結(jié)核桿菌表面ManLAM誘導(dǎo)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IL-37表達(dá)的研究*

黃 震 武紅梅△ 吳雨梅 李 娜 謝振東 陳思達(dá) 方宏才

1 廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院 518116； 2 深圳市龍崗區(qū)第三人民醫(yī)院； 3 江西省九江學(xué)院附屬醫(yī)院

結(jié)核桿菌通常是侵襲肺部引起肺結(jié)核。結(jié)核桿菌是結(jié)核病的病原體，它是一種無處不在并且侵襲性超強的人類病原菌。據(jù)估計，全世界1/3的人口感染了結(jié)核病，并且每年與結(jié)核病相關(guān)的死亡有數(shù)百萬[1]。作為一種脂聚糖，ManLAM是結(jié)核桿菌細(xì)胞壁的主要成分并且也是結(jié)核桿菌的主要毒力因子[2]。一直認(rèn)為它對宿主免疫力具有刺激和抑制作用。它能夠抑制巨噬細(xì)胞中吞噬體—溶酶體融合、樹突細(xì)胞成熟以及CD4+T細(xì)胞激活和招募。至于細(xì)胞因子產(chǎn)物的影響，樹突細(xì)胞中ManLAM使IL-10產(chǎn)物增加，同時抑制了IL-12的產(chǎn)生[3]。

作為IL-1家族的一個新成員，IL-37最近被證實在自身免疫性疾病、腫瘤的先天免疫及炎癥反應(yīng)中是一個天然抑制因素，并且通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及削弱效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)活性，它在調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫上也起著重要的作用[4]。重要的是，在細(xì)菌性疾病中，IL-37是天然免疫反應(yīng)對抗感染介導(dǎo)的炎癥的一個廣譜抑制劑，因而被認(rèn)為是減少肺部損傷的治療劑[5]。

已經(jīng)證實了IL-37主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，并且能夠被一些TLR配體誘導(dǎo)表達(dá)，例如 TLR2和TLR4[6]。此外，細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)分析表明， ERK1/2(細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2)和p38抑制劑能夠抑制IL-37的表達(dá)。作為另一個重要的抑制性細(xì)胞因子，樹突狀細(xì)胞中TLRs刺激以及MAPK家族成員(ERK1/2和p38)的激活也能誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)增加[7]。結(jié)核桿菌表面最主要的脂聚糖——ManLAM(甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露聚糖)，是結(jié)核桿菌的一個免疫抑制表位。IL-37(白細(xì)胞介素-37)是一個最新被鑒定的抗炎因子，它能減弱全身及身體局部的炎癥。然而，ManLAM和IL-37之間的關(guān)系仍不清楚。因此，本次研究中，筆者使用A549細(xì)胞系來探究ManLAM對人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IL-37產(chǎn)生的作用以及相關(guān)分子機制。

在本研究中，筆者評估了從結(jié)核桿菌中純化的ManLAM是否能夠誘導(dǎo)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(即A549細(xì)胞)中IL-37的表達(dá)，并且檢測了與IL-37的表達(dá)有關(guān)的分子通路。結(jié)果表明ManLAM誘導(dǎo)IL-37的產(chǎn)生具有時間和劑量依賴性，更重要的是，這種影響取決于TLR2表達(dá)上升以及p38和ERK1/2 磷酸化增加。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和細(xì)菌 人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞(生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所, 中國)，在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone, USA)中37℃培養(yǎng)。H37RV結(jié)核桿菌購自北京生物制品研究所，在Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且在生長對數(shù)期收集細(xì)菌。細(xì)菌在使用前用含有0.05% Tween-80的PBS清洗并且均勻破碎。

1.2 ManLAM提取和分析 從H37RV結(jié)核桿菌中提取并純化ManLAM，將純化的ManLAM用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染分析。

1.3 RT-PCR(實時定量PCR) 根據(jù)廠家說明書，使用TRIzol法提取A549細(xì)胞中的總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用特殊的引物和實時定量PCR系統(tǒng)對cDNA進(jìn)行定量分析。IL-37基因通過以下引物進(jìn)行擴增放大，上游引物：5’- CAGCCTCTGCGGAGAAAGGAAGT-3’，下游引物：5’- GTTTCTCCTTCTTCAGCTGAAGGGATGGAT-3’；β-actin作為內(nèi)參對照，上游引物：5’-TCGTCGACAACGGCTCCGGCATGT-3’，下游引物：5’-CATTGTAGAAGGTGTGGTG-3’。

