EBV DNA陽(yáng)性檢出率上升0.6%），認(rèn)為EBV DNA檢測(cè)陽(yáng)性率與環(huán)境溫度以及患者年齡有關(guān)［21］。

盡管血漿EBV DNA檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于鼻咽癌臨床診療，但仍存在一定的局限性，主要表現(xiàn)在以下方面：⑴目前有關(guān)鼻咽癌血漿EBV DNA的研究主要集中于鼻咽癌高發(fā)區(qū)，其研究結(jié)果能否推廣至非高發(fā)區(qū)，仍需證實(shí)。⑵已有的EBV DNA研究大多為回顧性研究，前瞻性研究較少，隨機(jī)分組研究更少，因此需更高級(jí)別的臨床證據(jù)。⑶目前關(guān)于EBV DNA檢測(cè)缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)論是檢測(cè)設(shè)備、DNA提取、檢測(cè)的DNA片段、質(zhì)量控制、檢測(cè)極限值等均缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致不同研究組的結(jié)果，尤其在EBV DNA閾值設(shè)置上，存在較大差異。因此，亟待開(kāi)展全球范圍內(nèi)的合作研究，制定標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)和結(jié)果判定方法，以提高EBV DNA檢測(cè)臨床應(yīng)用的可靠性［22］。

1.2 EBV血清抗體標(biāo)志物

除了血漿EBV DNA外，針對(duì)EBV不同蛋白組分的血清抗體也在鼻咽癌的臨床診斷、治療和預(yù)后判斷中得到較廣泛的應(yīng)用。常見(jiàn)的EBV血清抗體標(biāo)志物包括EBV衣殼抗原IgM抗體（EBV-VCA-IgM）、EBV衣殼抗原IgG抗體（EBV-VCA-IgG）、EBV衣殼抗原IgA抗體（EBV-VCA-IgA）、EBV早期抗原IgA抗體（EBV-EA-IgA）、EBV核抗原 IgG抗體（EBV-NAIgG）、Rta蛋白 IgG 抗體（Rta-IgG）、Zta蛋白 IgG 抗體（Zta-IgG）等。

1.2.1 EBV-VCA-IgM EBV衣殼抗原是鼻咽癌增殖后期表達(dá)的一種結(jié)構(gòu)蛋白，是EBV感染后最晚產(chǎn)生的抗原。在EBV感染早期，血清EBV-VCA-IgM顯著升高，3~4周后達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，在體內(nèi)可持續(xù)存在4~8周，具有較高的靈敏度及特異度，對(duì)診斷EBV急性感染意義重大。有研究顯示EBV-VCA-IgM與反映EBV在體內(nèi)復(fù)制情況的血漿EBV DNA聯(lián)合檢測(cè)，可提高EBV現(xiàn)癥感染的診斷率［23］。但是因?yàn)榇丝贵w在體內(nèi)消失快，且因個(gè)體免疫反應(yīng)復(fù)雜多樣，存在產(chǎn)生延遲或持續(xù)缺失的可能，單獨(dú)檢測(cè)容易導(dǎo)致漏診。

專家組認(rèn)為，EBV-VCA-IgM作為急性EBV感染的標(biāo)志物，適用于臨床EBV感染的早期診斷，但在鼻咽癌診療中較少單獨(dú)檢測(cè)EBV-VCA-IgM，常與其他血清抗體及血漿EBV DNA聯(lián)合檢測(cè)，用于輔助鼻咽癌的早期診斷及隨訪監(jiān)測(cè)。

1.2.2 EBV-VCA-IgG EBV-VCA-IgG亦為EBV感染早期出現(xiàn)的抗體，多在EBV-VCA-IgM產(chǎn)生后出現(xiàn)，一般首先產(chǎn)生低親和力IgG，隨著感染的進(jìn)展，抗體親和力升高，且主要為高親和力IgG，該抗體可在病毒感染后長(zhǎng)期維持較高水平，甚至持續(xù)終生。故低親和力EBV-VCA-IgG可作為原發(fā)性急性感染指標(biāo)，而高親和力IgG則被視為恢復(fù)期或既往感染的指標(biāo)。但目前臨床上常規(guī)檢測(cè)未能區(qū)別低親和力IgG及高親和力IgG，因此未能辨別為近期感染或既往感染，需進(jìn)一步進(jìn)行抗體親和力檢測(cè)［24］，此外EBV-VCA-IgG在人群中陽(yáng)性率高，導(dǎo)致其對(duì)鼻咽癌的診斷特異度低，臨床上多用于流行病學(xué)調(diào)查。因此，專家組不推薦EBV-VCA-IgG作為鼻咽癌篩查及診斷的單獨(dú)檢測(cè)指標(biāo)，可與其他抗體標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)［25］，幫助了解鼻咽癌患者體內(nèi)EBV感染情況，從而輔助鼻咽癌的篩查及早期診斷。

