長白落葉松4CL基因單核苷酸多態(tài)性及其與木材材性的關(guān)聯(lián)分析

王艷紅 賈慶斌 張 磊 張含國*

(1.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040； 2.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱 150030)

* 通信作者：E-mail:hanguozhang1@sina.com

長白落葉松4CL基因單核苷酸多態(tài)性及其與木材材性的關(guān)聯(lián)分析

王艷紅1,2賈慶斌1張 磊1張含國1*

(1.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱 150030)

為探討長白落葉松4CL基因多態(tài)性與木材材性及生長性狀的關(guān)系，本研究以10個種源的長白落葉松為實驗材料，采用直接測序方法開展4CL基因多態(tài)性檢測，共檢測到64個SNPs，SNP頻率為1/31 bp，多樣性指數(shù)πT值為0.015 77，θW值為0.008 78。同義突變核苷酸多樣性(πsyn=0.022 56)是非同義突變核苷酸多樣性(πnonsyn=0.015 75)的1.4倍，推測長白落葉松4CL基因編碼區(qū)在長白落葉松物種演化過程中受到純化選擇壓力的作用。對頻率大于10%的27個常見SNP的單位點和單倍型分別于長白落葉松木材材性和生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，檢測到7個SNPs和6個單倍型的與木材材性和生長性狀顯著關(guān)聯(lián)，表型貢獻率為0.09%～2.08%。研究結(jié)果為基于分子標記的長白落葉松優(yōu)良木材品質(zhì)及生長性狀定向輔助育種提供理論依據(jù)。

長白落葉松；木質(zhì)素；4CL基因；SNPs；單倍型

長白落葉松(Larixolgensis)是溫帶和寒帶山區(qū)非常重要的荒山造林樹種和紙漿用材樹種，具有生長快、適應(yīng)性強、經(jīng)濟價值高等優(yōu)點[1～2]。木材中木質(zhì)素約占其干重的15%～36%，是僅次于纖維素的大分子有機物。主要分布在輸導組織、機械組織和保護組織細胞次生壁中，起機械支持、水分運輸及病蟲害防御等重要作用[3～5]。在造紙業(yè)制漿造紙過程中，高木質(zhì)素含量的木材會增加制漿造紙過程的成本與消耗，帶來嚴重的環(huán)境污染[6]，而木材中木質(zhì)素的含量和構(gòu)型將直接影響制漿造紙過程中發(fā)酵產(chǎn)物乙醇轉(zhuǎn)化率和紙漿得率[7]。因此，木質(zhì)素生物合成機制及木質(zhì)素含量(組成)的基因調(diào)控一直是國內(nèi)外關(guān)注和研究的熱點[8]。

木質(zhì)素的合成途徑十分復雜[9]，目前普遍認為可分為3個主要途徑：(1)由植物光合作用初級產(chǎn)物葡萄糖生成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等的莽草酸途徑；(2)從苯丙氨酸到肉桂酸及其?；o酶A酯的苯丙烷類代謝途徑；(3)從肉桂酰輔酶A酯還原為木質(zhì)素單體以及聚合生成木質(zhì)素的木質(zhì)素合成特異途徑[10～11]。其中4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)，為苯丙烷類代謝途徑最后一個酶，也是該途徑的限速酶[12]，它催化羥基香豆酸生成相應(yīng)的羥基硫酯。人們最早在擬南芥、煙草、美洲山楊三種植物進行了4CL表達活性的研究[13～15]。到目前為止，已從擬南芥、楊樹、大豆、煙草等10多種植物中克隆出4CL基因[16]。大量研究表明，抑制4CL基因的表達可以降低木質(zhì)素含量，且不影響植物生長。Hu等在抑制4CL基因表達的轉(zhuǎn)基因美洲山楊中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中木質(zhì)素含量下降了45%，纖維素含量上升15%，木質(zhì)素纖維素總量沒變[15]。Li等將反義4CL基因轉(zhuǎn)入美洲山楊中，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量下降52%，S/G比率上升了64%，纖維素含量上升30%[17]。Emmanuel等年研究發(fā)現(xiàn)在火炬松中下調(diào)4CL基因會使木質(zhì)素含量下降纖維素含量上升[18]。Tian等利用正義、反義和RNAi-4CL基因轉(zhuǎn)入毛白楊中，結(jié)果表明轉(zhuǎn)入反義4CL1基因的植株木質(zhì)素含量下降了28.52%，且植物生長沒有負面影響[19]。因此4CL基因是較為理想的用于改良造紙資源植物的目標基因。