1.4 Western Blot(蛋白質(zhì)印跡法) 使用單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(Santa Cruz Biotechnology)對IL-37進(jìn)行檢測。使用MAPK抗體試劑盒(Cell Signaling Technology)通過蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)對磷酸化的和總的p38和ERK1/2 MAPKs進(jìn)行檢測。將β-actin設(shè)置為內(nèi)參。條帶用 Fluor S-MultiImager MAX 系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)進(jìn)行觀察并且通過圖像分析軟件(Quantity One, Bio-Rad Laboratories)進(jìn)行定量。

1.5 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗) 按照廠家說明書，利用ELISA法測量IL-37水平。人IL-37 ELISA試劑盒購自華美生物(武漢，中國)，所有的樣品均檢測3次。

1.6 siRNA(小干擾RNA)轉(zhuǎn)染 針對TLR2或TLR4的siRNA或者抑制性siRNA，從生命科技公司獲得。每5×105個A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染60pmol siRNA，同時加入3ml脂質(zhì)體2000到無血清改良的 Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，漂洗干凈，然后將其放入含10%胎牛血清的新鮮RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.7 Flow cytometry(流式細(xì)胞儀) 為了減少非特異性結(jié)核，所有的染色反應(yīng)都在4℃進(jìn)行，細(xì)胞首先暴露于Fc受體的單克隆抗體中(Human TruStain FcXTM,Biolegend) 。PE標(biāo)記的抗TLR2和APC標(biāo)記的抗TLR4抗體都購自Biolegend公司。細(xì)胞通過一個BD Accuri C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核桿菌刺激使A549細(xì)胞中IL-37表達(dá)增加 滅活的H37Rv結(jié)核桿菌以10∶1(細(xì)菌∶細(xì)胞)的比例加入，刺激人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，在不同的時間段檢測IL-37 mRNA和蛋白表達(dá)情況。如圖1A所示，RT-PCR 結(jié)果表明：在H37Rv刺激12h后，A549細(xì)胞中IL-37 mRNA的表達(dá)水平顯著增加(大約增加了7.6倍)。此外，蛋白含量分析也表明H37Rv促進(jìn)IL-37的產(chǎn)生具有時間依賴性，見圖1B和圖3A。這些發(fā)現(xiàn)表明IL-37作為一種抑制性細(xì)胞因子，在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞對抗結(jié)核桿菌感染的反應(yīng)上可能有一定的作用。

圖1 A549細(xì)胞中，滅活的H37RV對IL-37表達(dá)的影響分析

A.不同時間段滅活的H37RV誘導(dǎo)IL-37mRNA表達(dá)的RT-PCR結(jié)果；B.不同時間段滅活的H37RV誘導(dǎo)IL-37蛋白表達(dá)的ELISA分析結(jié)果；C.從H37RV中分離的水相和氯仿—甲醇相誘導(dǎo)IL-37mRNA表達(dá)的RT-PCR結(jié)果；D.從H37RV中分離的水相和氯仿—甲醇相誘導(dǎo)IL-37mRNA表達(dá)蛋白表達(dá)的ELISA分析結(jié)果。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2.2 H37Rv細(xì)胞壁成分ManLAM是H37Rv誘導(dǎo)IL-37表達(dá)的主要原因 接下來，筆者利用親脂性的和親水性溶劑分離H37Rv成分，例如氯仿:甲醇和水,每種提取物中IL-37表達(dá)活性ELISA法進(jìn)行評估。筆者發(fā)現(xiàn)只有水相顯示對IL-37表達(dá)有刺激活性，見圖1C和圖1D，并且與全細(xì)菌刺激沒有顯著性差異，與氯仿:甲醇相中的僅僅顯示IL-37表達(dá)的微量增加形成了鮮明的對比。這些結(jié)果表明：結(jié)核桿菌親水性成分是引起IL-37表達(dá)的原因。

在結(jié)核桿菌親水性成分中，ManLAM是其中最豐富的親水性脂多糖，因此，筆者進(jìn)一步評估了ManLAM誘導(dǎo)A549細(xì)胞中IL-37表達(dá)的能力。正如圖2A所示，ManLAM使IL-37 mRNA水平呈劑量依賴性增加，并且在ManLAM以10μg/ml刺激12h時，IL-37表達(dá)量增加最大(約7.1倍)。更重要的是，數(shù)據(jù)顯示ManLAM誘導(dǎo)IL-37蛋白產(chǎn)生具有時間和劑量依賴性，見圖2B和圖2C，并且與H37Rv刺激沒有明顯的不同，見圖3A。這些發(fā)現(xiàn)表明：ManLAM是H37Rv能夠誘導(dǎo)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-37的主要成分。