1.2.3 EBV-VCA-IgA EBV-VCA-IgA在原發(fā)性EBV感染的早期即可檢測(cè)到，是目前抗EBV抗體中研究最早，也是唯一進(jìn)行大樣本鼻咽癌普查研究的篩查指標(biāo)［26］，是應(yīng)用最廣泛的EBV抗體。因VCA抗原具有較強(qiáng)的免疫原性，多數(shù)鼻咽癌患者可表現(xiàn)出VCA-IgA陽(yáng)性，故EBV-VCA-IgA對(duì)診斷鼻咽癌具有較高的靈敏度［27］。EBV-VCA-IgA抗體滴度水平會(huì)隨著病情的發(fā)展或恢復(fù)變化。ZHAO等［28］研究顯示EBV-VCAIgA是影響鼻咽癌預(yù)后的因素，認(rèn)為其在鼻咽癌預(yù)后判斷、病情檢測(cè)及預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中具有重要意義。但值得注意的是，EBV-VCA-IgA在健康人群中亦有較高的檢出率，特異度欠佳，同時(shí)IgA抗體存在血清空窗期，檢測(cè)具有假陰性風(fēng)險(xiǎn)，因此專家組不推薦EBVVCA-IgA用于鼻咽癌篩查及診斷

1.2.4 EBV-EA-IgA 早期抗原EA是EBV進(jìn)入潛伏感染早期表達(dá)的一種與基因組復(fù)制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒進(jìn)入溶解期的標(biāo)志。血清中抗EA抗體可分為IgA和IgG兩種，EA-IgG抗體持續(xù)時(shí)間短，一般檢測(cè)不到，臨床上常檢測(cè)EA-IgA。EBV-EA-IgA多出現(xiàn)在EBV感染早期，是EBV近期感染或EBV活躍增殖的標(biāo)志，特異度較高，研究顯示EBV-EA-IgA單獨(dú)應(yīng)用特異度最高達(dá)95%，故常用于鼻咽癌篩查及早期診斷［29-30］。此外EA-IgA抗體與鼻咽癌T、N分期及臨床分期相關(guān)，其抗體滴度越高，鼻咽癌分期越晚，但也有研究者得出不一致的結(jié)論，故兩者的關(guān)系需進(jìn)一步深入研究。

專家組認(rèn)為，EBV-EA-IgA抗體的靈敏度差，且抗體滴度低，限制了其在鼻咽癌診療中的應(yīng)用，臨床上多與其他抗體聯(lián)合應(yīng)用，提高靈敏度。

1.2.5 EBV-NA-IgG EBV核抗原包括 EBNA1、EBNA2、EBNA3和主導(dǎo)蛋白（LP）。其中EBNA1是唯一在所有與EBV相關(guān)腫瘤中均表達(dá)的病毒編碼抗原，也是細(xì)胞轉(zhuǎn)化必需的抗原。EBV-NA-IgG一般在EBV感染發(fā)病后4~6周出現(xiàn)，抗體可持續(xù)終生，是EBV既往感染的標(biāo)志。LIU等［31］認(rèn)為EBV-NA-IgG診斷鼻咽癌敏感度和特異度較高，分別為92.7%和85.8%，適合用于鼻咽癌篩查及早期診斷。因EBVNA-IgG為EBV潛伏感染期的產(chǎn)物，其與EBV增殖感染期所產(chǎn)生的抗體聯(lián)合，可覆蓋檢測(cè)EBV感染整個(gè)免疫應(yīng)答過(guò)程，對(duì)提高診斷的特異度和靈敏度具有更高價(jià)值［24，32］。