單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms,SNPs)是真核生物中最常見的遺傳變異形式，基于SNP多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析研究對挖掘與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)的功能標記位點，提高重要性狀早期測定的精確度和可靠性，縮短林木育種周期，制定林木育種方案具有非常重要的作用，因此基于SNP多態(tài)性的關(guān)聯(lián)分析研究在較短時間內(nèi)獲得了快速的發(fā)展。目前，關(guān)聯(lián)遺傳學已在楊樹[20～21]、桉樹[22]和火炬松[23]等樹種中取得了初步進展。Gonzalez-Martinez等在火炬松4CL基因中發(fā)現(xiàn)SNPM5與木質(zhì)素含量相關(guān)[23]。Thumma等在桉樹EniCOBL4A(COBRA-like gene)基因第5外顯子上發(fā)現(xiàn)同義突變SNP與纖維素含量顯著相關(guān)[24]，Dillon等在輻射松PAL1(Phenylalanine ammonia lyase)基因上發(fā)現(xiàn)同義突變SNP(SNP60)與木材密度性狀顯著關(guān)聯(lián)[25]；國內(nèi)，田佳星發(fā)現(xiàn)毛白楊PtUGDH(UDP-glucose dehydrogenase)基因5′UTR上的SNP7與毛白楊纖維素含量顯著相關(guān)[20]。

本研究選用黑龍江省尚志市帽兒山鎮(zhèn)1982年定植的長白落葉松第二次種源試驗林為研究對象，共4個區(qū)組，10個種源240株個體。利用DNA直接測序法研究分析了長白落葉松4CL基因的遺傳多樣性，同時采用連鎖不平衡分析構(gòu)建了4CL基因中27個常見SNPs的單倍型，將單位點和單倍型分別于長白落葉松木材材性和生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，以期篩選出對長白落葉松重要經(jīng)濟性狀具有顯著效應(yīng)的的SNPs，為長白落葉松的高效選育和分子標記數(shù)據(jù)庫的建立、種質(zhì)資源保護和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實驗材料來自黑龍江省尚志市帽兒山鎮(zhèn)長白落葉松種源試驗林(44°29′～45°34′N；127°17′～129°12′E)，1980年在露水河、天橋嶺等10個種源(地點)采種，1981年育苗，1982年造林，完全隨機區(qū)組五次重復，每區(qū)組10個種源(1大石頭、2露水河、3天橋嶺、4白河、5和龍、6穆棱、7大海林、8小北湖、9白刀山、10雞西樺木)，每個種源60株，共3 000株。1995年進行隔行去行間伐，2001年進行隔1株去2株間伐。現(xiàn)該種源試驗林共有500株個體。本實驗從5個區(qū)組中選取了4個區(qū)組，每種源10個單株中選了6個個體，共240個個體為研究對象。于2011年6月底采取當年生嫩葉(松針)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2010年對這240棵單株進行了表型性狀：木質(zhì)素(lignin，%)、纖維素(cellulose，%)、樹高(height，m)、胸徑(DBH，cm)、密度(density，g·cm-3)、材積(volume，m3)、冠幅(crown，m)、碳儲量(CB，kg)、含碳率(CCR，%)的測定，建立表型數(shù)據(jù)庫。木質(zhì)素含量參照國家標準GB/T 2667.8-94進行測定[26]；綜纖維素含量參照國家標準GB/T 2667.10-95進行測定[27]；含碳率利用德國耶拿分析儀器股份公司，碳元素分析儀multi EA 4000進行測定，碳儲量根據(jù)含碳率進行計算[28]。

