骨硬化蛋白和dkk1與2型糖尿病患者骨密度相關性研究

王健民 高啟紅 邱守芳 張立英

1.濱州市中醫(yī)醫(yī)院骨科，山東 濱州 256600 2.濱州市中醫(yī)醫(yī)院內分泌科，山東 濱州 256600 3.濱州市中醫(yī)醫(yī)院健康管理中心， 山東 濱州 256600 4.濱州市中醫(yī)院感染科，山東 濱州 256000

骨質疏松癥(OP)是一種全身性骨骼疾病，其特征是骨強度受損，易出現(xiàn)骨折[1]。OP在患有2型糖尿病(T2DM)的老年患者中普遍存在。患有骨折的患者，特別是老年人，生活費用較高、生活質量較低。在病理學上，糖尿病患者OP的患病率和死亡率的增加可能部分是由于葡萄糖毒性、激素分泌紊亂、胰島素抵抗或缺乏、糖尿病引起的并發(fā)癥以及抗糖尿病藥物的影響所致的有害骨骼效應[2]。這可以通過骨密度(BMD)的變化來反映。BMD約占骨強度的70%，其個體差異的約70%歸因于遺傳影響[3]。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，患有T1DM的兒童，青少年和成人的BMD水平較低[4]?；加蠺2DM的個體顯示BMD沒有變化或適度增加[5]，但他們表現(xiàn)出與BMD無關的骨骼脆性。因此，潛在的致病機制需進一步研究，并且僅部分地通過BMD變異反映出來。Wnt配體(Wnts)在骨代謝調節(jié)中的重要性已得到很好的證實。Wnt受幾個分泌拮抗劑家族的調節(jié)，如硬化蛋白和dkk1。這些拮抗劑似乎主要由骨細胞合成。在成人中，硬化蛋白通常在骨細胞和晚期成骨細胞中表達。然而，dkk1在其他幾種組織中表達，如內皮細胞、神經(jīng)細胞和血小板[6-7]。在某些時候，循環(huán)硬化蛋白和dkk1水平的變化反映了骨髓血漿中相似程度的變化，這可能被認為是診斷T2DM患者OP的新標志物。這一發(fā)現(xiàn)和測量血液中硬化蛋白和dkk1水平確保了在T2DM患者在OP的生理和病理狀態(tài)中的作用的進一步研究。在本研究中我們的目的是分析男性和女性T2DM患者的血清硬化蛋白和dkk1水平，以研究這些拮抗劑與BMD和骨轉換標志物之間的關系，并確定它們在T2DM患者骨轉換中的確切作用。

1 材料和方法

1.1 一般臨床資料

本研究納入2017年6月至2018年6月在我院就診的190例2型糖尿病患者。所有患者均根據(jù)1999年WHO的糖尿病標準(空腹血糖≥7.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L)進行診斷。18名T1DM患者未納入研究。此外，患有以下病癥的患者被排除在研究之外：①嚴重的心臟、肝臟和腎功能不全(血清肌酐水平高于1.4 mg/dL定義為腎功能不全的患者)；②影響骨代謝的其他已知疾病(傳呼病、類風濕性關節(jié)炎、甲狀旁腺功能亢進癥、甲狀腺功能亢進癥或自身免疫性疾病)；③長期使用任何激素；④固定和長期吸煙(吸煙超過15年，每天超過15支)。

收集了有關參與者年齡、性別、身高和體重以及T2DM持續(xù)時間的數(shù)據(jù)。同時計算體質量指數(shù)(BMI)。使用標準實驗室技術，直接測量血清肌酐、糖化血紅蛋白(HbA1c)和空腹血糖(FPG)的水平。將早晨從經(jīng)過禁食過夜的受試者獲得的血清樣品儲存在-80 ℃直至進行骨重建標志物的檢查。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Cusabio，武漢 中國)測定血清硬化蛋白和dkk1水平。硬化蛋白和dkk1的測定內和測定間變異系數(shù)值(CV)分別小于8%且小于10%。使用放射免疫測定法(DIA sourceImmunoAssays S.A.，Louvain-la-Neuve，Belgium)測量25-羥基-維生素D 3(25OHD3)。測定內和測定間CV分別小于8.7%和7.3%。然后，對于骨轉換標志物，使用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Orion Diagnostica，Espoo)測量了1型前膠原氨基末端前肽(N-propeptide of type 1 collagen，P1NP)、1型膠原交聯(lián)羧基末端肽(C-terminal crosslinking telopeptides of type 1 collagen, 1CTP)的血清水平。P1NP的測定內和測定間CV分別為5.5%～9.5%和3.2%～9.6%。1CTP的測定內和測定間CV分別為5.6%～9.0%和3.5%～9.4%。使用雙能X射線吸收法測定腰椎(LS、L1-L4)，股骨近端(股骨頸(FN)和全髖(TH))的BMD。測量由同一操作員進行，以提供穩(wěn)定和可靠的結果，檢測的CV為1.73%。根據(jù)不同的BMD水平對患者進行分組：正常BMD組，骨量減少組和OP組。