專家組認(rèn)為，臨床上動(dòng)態(tài)觀察EBV-NA-IgG滴度變化，對(duì)鼻咽癌療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷有一定的價(jià)值。1.2.6 Rta-IgG及Zta-IgG抗體 Zta蛋白是由EBV BZLF1基因編碼，反映EBV由潛伏感染轉(zhuǎn)化為溶解性感染立即早期時(shí)相的產(chǎn)物，是調(diào)節(jié)病毒進(jìn)入復(fù)制狀態(tài)的關(guān)鍵，大多在EBV感染早期出現(xiàn)。JOAB等［33］研究發(fā)現(xiàn)Zta-IgG在鼻咽癌篩查中具有較高的輔助診斷價(jià)值，值得臨床推廣應(yīng)用，檢測(cè)靈敏度為87%，特異度為94%。Rta蛋白是由EBV裂解立即早期基因BRLF1基因編碼的產(chǎn)物，是EBV由潛伏期轉(zhuǎn)向裂解期的關(guān)鍵調(diào)控因子，可促進(jìn)一系列的裂解早期基因產(chǎn)物表達(dá)。FENG等［34］研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者體內(nèi)可檢測(cè)出高水平的Rta蛋白IgG抗體，認(rèn)為Rta-IgG可作為早期EBV復(fù)制的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，在鼻咽癌診斷中具有較高的準(zhǔn)確性及特異度，目前臨床上常采用Rta-IgG抗體作為鼻咽癌篩查指標(biāo)之一。近十幾年的研究表明Rta-IgG若與其他EBV抗體聯(lián)合檢測(cè)可進(jìn)一步提高鼻咽癌篩查和診斷的靈敏度或特異度［35］。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道Rta-IgG與鼻咽癌臨床分期及預(yù)后有關(guān)，Rta-IgG陽(yáng)性率與鼻咽癌臨床分期有關(guān)，且隨臨床分期增高而升高［36］。近來(lái)相關(guān)研究表明BRLF1能通過(guò)誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，Rta-IgG有望成為鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)［37］。

專家組認(rèn)為，Zta-IgG和Rta-IgG抗體對(duì)鼻咽癌診斷有一定輔助作用。

1.2.7 EBV抗體檢測(cè)新技術(shù)——納米酶層析（試紙）技術(shù)

目前鼻咽癌血清學(xué)檢測(cè)方法主要有ELISA法和膠體金免疫（試紙）層析法。ELISA法靈敏度和特異度高，且可同時(shí)檢測(cè)多種抗體，但是操作復(fù)雜、效率較低，費(fèi)用較高，對(duì)檢測(cè)設(shè)備有要求，不適合在偏遠(yuǎn)地區(qū)開(kāi)展鼻咽癌早期篩查工作。膠體金免疫（試紙）層析法簡(jiǎn)單、快速、無(wú)污染，但是靈敏度較低，假陽(yáng)性率高，具有較高的漏診風(fēng)險(xiǎn)。納米酶層析（試紙）技術(shù)整合了ELISA高靈敏度和高特異度的特性，又具備膠體金免疫（試紙）層析法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)和快速特點(diǎn)，是理想的鼻咽癌早期篩查和診斷技術(shù)。

基于EBV相關(guān)抗體檢測(cè)鼻咽癌的納米酶層析（試紙）技術(shù)的設(shè)計(jì)原理是以硝酸纖維素膜（NC膜）為固相載體，將VCA抗原固定在膜上作為檢測(cè)線（Test線，記作T線），而將二抗（羊抗鼠IgG）固定在檢測(cè)線的上方作為質(zhì)控線（Control線，記作C線）。同樣在納米酶磁性顆粒上標(biāo)記鼠抗人IgA抗體。當(dāng)待測(cè)樣品血清加入后，納米酶磁性顆粒上標(biāo)記的鼠抗人IgA抗體與待測(cè)樣品中的VCA-IgA抗體發(fā)生抗原抗體特異性免疫反應(yīng)并形成一種抗原抗體復(fù)合物。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物層析到NC膜已固定的T線時(shí)，抗原抗體復(fù)合物與T線上的VCA抗原再次結(jié)合并顯色從而達(dá)到檢測(cè)的目的。無(wú)論待測(cè)樣品是否有VCA-IgA抗體，層析到NC膜已固定的C線時(shí)，羊抗鼠IgG均能與其反應(yīng)結(jié)合并顯色（圖1）。