1.2 引物設(shè)計與基因克隆

根據(jù)興安落葉松4CL基因(Accession No.EU280849.1)和火炬松4CL基因(Accession No.U12013.1)設(shè)計引物4CL a1、a2、b1、b2，擴增4CL基因片段，并克隆測序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫Nucleotide Blast功能和DNAMAN(http://www.mbio.ncsu.edu/dnaman/dnaman.html)等軟件對測序結(jié)果進行同源性比對。根據(jù)比對結(jié)果重新設(shè)計引物。以240個單株的基因組DNA為模板，擴增4CL基因。序列拼接、氨基酸序列相似性比較利用DNAMAN軟件；物種間分子系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建利用MEGA 6.01軟件[29]。上述引物合成及測序工作均由上海生工完成。

1.3 基因分型

同一基因不同個體序列用BioEdit軟件(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)和Clustal軟件(http://www.mbio.ncsu.edu/Clustal/Clustal.html)聯(lián)合比對分析，結(jié)合每條序列測序峰值圖，根據(jù)測序結(jié)果進行基因分型，純合體為單峰，雜合子為套峰(圖1)?；蛐兔绞綖椋和蛔冃陀猛蛔兦昂髩A基命名，例如T到C的突變，則基因型表示為：TT、CC、TC型；插入缺失型用D(Dleate)、I(Insert)表示，即基因型表示為：DD、II、ID型。

圖1 基因分型Fig.1 Genetype

1.4 核苷酸多樣性分析

測得核苷酸序列用Dnaman和Bioedit軟件進行分析，標計SNPs位點、計算SNPs轉(zhuǎn)換和顛換的數(shù)量。采用DnaSP5.1軟件(http://www.ub.edu/dnasp)估算個基因的核苷酸多樣性和中性檢驗[30～31]，同時計算沉默位點多樣性(πsil)、同義突變多樣性(πsyn)和非同義突變多樣性(πnonsyn)。每個基因的單倍型數(shù)量(h)和單倍型多樣性水平(Hd)在DnaSP5.1中采用Nei的方法進行[32]。

1.5 連鎖不平衡程度分析(LD分析)

連鎖不平衡程度分析利用Haploview4.2軟件(http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview.html)，單倍型塊的劃分采用D′值95%置信區(qū)間在0.70～0.98的相鄰SNP被歸入同一個單倍型塊。

1.6 關(guān)聯(lián)分析

本研究采用分析軟件JMP5.0的一般線性模型[33]和分析軟件TESSAL5.0的GLM程序[21]分別進行基因型和表型性狀的關(guān)聯(lián)分析。將27個SNP單位點和25個單倍型分別與樹木生長性狀(樹高、胸徑、冠幅、材積)及木材材性性狀(木質(zhì)素、纖維素、密度、含碳率、碳儲量)進行關(guān)聯(lián)分析。單倍型構(gòu)建采用滑窗方法，每3個SNPs構(gòu)成一個窗口，每次向前滑動一個SNP(圖2)，每個單倍型用SAS9.1.3 HAPLOTYPE程序構(gòu)建[33]。經(jīng)試驗，2、3、4個位點為一組沒有顯著區(qū)別，所以我們最終選擇3個位點為一組(圖2)。

圖2 4CL基因單倍型構(gòu)建Fig.2 Haplotypes constructed in 4CL gene

2 結(jié)果

2.1 相似性比較與進化樹分析

根據(jù)興安落葉松、火炬松4CL基因設(shè)計引物，擴增長白落葉松總DNA，得到大小約為584、403、560和595 bp的四條特異性擴增條帶，經(jīng)序列拼接得到片段大小為2 009 bp的4CL基因DNA序列，由142 bp的5′UTR，993 bp的外顯子1(exon 1)，82 bp的內(nèi)含子(intron)，620 bp的外顯子2(exon 2)和172 bp的3′UTR組成。經(jīng)分析，4CL基因含有大小為1 613 bp的完整開放閱讀框，可編碼含有537個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。將長白落葉松4CL基因氨基酸序列與GenBank中已報道的其他物種相應(yīng)序列對位排列比較(圖3)。可以清楚地看出，長白落葉松與火炬松(Pinustaeda)、毛果楊(Populustrichocarpa)、棉花(Gossypiumhirsutum)、大豆(Glycinemax)、苜蓿(MedicagotruncTUBAla)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)4CL的結(jié)構(gòu)高度一致，都具有共有基序BoxⅠ和BoxⅡ結(jié)構(gòu)[34](圖3)。

