白蛋白的功能化載體研究及臨床應(yīng)用*

吳藝舟 陳雨佳,2 沈義凱,3 馮翮飛 孫 杰

南京醫(yī)科大學 1 基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞生物學系 2 第一臨床醫(yī)學院2016級八年制臨床醫(yī)學 3 2017級八年制臨床醫(yī)學 4 護理學院2016級護理學，江蘇省南京市 211166； 5 南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評價與研究中心

白蛋白是人血清中含量最多的蛋白質(zhì)，在成年人血液中達到40～55g/L，其功能主要維持血液的正常滲透壓和運輸小分子物質(zhì)。在傳統(tǒng)臨床應(yīng)用中，白蛋白主要作為血漿容量擴充劑廣泛用于出血、休克、燒傷、惡性腫瘤、紅白細胞增多癥等治療。近年來隨著冷凍電鏡等技術(shù)的蓬勃發(fā)展，白蛋白的高級空間結(jié)構(gòu)得以深入研究，尤其在結(jié)合小分子物質(zhì)方面。最新報道顯示白蛋白具有多種可調(diào)節(jié)的分子結(jié)合位點，能夠進行化學或物理修飾，有望開發(fā)成為綠色安全的新型納米藥物載體。

1 白蛋白的高級空間結(jié)構(gòu)

人血清白蛋白(Human serum albumin)含有35個半胱氨酸，形成17對二硫鍵和1個自由的半胱氨酸。白蛋白由三個同源結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ成90°直角，結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ成45°(圖1)。每個結(jié)構(gòu)域又分為A、B兩個子域，兩個子域均由4～6個α螺旋結(jié)構(gòu)組成[1-2]。不同物質(zhì)與白蛋白的結(jié)合位置不同，可以通過選擇性水解白蛋白產(chǎn)生的片段與配體結(jié)合的方法，研究白蛋白與配體的結(jié)合位點。在目前已發(fā)現(xiàn)的這些結(jié)合位點中，位于結(jié)構(gòu)域ⅡA(Drug Site 1，結(jié)合口袋Ⅰ)和結(jié)構(gòu)域ⅢA(Drug Site 2，結(jié)合口袋Ⅱ)的兩個口袋狀結(jié)合位點作用最為廣泛(圖1)。口袋的結(jié)合特異性基本取決于它們的形狀以及極性殘基在疏水性口袋內(nèi)壁上的特定分布，同時也與電荷中和、氫鍵相互作用有關(guān)[3]。

結(jié)合口袋Ⅰ是水楊酸鹽、膽紅素、磺胺藥物及其他多種藥物的結(jié)合位點(圖1)。由于所結(jié)合的配體均為大分子，所以這一口袋結(jié)構(gòu)相對較大，彈性極好，甚至可以同時結(jié)合2個不同的配體[4]。結(jié)合口袋Ⅰ位于結(jié)構(gòu)域ⅡA核心處，包含了全部6個α螺旋結(jié)構(gòu)和1個結(jié)構(gòu)子域IB的環(huán)形螺旋結(jié)構(gòu)[3]。由1個中心區(qū)域形成大結(jié)合腔，從其中延伸出3個不同的子室，這3個不同的子室可結(jié)合不同的藥物。右側(cè)的子室可結(jié)合苯巴比妥、華法林等，左側(cè)子室可結(jié)合苯基丁烷和CMPF(3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸)，而前側(cè)子室可結(jié)合氧吩丁酮和華法林。結(jié)合位點Ⅰ的入口由結(jié)構(gòu)子域ⅡB和ⅢA所包圍，這些子域的氨基酸殘基有助于結(jié)合吲哚美辛，并容納碘帕胺、苯丁酮和華法林等[3]。

結(jié)合口袋Ⅱ是甲狀腺素、色氨酸和雙氟尼、安定、布洛芬等一些藥物的結(jié)合位點，其空間結(jié)構(gòu)小于結(jié)合口袋Ⅰ(圖1)。結(jié)合口袋Ⅱ是由結(jié)構(gòu)子域ⅢA的全部6個α螺旋結(jié)構(gòu)組成，還包括1個預(yù)先形成的極性疏水腔。結(jié)合口袋Ⅱ主要的藥物結(jié)合區(qū)域?qū)?yīng)結(jié)合口袋Ⅰ的中央部分。與結(jié)合位點Ⅰ相比，結(jié)合位點Ⅱ的入口處無阻礙，更容易暴露在溶劑中，有利于藥物結(jié)合[3]。除了上述兩個主要的結(jié)合口袋外，白蛋白的結(jié)構(gòu)子域ⅠB和ⅢB等結(jié)構(gòu)上也存在如保泰松等藥物結(jié)合位點。