圖1 鼻咽癌納米酶層析（試紙）技術(shù)的設(shè)計(jì)思路

聶國(guó)輝等［38］利用分散度好、粒徑均一的Fe3O4納米酶顆粒，制備了納米酶免疫層析試紙，通過(guò)檢測(cè)VCA-IgA數(shù)據(jù)可知，納米酶免疫層析試紙可靠性強(qiáng)，穩(wěn)定性高，靈敏度高，檢測(cè)極限是1ng/ml（圖2）。由于Fe3O4納米酶具有磁性和過(guò)氧化物酶活性，因此Fe3O4納米酶探針同時(shí)具有EBV相關(guān)抗原識(shí)別、分離富集和檢測(cè)信號(hào)放大三重功能。納米酶免疫層析試紙與ELISA的檢測(cè)靈敏度相當(dāng)，但納米酶免疫層析試紙同時(shí)具備靈敏度高，操作簡(jiǎn)單、快速，成本低等優(yōu)點(diǎn)，有利于大規(guī)模開(kāi)展鼻咽癌篩查與早期診斷工作，特別對(duì)醫(yī)療條件有限的偏遠(yuǎn)地區(qū)開(kāi)展鼻咽癌的篩查具有重要意義［39-42］。

專家組認(rèn)為，在醫(yī)療及經(jīng)濟(jì)條件有限的地區(qū)，納米酶層析（試紙）技術(shù)EBV抗體檢測(cè)可作為成本及篩查效益相對(duì)較佳的選擇。

圖2 納米酶層析（試紙）檢測(cè)VCA-IgA的靈敏度

1.3 EBV編碼的miRNA

EBV是首個(gè)發(fā)現(xiàn)可以編碼miRNAs的病毒。迄今為止，已鑒定出25個(gè)EBV相關(guān)的miRNA前體和由前體產(chǎn)生的48個(gè)miRNA成熟體，分別由BART（BamH I-A region rightward transcript）和 BHRF1（BamH I fragment H right ward pen reading frame 1）編碼［43］。幾乎所有的鼻咽癌患者鼻咽上皮都存在EBV感染，并表達(dá)EBV miRNA-BART。除了可以從鼻咽癌細(xì)胞檢測(cè)miRNA-BARTs表達(dá)，也能從患者血漿中檢測(cè)到EBV編碼的miRNA-BARTs。日本學(xué)者 KAWANO等［44］研究顯示，在慢性活動(dòng)性EBV感染患者血漿中檢測(cè)miR-BART2-5p的表達(dá)水平可以評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度及其預(yù)后。RAMAYANTI等［45］研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌患者血清中，BART7-3p、BART9-3p和 BART13-3p表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照人群，采用鼻咽癌患者、其他頭頸部腫瘤患者以及EBV感染無(wú)癥狀患者的血清，發(fā)現(xiàn)血清EBV miRNAs診斷鼻咽癌的效率明顯優(yōu)于抗EBNA1 IgA血清學(xué)以及EBV DNA載量檢測(cè)，其中BART13-3p診斷的特異度達(dá)到了97%。HIRAI等［46］研究發(fā)現(xiàn)，血清 BamHI-W DNA、miR-BART2-5p、miR-BART17-5p和miR-BART18-5p對(duì)鼻咽癌診斷的敏感度和特異度分別為100%和100%、85%和85%、60%和95%、25%和100%。ZHANG 等［47］報(bào)道，鼻咽癌血漿中miR-BART7和miR-BART13的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照和其他腫瘤患者，尤其晚期患者表達(dá)水平更高。此外，ROC分析顯示，聯(lián)合檢測(cè)miR-BART7和miR-BART13能檢測(cè)到90%的鼻咽癌患者。同時(shí)，ZHENG等［48］報(bào)道經(jīng)鼻咽刷片標(biāo)本檢測(cè)miR-BART1-5p是診斷鼻咽癌的有效方式，診斷的靈敏度為93.5%，特異度為100.0%，檢測(cè)早期鼻咽癌的效能明顯優(yōu)于現(xiàn)有的檢測(cè)方法，可以識(shí)別血漿EBV DNA、EBV抗體滴度等檢測(cè)中的假陰性標(biāo)本。