圖3 長白落葉松4CL與其它物種4CL氨基酸序列比對結(jié)果 Box結(jié)果標為灰色Fig.3 Alignment of deduced amino acid of 4CL from L.olgensis and other species Box is labelled in grey.

分子進化樹分析表明，4CL氨基酸由極點向2個方向發(fā)生了進化，所有的裸子植物被聚類到第一分支上，被子植物中的雙子葉植物被聚類在第二分支上，唯獨被子植物中的單子葉水稻(Oryzasativa)單獨在一個分支上，第一分支分為2個亞分支，第一亞分支分為三個部分，落葉松(Larixolgensis)和花旗松(Pseudotsugamenziesii)被聚類到第一部分，第二部分為云杉(Piceasmithiana)，第三部分包括火炬松(Pinustaeda)和華山松(Pinusarmandii)，；第二亞分支上包括雪松(Cedrusatlantica)、云南油杉(Keteleeriaevelyniana)、冷衫(Abiesholophylla)、加拿大鐵杉(Tsugacanadensis)，而銀杉(Cathayaargyrophylla)不屬于任何亞分支，為單獨一個亞分支。第二分支上包括雙子葉植物大豆(Glycinemax)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、毛果楊(Populustrichocarpa)、苜蓿(MedicagotruncTUBAla)、黃瓜(Cucumissativus)，說明長白落葉松與花旗松的親緣關(guān)系較近(圖4)。

2.2 SNPs的發(fā)現(xiàn)

經(jīng)Bioedit軟件對240個測序結(jié)果比對，共發(fā)現(xiàn)64個SNPs出現(xiàn)頻率超過1%，平均每31 bp序列出現(xiàn)1個SNP；其中出現(xiàn)頻率超過10%的常見SNP27個。這27個SNP中共發(fā)生16次轉(zhuǎn)換突變，占總數(shù)的59.3%，11次顛換突變，占總數(shù)的40.7%，非同義突變6次，同義突變19次(表1)。

圖4 各物種的4CL氨基酸序列UPGMA系統(tǒng)進化樹Fig.4 UPGMA phylogenetic tree analysis based on amino acid sequence of 4CL from different species

基因Gene長度LSNP數(shù)SNPs常見SNP數(shù)CommonSNPsSNP頻率Frequency(bp)編碼區(qū)SNPCodingregions靜默SNPSilentSNP非同義SNP數(shù)Non-synonSNPs同義SNP數(shù)SynonSNPs顛換Transversion轉(zhuǎn)換Transition4CL200964273125216191116

表2 長白落葉松4CL基因核苷酸多樣性

圖5 4CL基因連鎖不平衡分析Fig.5 The LD analysis of 4CL

2.3 多態(tài)性檢測結(jié)果及基因型頻率分析

以長白落葉松4CL基因中發(fā)現(xiàn)的64個SNP為基礎(chǔ)計算核苷酸多樣性，發(fā)現(xiàn)其具有較高的SNP多態(tài)性，πT值為0.015 77，θW值為0.008 78(表2)。平均沉默多樣性(πsil=0.006 13)和非同義多樣性(πnonsyn=0.015 75)水平均低于平均同義多樣性(πsyn=0.022 56)。同義突變核苷酸多樣性是非同義突變核苷酸多樣性的1.4倍，推測長白落葉松4CL基因編碼區(qū)在長白落葉松物種演化過程中受到純化選擇壓力的作用。