本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有參與者均簽署書面知情同意書。

1.2 統(tǒng)計學處理

本研究使用SPSS 19.0來分析所有數(shù)據(jù)。連續(xù)變量的數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差，分類變量以數(shù)字表示。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗來驗證每個組作為整個隊列的變量的正態(tài)分布以及組內的男性或女性人群。然后，使用ANOVA或Kruskal-Wallis檢驗，在按性別劃分數(shù)據(jù)后，酌情比較各組間的定量變量。根據(jù)絕經(jīng)狀態(tài)(絕經(jīng)后婦女和絕經(jīng)前婦女)對女性受試者進行了分類，并比較了她們之間的所有變量。調整了年齡、性別和25OHD3，進行了序數(shù)邏輯回歸分析，以評估考慮骨量減少和OP存在的獨立危險因素。使用Pearson或Spearman的檢驗來驗證雙變量相關性分析。最后，使用多元線性回歸分析的逐步模型來分別識別血清P1NP或1CTP的獨立預測因子。所有模型都根據(jù)年齡、性別和BMI進行了調整。P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

表1顯示了研究人群的一般特征以及臨床和生化數(shù)據(jù)。除年齡外，三組在高度、體重、BMI、T2DM持續(xù)時間、血清肌酐、HbA1C和FPG方面具有可比性，即使在分別考慮不同性別。在我們的研究中共納入104名男性和86名女性。

觀察到整個隊列中三組中血清硬化蛋白、dkk1、25OHD3，P1NP和1CTP水平的差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且在調整性別后這些差異持續(xù)存在(見表1)。OP組的硬化蛋白、dkk1和1CTP水平顯著高于正常BMD組；正常BMD組25OHD3和P1NP的水平顯著高于骨量減少和OP組。除左側FN的BMD外，其他部位的絕經(jīng)前女性BMD明顯高于絕經(jīng)后女性(P<0.05)。絕經(jīng)前和絕經(jīng)后婦女均未顯示骨硬化蛋白、dkk1、25OHD3、P1NP或1CTP水平的差異(P>0.05)。

表1 研究人群的基線特征 Table 1 Baseline characteristics of the study population

調整了年齡、性別和25OHD3，使用BMD作為因變量和骨硬化蛋白和dkk1作為自變量，對三組的情況進行序數(shù)邏輯回歸分析，發(fā)現(xiàn)血清骨硬化蛋白水平與骨量減少和OP存在獨立相關，見表2中。

表2對骨量減少和骨質疏松癥獨立相關因子的序數(shù)邏輯回歸分析

Table2Ordinal logistic regression analysis (model) of factors independently associated with osteopenia and osteoporosis

項目Odds比95%置信區(qū)間P值骨硬化蛋白dkk1 25OHD 3 年齡1.0191.0360.8291.0431.005～1.0350.929～1.1580.551～0.7330.992～1.0910.0010.6850.0040.223

表3顯示了骨硬化蛋白、dkk1、25OHD3、BMD和骨代謝標志物之間的相關性。骨密度與骨硬化蛋白和dkk1血清水平呈負相關，而各部位的BMD與25OHD3呈正相關。在所有隊列中，年齡與硬化蛋白和dkk1水平呈正相關，與25OHD 3呈負相關。骨硬化蛋白和胰酶、BMI或FBG之間沒有相關性；dkk1和肌酐或FBG之間也沒有相關性。