2 參與生物分子代謝

白蛋白是一種非特異性的運輸?shù)鞍祝隗w內(nèi)能與許多難溶性的小分子有機物和無機離子可逆地結(jié)合形成易溶性的復(fù)合物，從而提高藥物的溶解率、降低生物毒性，因此白蛋白是一種天然的運輸載體。白蛋白參與膽固醇的代謝過程，膽固醇可分別與白蛋白的結(jié)合口袋Ⅰ和結(jié)合口袋Ⅱ結(jié)合[5]。分子一側(cè)帶有負電荷的酸性基團的芳香性羧酸，如L-色氨酸、甲狀腺素等可與結(jié)構(gòu)域Ⅱ結(jié)合[6]。甲狀腺素可與白蛋白的結(jié)構(gòu)域ⅡA、ⅢA和ⅢB中的4個位點結(jié)合，而脂肪酸可與甲狀腺素競爭結(jié)合這些位點。此外脂肪酸在與白蛋白結(jié)合后還能進一步誘導(dǎo)后者的結(jié)構(gòu)改變，產(chǎn)生第5個結(jié)合位點與甲狀腺素結(jié)合[7]。

圖1白蛋白空間結(jié)構(gòu)和藥物結(jié)合位點

3 參與藥物分子代謝

能夠與白蛋白結(jié)合的藥物分子非常多，其相互作用主要由四種類型組成:疏水相互作用、氫鍵、范德華力和靜電相互作用[8]。結(jié)合口袋Ⅰ識別二羧酸及分子中心帶有負電荷的體積較大的雜環(huán)分子如青霉素等，也識別其他藥物如法華林、保泰松、呋塞米、鞣花酸等(圖1)。結(jié)合口袋Ⅱ識別萘普生、布洛芬、地西泮、氯貝丁酯等(圖1)。此外,利多卡因和夫西地酸等主要結(jié)合在結(jié)構(gòu)子域IB[3]。

4 參與納米藥物的靶向傳遞

白蛋白納米藥物是以白蛋白作為載體包封或吸附藥物，經(jīng)固化分離而形成的實心球體。目前以白蛋白為載體的藥物蛋白偶聯(lián)物大多是在交聯(lián)劑的作用下通過藥物或其衍生物與白蛋白的游離氨基相連接，例如臨床最早使用的氨甲蝶呤白蛋白偶聯(lián)物[9]。白蛋白能夠包裹的藥物有抗腫瘤藥、抗結(jié)核藥、降血糖藥、抗生素、激素、支氣管擴張劑等，可通過靜脈注射、肌肉注射、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射、口服、呼吸系統(tǒng)等多途徑給藥[10]。一方面，白蛋白納米藥物進入體循環(huán)后主要被肝、腎、骨髓等處網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的巨噬細胞吞噬，具有器官靶向性。另一方面，白蛋白納米藥物可以通過gp60受體/calveolin-1/SPARC通路實現(xiàn)藥物分子穿過腫瘤血管內(nèi)皮細胞并靶向運輸至腫瘤細胞。在這一過程中，白蛋白納米藥物首先結(jié)合到血管內(nèi)皮細胞表面的受體，如gp60受體。通過激活calveolin-1誘導(dǎo)細胞膜內(nèi)陷形成直徑為50～100nm有被小泡。有被小泡以跨細胞方式轉(zhuǎn)運進入其中的白蛋白納米藥物，將其由基底外側(cè)質(zhì)膜釋放到細胞間隙。進一步通過腫瘤組織細胞外基質(zhì)高表達的SPARC等蛋白介導(dǎo)運輸至腫瘤細胞[11-12]。

5 參與金屬離子代謝

白蛋白與金屬離子的結(jié)合可以抑制自由基的產(chǎn)生。由于存在1個自由的半胱氨酸殘基Cys-34，白蛋白成為血管內(nèi)還原性巰基的主要來源。這些巰基是活性氧和活性氮的清除劑，尤其是超氧化物、過氧化亞硝酸鹽等。銅離子是促進這些自由基產(chǎn)生的重要離子，白蛋白通過結(jié)合自由的銅離子來抑制自由基生成[13]。白蛋白主要含有四個金屬離子的結(jié)合位點：(1) 多肽鏈N端(N-terminal site，NTS)。該位點是白蛋白結(jié)合金屬離子的標志性位點，由蛋白序列N端的三個殘基Asp-Ala-His組成。這個結(jié)合位點的主要特征是肽鍵的氮原子與金屬離子配位，由同時存在的末端自由胺和His-3激活。這四個配位原子的配位結(jié)構(gòu)更傾向于形成金屬離子的平面絡(luò)合物，例如Cu2+和Ni2+。(2)還原型Cys-34。Cys-34使得白蛋白易于形成含半胱氨酸或谷胱甘肽的異型二硫化物[14]。白蛋白部分變性后以Cys-34硫醇鹽的形式結(jié)合金屬離子。Cys-34位于子域IA的第二和第三α螺旋結(jié)構(gòu)之間。X射線衍射分析顯示這一區(qū)域還存在其他潛在的金屬結(jié)合的殘基，例如Asp-38與His-39，但它們不與Cys-34同時結(jié)合金屬離子[14]。(3)金屬結(jié)合位點A(MBS /Site A His-67)。核磁共振和圓二色性研究表明白蛋白結(jié)構(gòu)域I的His-67咪唑氮是Cd2+和Zn2+的主要結(jié)合位點。Asn-99的羰基、Asp-249的羧酸以及His-247的咪唑和酰胺氧也參與結(jié)合Zn2+。此外，MBS 也是Cu2+和Ni2+的第二結(jié)合位點[15-16]。(4)金屬結(jié)合位點B。這是Cd2+的第二結(jié)合位點，與Site A的親和力大致相同。Site B同時也是Mn2+的主要結(jié)合位點，但對Zn2+的親和力較低[15]。