2.4 連鎖不平衡分析

Haploview4.2分析結(jié)果表明4CL基因SNP間連連鎖不平衡程度較強，R2平均值為0.4826，27個SNP標記分為4個單倍型模塊，分別為模塊SNP1-2，SNP3-9，SNP13-14和SNP15-27(圖5)。

2.5 單位點SNP與木材材性、生長性狀關(guān)聯(lián)分析

利用分析軟件JMP5.0對單個位點與表型性狀進行關(guān)聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)14個關(guān)聯(lián)位點與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)，詳見表3：其中SNP32、SNP41、SNP44、SNP45、SNP47、SNP51和SNP55不同基因型與木質(zhì)素含量性狀顯著關(guān)聯(lián)；SNP45不同基因型與胸徑性狀顯著關(guān)聯(lián)；SNP41不同基因型與樹高性狀顯著關(guān)聯(lián)；SNP47和SNP55與密度性狀顯著關(guān)聯(lián)；SNP32、SNP41和SNP51不同基因型與碳儲量性狀顯著關(guān)聯(lián)。多重比較分析結(jié)果詳見圖6。

2.6 4CL單倍型與木材材性、生長性狀關(guān)聯(lián)分析

將構(gòu)建的25個單倍型與長白落葉松木材材性及生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)6個單倍型的與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)，分別為：窗口SNP51-53的單倍型多態(tài)性與長白落葉松木質(zhì)素含量性狀顯著關(guān)聯(lián)，窗口SNP41-43的單倍型多態(tài)性與長白落葉松樹高性狀顯著關(guān)聯(lián)，窗口SNP47-49的單倍型多態(tài)性與長白落葉松密度顯著關(guān)聯(lián)，窗口SNP32-34、SNP40-42和SNP51-53的單倍型多態(tài)性與長白落葉松碳儲量顯著關(guān)聯(lián)(表4)。

表34CL基因單個SNP位點與長白落葉松木材材性及生長性狀關(guān)聯(lián)分析(P值)

Table3Associationanalysisofsingle-nucleotidepolymorphismsinthe4CLgenewithwoodqualityandgrowthtraitsinL.olgensis(p-value)

標記Marker性狀TraitP值Pvalue表型貢獻率Phenotypicvariance(%)SNP32s木質(zhì)素Lignin0.0401*1.98SNP41s木質(zhì)素Lignin0.0347*2.73SNP44ns木質(zhì)素Lignin0.0462*1.48SNP45s木質(zhì)素Lignin0.0410*1.33SNP47s木質(zhì)素Lignin0.0462*1.31SNP51s木質(zhì)素Lignin0.0407*2.08SNP55ns木質(zhì)素Lignin0.0460*0.56SNP45s胸徑DBH0.0494*2.05SNP41s樹高Height0.0422*0.35SNP47s密度Density0.0242*1.53SNP55ns密度Density0.0407*1.72SNP32s碳儲量Carbonstorage0.0442*0.37SNP41s碳儲量Carbonstorage0.0456*0.43SNP51s碳儲量Carbonstorage0.0477*0.09

注：*表示影響顯著P<0.05。

Note:*Significant at theP<0.05 level.

圖6 4CL基因SNPs對長白落葉松木材材性及生長性狀的基因型效應(yīng)Fig.6 SNPs genotypic effects on wood properties and growth traits of L.olgensis

性狀TraitP值Pvalue單倍型Significanthaplotypes單倍型頻率Frequency標記SNP性狀TraitP值Pvalue單倍型Significanthaplotypes單倍型頻率Frequency標記SNP木質(zhì)素Lignin0.0475SNP51-53C-C-C0.458C-T-C0.031C-T-T0.435T-T-T0.076SNP51樹高Height<0.0001SNP41-43A-C-C0.107A-T-T0.015G-C-C0.397G-C-T0.023G-T-T0.458SNP41密度Density0.0443SNP47-49C-G-A0.527C-T-A0.015C-T-G0.267T-G-A0.008T-T-G0.183SNP47碳儲量Carbonstorage<0.0001SNP32-34SNP40-42SNP51-53A-A-T0.252C-A-C0.015C-A-T0.214C-G-C0.511C-G-T0.008A-A-C0.107A-G-C0.420G-A-T0.015G-G-T0.458C-C-C0.458C-T-C0.031C-T-T0.435T-T-T0.076SNP32SNP41SNP51