表3血清硬化蛋白、dkk1、25OHD3水平與其他因子之間的雙變量相關性分析

Table3Bivariate correlation analyses between serum sclerostin/dkk1/25OHD3 levels and other factors

項目骨硬化蛋白dkk1 25OHD 3r值P值r值P值r值P值BMD LS-0.2890.003-0.2610.010 0.375<0.001BMD左股骨頸-0.522<0.001-0.660<0.001 0.427<0.001BMD右股骨頸-0.456<0.001-0.587<0.001 0.401<0.001BMD左髖-0.451<0.001-0.525<0.001 0.465<0.001BMD右髖-0.483<0.001-0.546<0.001 0.463<0.001年齡0.364<0.001 0.485<0.001-0.382<0.001T2DM持續(xù)時間0.3130.0010.411<0.001 -0.0900.223HbA1c 0.2450.0140.2230.0240.1350.118FBG0.1650.0520.1310.2010.1180.785BMI -0.1540.152-0.2040.0450.1430.956肌酐-0.050.125-0.0430.654-0.1020.856

在分析骨轉換標志物與其他生物因子之間的雙變量相關性后，觀察到P1NP與年齡、硬化蛋白和dkk1呈負相關，而與25OHD3、HbA1c和FPG呈正相關。同時觀察到1CTP與年齡、dkk1和骨硬化蛋白呈正相關，與25OHD3呈負相關，見表4。

表4P1NP/1CTP與其他生化數(shù)據(jù)之間的雙變量相關性分析

Table4Bivariate correlation analyses between P1NP/1CTP and the other biochemical data

項目P1NP1CTPr值P值r值P值骨硬化蛋白-0.2440.0130.348<0.001dkk1 -0.2950.0030.416<0.00125OHD 3 0.382<0.001-0.437<0.001年齡-0.376<0.001 0.3330.001T2DM持續(xù)時間-0.0320.5230.1030.056HbA1c 0.2540.011-0.0480.998FBG 0.2180.0310.1130.185BMI 0.0570.356-0.0110.078肌酐0.0870.552-0.0210.562

3 討論

我們的研究結果證實了血清骨硬化蛋白和dkk1在骨代謝中的作用，并提示血清硬化蛋白和dkk1抑制的Wnt信號通路參與了T2DM的骨重建。與之前的報道[4]一致，血清骨硬化蛋白和dkk1水平顯著增加，同時在2型糖尿病OP的情況下BMD降低，即使男性和女性被單獨考慮。在調整年齡、性別和25OHD3后，回歸分析發(fā)現(xiàn)骨硬化蛋白是2型糖尿病OP中骨量丟失的危險因素；多元逐步回歸分析證明了硬化蛋白在骨形成和dkk1參與骨吸收中的重要作用，這改善了與T2DM相關的骨量丟失的病理生理學知識，并為T2DM患者提供了更好的治療方法。

許多研究表明，糖尿病通過不同的機制影響骨代謝。越來越多的證據(jù)表明患有T1DM或T2DM的患者易患骨質疏松性骨折[8]。T2DM患者的BMD水平通常正?；蚋?，因此，T2DM增加骨骼脆性的機制仍不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)糖尿病OP患者的骨硬化蛋白和dkk1水平升高，這支持了Wnt受損導致T2DM患者骨脆性的假設。具有T2DM和低骨量的大鼠具有相當較高水平的血清骨硬化蛋白水平[9]，這再次證實了在T2DM患者中存在骨量丟失時血清硬化蛋白水平的增加。一項臨床試驗顯示，T2DM患者的血清硬化蛋白和dkk1水平高于健康人[4]?；貧w分析證實血清骨硬化蛋白水平與骨量減少或OP存在之間存在統(tǒng)計學上獨立的關聯(lián)。以前的研究報道，骨硬化蛋白和dkk1的水平在男性和女性中有所不同[10]，但我們的結果未發(fā)現(xiàn)差異。我們研究中的大多數(shù)人都超出了中年。在調整性別后，我們分別比較了男性和女性三組中硬化蛋白和dkk1以及其他因子的水平，結果相似。雖然對骨硬化蛋白和dkk1與BMD之間相關性的觀點存在爭議，但我們的研究結果顯示，血清骨硬化蛋白和dkk1水平與BMD的呈負相關。理論上，骨細胞是Wnt拮抗劑的主要來源之一，當它們處于不同的細胞狀態(tài)(即細胞凋亡和自噬)時，可能會發(fā)出不同的信號[11]。當T2DM患者發(fā)生骨量丟失時，由于代償機制，骨細胞數(shù)量首先增加，導致骨細胞分泌較高的硬化蛋白和dkk1。隨著疾病的進展，骨損傷減少了骨細胞的數(shù)量，導致較低的硬化蛋白和dkk1表達水平。另一種可能的解釋是研究人群中無法檢測到的混雜因素，這可能會影響硬化蛋白和dkk1的循環(huán)水平。此外，由于用于測量的不同ELISA試劑盒，血清中錫水平也可能發(fā)生變化[12]。