專家組認(rèn)為，EBV編碼的miR-BARTs有望成為鼻咽癌新的診斷和預(yù)后判斷標(biāo)志物，但仍需大樣本研究驗(yàn)證，并制定相應(yīng)的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 EBV以外的標(biāo)志物

2.1 Micro RNAs

Micro RNAs（miRNAs）參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程調(diào)控，miRNAs表達(dá)改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、惡性程度、治療敏感性等密切相關(guān)，有作為腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的潛能。馬駿等報(bào)道一組41個(gè)差異表達(dá)的miRNA可完全準(zhǔn)確地區(qū)分鼻咽癌和正常鼻咽組織，而其中5個(gè) miRNA（miR-93、miR-142-3p、miR-26a、miR-29c、miR-30e）構(gòu)成的分子標(biāo)簽可以預(yù)測(cè)鼻咽癌患者的無(wú)瘤生存率，該分子標(biāo)簽結(jié)合TNM臨床分期可將預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性由61%提高到70%［49］。BRUCE等［50］檢測(cè)腫瘤組織中4個(gè)miRNA（miR-154-5p、miR-449b-5p、miR-140-5p、miR-34c-5p）的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其能夠預(yù)測(cè)鼻咽癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。馬駿等報(bào)道人血清miRNA（miR-22、miR-572、miR-638 和 miR-1234）可以預(yù)測(cè)鼻咽癌患者預(yù)后［51］。李欣等報(bào)道m(xù)iR-9在鼻咽癌中低表達(dá)，其表達(dá)水平與鼻咽癌進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，可作為區(qū)分原位鼻咽癌和轉(zhuǎn)移鼻咽癌的指標(biāo)，敏感度為73%，精確性為74.2%［52］。肖志強(qiáng)等認(rèn)為miR-203和miR-23a可作為鼻咽癌放療敏感性的評(píng)價(jià)標(biāo)志物，miR-203和miR-23a低表達(dá)與鼻咽癌放療敏感和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［53-54］。

專家組認(rèn)為，上述miRNAs有望成為新的鼻咽癌標(biāo)志物，用于鼻咽癌預(yù)后和療效預(yù)測(cè)。

2.2 多分子標(biāo)志物

鼻咽癌組織的特異性基因表達(dá)譜是鼻咽癌標(biāo)志物篩選和鑒定的重要來(lái)源，相當(dāng)數(shù)量的候選標(biāo)志物得到了鑒定。馬駿等報(bào)道了一組由13個(gè)基因構(gòu)成的分子標(biāo)簽，認(rèn)為其可預(yù)測(cè)鼻咽癌患者的無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存和同期化療敏感性，并首次納入基因表達(dá)譜、N分期、性別、血清LDH和C-反應(yīng)蛋白（CRP）構(gòu)建了列線圖（Nomogram）預(yù)后預(yù)測(cè)模型，ROC曲線分析顯示：較單純N分期，該列線圖可以將遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性由57%提高到75%［55］。同時(shí)證實(shí)腫瘤侵入淋巴細(xì)胞是鼻咽癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，與總生存、無(wú)病生存、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存等呈負(fù)相關(guān)，將其與其他因素納入列線圖預(yù)后模型后，可顯著提高模型的預(yù)后判斷效能［56］。邵建勇等基于支持向量機(jī)（support vector machine）構(gòu)建了1個(gè)包含性別和7個(gè)基因構(gòu)成的鼻咽癌預(yù)后分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)對(duì)判斷鼻咽癌患者的5年疾病特異性生存有較好的效能，能有效區(qū)分和預(yù)測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)人群，是影響5年疾病特異性生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=4.9，95%CI：3.0~7.9）［57］。肖志強(qiáng)等報(bào)道基于RKIP、14-3-3б、Maspin 和 GRP78 和 TNM 分期構(gòu)建的積分風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型，可以有效判斷鼻咽癌患者的放療敏感性（精確度88.00%，特異度86.48%，準(zhǔn)確性87.25%），且該積分風(fēng)險(xiǎn)模型中積分高的患者放療敏感性低，預(yù)后較差［58］。