3 討論

3.1 多態(tài)性分析

4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumarate:CoA ligase，4CL)基因，為木質(zhì)素苯丙烷類代謝途徑中最后一個酶，也是該途徑限速酶[12]，它催化羥基香豆酸生成相應(yīng)的羥基硫酯。本研究從10個種源240個單株中克隆得到候選基因目的片段，經(jīng)DNASP軟件分析發(fā)現(xiàn)長白落葉松具有較高多態(tài)性，πT值為0.015 77，θW值為0.008 78。與前人研究相比，長白落葉松4CL基因SNP的密度稍高于玉米(π=0.010 25)[35]。單倍型多樣性(HD=0.921)也高于其他樹種的觀測值，如Pot等在輻射松(HD=0.425)[36]，Gonzalez-Martinez等在火炬松(HD=0.68)[23]，Mandrou等在尾葉桉(HD=0.853)中的發(fā)現(xiàn)[37]。說明長白落葉松實驗群體10個種源間存在遺傳結(jié)構(gòu)的差異性。

3.2 關(guān)聯(lián)分析

目前，林木中關(guān)于木質(zhì)素合成相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)分析的研究有很多，但國內(nèi)針對長白落葉松4CL基因關(guān)聯(lián)分析的報道很少。本研究對頻率大于10%的27個常見SNP的單位點和單倍型分別于長白落葉松木材材性和生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，檢測到7個SNP(32、41、44、45、47、51和55)位點與木材材性和生長性狀顯著關(guān)聯(lián)，其中4個SNP(32、41、47、和51)所在單倍型同樣與表型性狀顯著關(guān)聯(lián)。

SNP51與木質(zhì)素含量和木材碳儲量顯著關(guān)聯(lián)，表型貢獻率為2.08%和0.09%，擁有TT基因型的個體比CC基因型個體木質(zhì)素含量更低、碳儲量更高。與前人的研究相比，Emmanuel等年研究發(fā)現(xiàn)在火炬松中下調(diào)4CL基因會使木質(zhì)素含量下降而纖維素含量上升[18]，Tian研究發(fā)現(xiàn)在楊樹中上調(diào)或下調(diào)4CL1基因可以改變木質(zhì)素含量和組成[19]，Gonzalez-Martinez等年在4CL基因中發(fā)現(xiàn)SNPM5與木質(zhì)素含量相關(guān)[23]，本研究在關(guān)聯(lián)性上與以上報道大體一致。

SNP47與木材密度顯著相關(guān)，表型貢獻率為2.50%，其TT基因型密度(0.408 4±0.006 6 g·cm-3)顯著高于CC基因型密度含量(0.390 4±0.003 2 g·cm-3)。與前人的研究相比，Gonzalez-Martinez等在火炬松中發(fā)現(xiàn)4CL基因的SNPM3和SNPM7與早材的密度相關(guān)聯(lián)[23]。以往的研究也在針葉樹其他參與木質(zhì)素合成的基因中發(fā)現(xiàn)與木材密度相關(guān)聯(lián)的SNPs。Yu在火炬松雜交樹中發(fā)現(xiàn)CAD-n1基因與木材密度相關(guān)聯(lián)的[38]，同樣González-Martínez等對北美重要栽培樹種火炬松四個基因(CAD，sams-2，lp3-1和a-tubulin)與不同木材材性性狀進行了關(guān)聯(lián)分析，找到9個SNP與木材材性性狀相關(guān)，其中位于CAD基因的SNPM28與早材密度相關(guān)聯(lián)[23,39]；Dillon年在輻射松中發(fā)現(xiàn)CAD基因和COMT2基因同樣與早材和晚材的密度相關(guān)聯(lián)[25]，作者在長白落葉松CAD基因中發(fā)現(xiàn)SNP7和SNP15兩個SNP與木材密度顯著關(guān)聯(lián)[32]。