由成纖維細胞和成骨細胞合成的1型膠原蛋白是體內最豐富的膠原蛋白類型，是礦化骨中發(fā)現(xiàn)的唯一的膠原蛋白類型，其占有機基質的90%以上。骨是主要的膠原器官，在整個生命過程中代謝高度活躍；因此，大多數(shù)合成的1型膠原蛋白來源于成骨細胞[13]。在骨形成期間，骨基質在礦化發(fā)生之前產生；因此，P1NP作為I型膠原的典型類型，是骨形成的早期標志之一，并且已被選擇作為反映T2DM骨轉換的標志物[14]。1CTP是1型膠原的MMP依賴性降解產物，血清1CTP水平已被用作破壞性骨病變的標志物。在我們的研究中，P1NP與硬化蛋白和dkk1的水平呈負相關。在多元回歸分析中，硬化蛋白與P1NP的負相關仍然顯著。同時研究還發(fā)現(xiàn)1CTP與dkk1和硬化蛋白的正相關，多元回歸分析顯示dkk1在骨吸收中發(fā)揮作用，我們證實dkk1影響了T2DM患者的骨吸收。

在我們的研究中，絕經(jīng)后女性的BMD低于絕經(jīng)前女性，支持性雌激素在維持骨骼完整性方面的重要性。然而，絕經(jīng)前和絕經(jīng)后婦女的骨硬化蛋白、dkk1、25OHD3、P1NP或1CTP水平?jīng)]有差異?？赡苁切颖緶p弱了雌激素對骨轉換標志物的影響。年齡也與硬化蛋白和dkk1呈正相關，此前已有報道[15]。此外，我們發(fā)現(xiàn)硬化蛋白水平與dkk1和T2DM持續(xù)時間呈正相關。一些假設推測長期高血糖對骨細胞和成骨細胞有不利影響，成骨細胞直接葡萄糖毒性，以及維生素D減少DM患者發(fā)生的變化。我們還發(fā)現(xiàn)25OHD 3和骨硬化蛋白和dkk1之間存在負相關，發(fā)現(xiàn)血清25OHD 3水平與任何區(qū)域BMD和P1NP水平呈正相關，但與1CTP呈負相關，提示25OHD 3水平影響糖尿病骨代謝。

本研究也有其不足之處，首先在我們的研究中，觀察了不同年齡和性別的T2DM患者血清硬化蛋白水平的變化，然而，抗糖尿病藥物對血清硬化蛋白水平的影響需要進一步探索。其次，骨折風險沒有與BMD一起評估。第三，樣本量很小，必須進行額外的大樣本實驗或臨床研究，這對于更好地了解T2DM患者的OP原因以及檢查其治療意義的潛力尤為重要。這可以提供使用針對硬化蛋白或dkk1的單克隆抗體來預防T2DM患者的OP的基礎。

總之，硬化蛋白和dkk1在T2DM患者的骨脆性中起重要作用。首先，隨著骨量減少，血清中硬化蛋白和dkk1的水平顯著增加，表明受損的Wnt可能是T2DM患者骨量丟失的原因。其次，sclerostin/dkk1與BMD在腰椎、FN和TH之間的負相關性表明，檢測血清硬化蛋白/dkk1水平可預測T2DM患者的骨量減少。第三，硬化蛋白水平影響骨形成，dkk1水平參與骨吸收。