專家組認(rèn)為，上述多分子標(biāo)志物有望用于鼻咽癌預(yù)后和療效預(yù)測(cè)。

2.3 甲基化標(biāo)志物

異常的表觀遺傳調(diào)節(jié)如啟動(dòng)子CpG甲基化使腫瘤抑制基因（tumor suppressor genes，TSGs）失活并重新激活癌基因，導(dǎo)致異常的基因表達(dá)和功能異常，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。異常啟動(dòng)子CpG甲基化常發(fā)生在早期癌癥階段和整個(gè)疾病階段，因此是腫瘤早期診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有價(jià)值的生物標(biāo)志物［59-60］。與其他分子標(biāo)志物如mRNA和蛋白質(zhì)相比，CpG甲基化具有較多優(yōu)點(diǎn)，包括穩(wěn)定性、易擴(kuò)增性和可檢測(cè)性，以及高頻率發(fā)生和非侵入性（可在循環(huán)體液樣本中檢測(cè)）［61］。更重要的是，啟動(dòng)子CpG甲基化常發(fā)生在腫瘤的早期階段［62］。

目前有14種基于DNA甲基化的生物標(biāo)志物檢測(cè)被商業(yè)化，可檢測(cè)13個(gè)基因，如GSTP1、RASSF1、SEPT9（septin-9）、DAPK1基因甲基化可檢測(cè)的腫瘤包括結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［63］。然而目前尚無(wú)鼻咽癌相關(guān)的市場(chǎng)化DNA甲基化標(biāo)志物，這也是亟待大力推進(jìn)和解決的問(wèn)題。陶謙教授研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)鑒定了一些鼻咽癌甲基化標(biāo)志物及其生物學(xué)特征，如PCDH1020、TET1、WIF1和DLEC1基因啟動(dòng)子CpG甲基化作為鼻咽癌早期檢測(cè)的標(biāo)志物；ZNF38225啟動(dòng)子CpG甲基化作為鼻咽癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志物；p16和RASSF1A26啟動(dòng)子CpG甲基化為EBV陽(yáng)性感染標(biāo)志物；SFRP5和DACT2甲基化在鼻咽癌患者血清和鼻咽拭紙中可檢測(cè)到但在正常血清中未檢測(cè)到［64］。通過(guò)對(duì)鼻咽癌患者的活組織檢查，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)基因 （RASSF1A、WIF1、DAPK1 和 RARβ2）的DNA甲基化在鼻咽癌早期階段（Ⅰ和Ⅱ）顯示出較EBV DNA標(biāo)志物更高的靈敏度和特異度［65］。鼻咽癌患者血清中 4個(gè)基因（CDKN2A、DLEC1、DAPK1和UCHL1）的DNA甲基化對(duì)預(yù)測(cè)鼻咽癌的敏感性和特異度更高［66］。采用 5 個(gè)基因（RASSF1A、p16、WIF1、CHFR和RIZ1）的甲基化組合檢測(cè)鼻咽癌與非鼻咽癌，檢出率可達(dá) 98%［67］。UCHL1/PGP9.5、KIF1A 和DLEC1組合檢測(cè)鼻咽癌的敏感度和特異度分別為84%和92%［68］。啟動(dòng)子甲基化標(biāo)志物可結(jié)合EBV檢測(cè)作為鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的補(bǔ)充，應(yīng)用于鼻咽癌的早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷。因此，確定EBV相關(guān)鼻咽癌中受甲基化調(diào)控的基因，驗(yàn)證其在腫瘤樣品中的表達(dá)和甲基化水平，評(píng)估其與臨床特征的關(guān)系以及作為鼻咽癌生物標(biāo)志物的潛力，將對(duì)開(kāi)發(fā)鼻咽癌早期檢測(cè)分子標(biāo)志物具有重要的意義。

專家組認(rèn)為，甲基化標(biāo)志物可用于鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和早期診斷。

2.4 外周血蛋白標(biāo)志物

研究顯示一些外周血蛋白與鼻咽癌亦存在相關(guān)性。馬駿等報(bào)道血清LDH水平可以反映腫瘤微環(huán)境的乏氧程度，與放化療敏感性相關(guān)，治療前血清LDH水平升高（>245 U/L）是鼻咽癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［69］。根治性治療后出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者，治療前的血清LDH水平顯著高于肝以外部位發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，提示治療前血清LDH水平高的患者更容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移［70］。轉(zhuǎn)移性鼻咽癌行姑息性化療時(shí)，治療前或治療后血清LDH水平升高的患者治療反應(yīng)率和預(yù)后明顯較血清LDH水平正?；颊卟?，認(rèn)為血清LDH可作為鼻咽癌預(yù)后判斷、療效監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物［71］。另外，血清CALM升高與鼻咽癌復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，可作為鼻咽癌復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物［72］。治療前血漿纖維蛋白原水平與ⅣA/B鼻咽癌患者預(yù)后呈正相關(guān)，可作為判斷調(diào)強(qiáng)放療療效和預(yù)后判斷的標(biāo)志物，且表現(xiàn)出較EBV DNA更高的效能［73］。