SNP41與樹高和碳儲量性狀的顯著關(guān)聯(lián)，表型貢獻率分別為0.35%和0.43%，多重比較分析結(jié)果表明，SNP41的GG基因型樹高(13.601 6±0.181 1 m)顯著高于AA基因型樹高(12.814 9±0.487 0 m)，AA基因型木材碳儲量(63.703 5±1.701 7 kg)顯著高于GG基因型木材碳儲量(63.398 3±1.004 9 kg)。而SNP32與碳儲量性狀顯著關(guān)聯(lián)，表型貢獻率為0.37%；多重比較分析結(jié)果表明SNP32的AA基因型木材碳儲量(64.489 5±1.892 5 kg)顯著高于CC基因型木材碳儲量(63.178 6±1.090 9 kg)。

上面四個SNP均為同義突變，盡管同義突變不會導致氨基酸的改變，但能通過其單核苷酸多態(tài)性的變化導致翻譯提前終止從而引起一系列的生物學效應(yīng)，從而改變基因的表達力間接影響蛋白表達[40～41]。Thumma等在EniCOBL4A基因外顯子5上的同義突變SNP與纖維素含量顯著相關(guān)[24]，Dillon等在輻射松PAL1基因上發(fā)現(xiàn)同義突變SNP(SNP60)與木材密度性狀顯著關(guān)聯(lián)[25]。說明SNPs同義突變在與表型性狀的關(guān)聯(lián)分析中是有意義的。

長白落葉松為落葉松人工林主栽樹種，廣泛分布于黑龍江省東南部，吉林東部長白山地區(qū)以及遼寧省。長白落葉松人工林具有生長迅速、成林快、適應(yīng)性廣等優(yōu)點，是我國東北地區(qū)重要造林、紙漿材和建筑材樹種。候選基因的選擇對優(yōu)良木材材性及生長性狀的培育具有重要意義，本研究將4CL基因作為選育有利于造紙工業(yè)脫木質(zhì)素的長白落葉松優(yōu)良植株的重要候選基因，對基因的多態(tài)性及關(guān)聯(lián)分析將為基于分子標記的長白落葉松優(yōu)良木材品質(zhì)定向輔助育種提供理論依據(jù)。

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AllelicVariationin4-coumarate:CoAligase(4CL)AssociatedwithWoodPropertiesofLarixolgensis

WANG Yan-Hong1,2JIA Qing-Bin1ZHANG Lei1ZHANG Han-Guo1*

(1.Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology,Northeast Forestry University,Harbin 150040；2.College of Animal Science and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030)

We used 10 provenances ofLarixolgensisto study the effects of polymorphism of 4CL gene on wood quality and growth traits inL.olgensis. The polymorphism in 4CL gene was identified using DNA sequencing, 64 mean SNPs were identified,the median SNP frequency was one site per 31 bp,and the average nucleotide diversity for the sequenced regions was calculated to beπT=0.015 77 andθW=0.008 78. The diversity level of synonymous nucleotide sbustituons(πsyn=0.022 56) was 1.4 of nonsynoymous nucleotide substitutions(πnonsyn=0.015 75), suggesting that the gene misht be evolved under purifying selection at the synonoymous sites of the coding region inL.olgensis. The association between the 27 common SNPs(frequency>10%), haplotypes and wood quality and growth traits were analyzed respectively, indicating that 7 SNPs and 6 haplotypes were significantly associated with wood quality and growth traits, explaining between 0.09%-2.08% of the phenotypic variance. Ourstudy provided an important genetic foundation for molecular marker-assistant selection breeding programs with the goals of improving the wood quality and growth products inL.olgensis.

Larixolgensis;lignin;4CL gene;SNPs;haplotype

國家863課題“落葉松優(yōu)質(zhì)、抗逆基因工程育種”(2013AA102704-04)

王艷紅(1980—)，女，博士研究生，主要從事林木遺傳育種方面的研究。

2015-09-29

S791.22

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.02.013