6 參與金屬納米顆粒的體內(nèi)自發(fā)合成

本課題組首次報道在哺乳動物的心血管系統(tǒng)中可以自發(fā)合成金屬納米顆粒并揭示其合成機制[17]。通過攝入含有低濃度鋅離子的飲用水，可以在動物外周血中檢測到大量的生物氧化鋅納米顆粒，表征結(jié)果顯示其結(jié)構(gòu)核心為粒徑約6nm的氧化鋅納米晶體，外側(cè)覆蓋血清白蛋白。通過在白蛋白溶液中添加鋅離子，可以在體外環(huán)境中模擬生物氧化鋅納米顆粒的合成過程?？梢娊饘匐x子進入心血管系統(tǒng)后，能夠被血清白蛋白大量捕獲并結(jié)合形成生物納米顆粒。筆者由此提出當大量金屬離子進入體內(nèi)后，能夠自發(fā)結(jié)合至白蛋白形成金屬納米顆粒即“金屬庫”，從而有效降低游離態(tài)金屬離子的強氧化及毒副作用。與鋅離子或者化學合成的氧化鋅納米晶體相比較，病理和免疫學等實驗均證實生物氧化鋅納米顆粒具有低毒性和良好的生物相容性。可以進一步對其修飾抗癌藥物，實現(xiàn)了靶向誘導(dǎo)體內(nèi)腫瘤細胞凋亡的作用[17]。以上結(jié)果表明白蛋白不但是體內(nèi)合成生物納米顆粒的關(guān)鍵分子，還是發(fā)揮藥物修飾連接的新型載體。

7 白蛋白納米藥物的臨床開發(fā)前景

近年來基于白蛋白的功能化生物材料在制備方法、表面改性、臨床應(yīng)用等方面不斷取得新進展。白蛋白可制成多種劑型如微球、納米粒等，所包埋的藥物多為抗腫瘤藥，主要用于靜脈注射途徑給藥。其他用法也逐漸增多，如包埋焦磷酸鐵用于口服制劑，通過高親和力白蛋白可以降低游離態(tài)藥物的濃度。目前的研究熱點是使用金屬離子、酶或者葉酸等修飾白蛋白，提高白蛋白與藥物的結(jié)合率和穩(wěn)定性，從而提升藥物的利用率。例如二價鈣離子或二價鎂離子與白蛋白的結(jié)合有利于暴露其亞油酸結(jié)合位點,可促進亞油酸與白蛋白的結(jié)合[18]。通過酶或葉酸修飾，使白蛋白某些基團活化，也能促進白蛋白與藥物結(jié)合。例如葉酸與白蛋白在縮合劑作用下形成偶聯(lián)復(fù)合體，由于腫瘤細胞表面葉酸含量顯著高于正常細胞，葉酸和白蛋白偶聯(lián)可使得白蛋白載藥系統(tǒng)的腫瘤靶向效率顯著提升。

在臨床應(yīng)用方面，美國食品和藥物管理局(FDA)批準使用人類的血清白蛋白，提取自人血漿或者通過基因重組表達產(chǎn)生。目前生產(chǎn)多用人血漿為原料，采用低溫乙醇法和層析法[19]。然而原料供應(yīng)是最大問題，例如捐獻者可能存在的病毒感染等因素也限制了白蛋白生產(chǎn)。因此白蛋白來源的明確、穩(wěn)定和安全仍然是一個巨大挑戰(zhàn)，尤其在病毒感染的情況下必須要謹慎篩選適合的捐獻者。 優(yōu)化生產(chǎn)方式、尋找替代蛋白是今后發(fā)展面臨的主要問題，如應(yīng)用基因工程手段生產(chǎn)重組白蛋白等將有助于解決這一問題。