專家組認(rèn)為，外周血蛋白特別是LDH對(duì)預(yù)測(cè)鼻咽癌療效、預(yù)后判斷有一定價(jià)值。

2.5 PD-1/PD-L1

以PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑為代表的免疫治療是鼻咽癌新的治療手段，但其單藥有效率僅約為30%，因此亟需尋找免疫治療療效預(yù)測(cè)指標(biāo)。鼻咽癌患者的腫瘤組織中有大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)［56］。ZHANG等［74］報(bào)道95%以上的鼻咽癌患者腫瘤組織高表達(dá)PD-L1，腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1且腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞高表達(dá)PD-1的鼻咽癌患者預(yù)后較差。大量研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1鼻咽癌患者的預(yù)后較差［75-76］，也有研究認(rèn)為PD-L1表達(dá)與鼻咽癌預(yù)后無(wú)關(guān)［77］。最近ZHU 等［78］研究發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞含量高的鼻咽癌患者，PD-L1高表達(dá)患者的預(yù)后較好。

專家組認(rèn)為，PD-1/PD-L1作為鼻咽癌免疫治療療效預(yù)測(cè)指標(biāo)的價(jià)值有待商榷。

2.6 影像學(xué)相關(guān)標(biāo)志物

除了上述實(shí)體標(biāo)志物外，隨著生物信息大數(shù)據(jù)等技術(shù)的發(fā)展，基于機(jī)器學(xué)習(xí)的影像組學(xué)的出現(xiàn)，為腫瘤的診斷和預(yù)后判斷提供了新的數(shù)字標(biāo)志物。利用計(jì)算機(jī)編程，從影像（CT、MRI、PET/CT 等）中高通量地提取大量影像信息，實(shí)現(xiàn)腫瘤分割、特征提取與模型建立?；贛RI、PET/CT的影像參數(shù)分析、多維數(shù)據(jù)建模等研究結(jié)果顯示，PET/CT新型顯影劑68 Ga DOTA-peptide［79］，PET/CT 參 數(shù) I N［80］，SUVmax，MTV［81］等參數(shù)均與鼻咽癌診斷或預(yù)后有關(guān)，具有作為診斷和預(yù)后判斷標(biāo)志物的潛能。同時(shí)，利用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法，基于MRI數(shù)據(jù)建立的預(yù)測(cè)模型，在晚期鼻咽癌預(yù)后判斷中具有良好的效能［82］。

專家組認(rèn)為，影像學(xué)相關(guān)標(biāo)志物有望用于鼻咽癌鼻咽癌診斷和預(yù)后判斷。

3 小結(jié)

隨著研究的深入和技術(shù)的發(fā)展，血漿EBV DNA及抗體等鼻咽癌傳統(tǒng)標(biāo)志物的效能和應(yīng)用得到了擴(kuò)展，同時(shí)miRNAs（含EBV編碼的miRNA）、基因甲基化狀態(tài)等候選鼻咽癌標(biāo)志物亦被鑒定。總體而言，單個(gè)腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用存在敏感度欠缺、特異度不理想或檢測(cè)方法不便于大范圍推廣等局限性。因此，科學(xué)地開(kāi)展多種標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用，同時(shí)推進(jìn)標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展是提高現(xiàn)有鼻咽癌標(biāo)志物臨床應(yīng)用效能的有效途徑。對(duì)于已呈現(xiàn)出良好效能的新標(biāo)志物，開(kāi)展大樣本回顧性研究和前瞻性研究，進(jìn)一步檢測(cè)和修正其效能，是促進(jìn)其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的關(guān)鍵和必須步驟。另外，制定統(tǒng)一的檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和參考范圍，是推進(jìn)現(xiàn)有鼻咽癌腫瘤標(biāo)志物更大范圍和規(guī)范化應(yīng)用的關(guān)鍵。