圖2 A549細(xì)胞中，從H37RV中提取的ManLAM對IL-37表達(dá)影響的分析

A.不同濃度的ManLAM在不同時間段誘導(dǎo)IL-37 mRNA表達(dá)的RT-PCR結(jié)果； B.同一濃度的ManLAM在不同時間段誘導(dǎo)IL-37蛋白表達(dá)的ELISA檢測結(jié)果；C.不同濃度的ManLAM同一時間段誘導(dǎo)IL-37蛋白表達(dá)的ELISA檢測結(jié)果。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2.3 p38和ERK1/2的激活與ManLAM誘導(dǎo)IL-37產(chǎn)生有關(guān) 為了更進(jìn)一步理解ManLAM誘導(dǎo)IL-37表達(dá)的機制，對多個重要信號蛋白抑制劑靶標(biāo)進(jìn)行研究，例如JNK或MAPK通路。A549細(xì)胞先用各種抑制劑處理30min,然后將這些被處理的細(xì)胞用ManLAM刺激24h。結(jié)果表明：p38和ERK1/2抑制劑使ManLAM誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-37的量顯著減少，見圖3B，而且，ManLAM大大促進(jìn)了A549細(xì)胞中p38和ERK1/2 MAPKs的磷酸化。這些結(jié)果表明 p38 MAPK 和ERK1/2通路可能與ManLAM-誘導(dǎo)的IL-37表達(dá)上升有關(guān)。

2.4 TLR2與ManLAM誘導(dǎo)IL-37產(chǎn)生有關(guān) TLR配體脂多糖和Pam3CSK4在誘導(dǎo)IL-37產(chǎn)生上是非常有效的[8]，值得注意的是ManLAM也是一種TLRs配體。在A549細(xì)胞中，ManLAM刺激大大促使了TLR2和TLR4的表達(dá)，更重要的是，敲除TLR2使其不表達(dá)后，ManLAM幾乎不能誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-37，同時也幾乎沒有p38和ERK1/2的磷酸化。然而，敲除TLR4，對ManLAM誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-37幾乎沒有影響，見圖3C與圖4。因此，TLR2缺陷導(dǎo)致了IL-37產(chǎn)物下降大概是由于它下游信號蛋白p38和ERK1/2激活的下調(diào)。這些結(jié)果共同表明：ManLAM主要通過調(diào)節(jié)TLR2表達(dá)和p38和ERK1/2磷酸化來提高人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IL-37的產(chǎn)量。

圖3與ManLAM誘導(dǎo)IL-37表達(dá)有關(guān)的p38 MAPK和ERK1/2的變化

A.A549細(xì)胞中，medium (CM)、iH37Rv及 ManLAM誘導(dǎo)24h后，western檢測IL-37表達(dá)；B.ELISA檢測培養(yǎng)24h后，各種信號蛋白對A549細(xì)胞中ManLAM誘導(dǎo)IL-37產(chǎn)生的影響；C.ManLAM刺激后不同時間段，Westernblot 分析A549細(xì)胞中ERK1/2、p38和β-actin的激活情況。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

圖4 A549細(xì)胞中，與ManLAM誘導(dǎo)IL-37產(chǎn)生有關(guān)的TLR2

A.流式細(xì)胞儀分析ManLAM刺激24h后，A549細(xì)胞中TLR2及TLR4的表達(dá)，在ManLAM刺激之前，用TLR2和TLR4相應(yīng)的特異性siRNA干擾A549細(xì)胞中TLR2和TLR4的表達(dá)； B.ELISA檢測A549細(xì)胞經(jīng)與A相同的處理后，上清液中的IL-37的表達(dá)；C.有無TLR2 siRNA存在的條件下，Westernblot檢測ManLAM刺激A549細(xì)胞后，ERK1/2、p38和β-actin的激活情況。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

3 討論

筆者通過研究，首先證明了結(jié)核桿菌的一個毒力因子——ManLAM能夠誘導(dǎo)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中IL-37的表達(dá)。這種活性主要是由TLR2表達(dá)以及p38和ERK1/2的磷酸化來完成。自從第一次描述IL-37以來，IL-37作為先天性免疫的一種基本抑制劑，已經(jīng)在炎癥和自身免疫性疾病及腫瘤中檢測到了它的mRNA和蛋白質(zhì)，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏性皮膚炎、炎癥性腸病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[9]?，F(xiàn)今，IL-37在適應(yīng)性免疫和霉菌感染上的抑制活性已經(jīng)擴大了，特別是IL-37在侵襲性曲霉病感染中能減弱肺部損傷。

在結(jié)核桿菌感染中，結(jié)核桿菌主要聚集在肺部而引起病理損傷。最近，肺泡上皮細(xì)胞被證明是對抗呼吸道病原體免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)。很多體外研究已經(jīng)證實Ⅱ型肺泡壁細(xì)胞能夠使結(jié)核桿菌進(jìn)入細(xì)胞，并且，細(xì)菌一旦進(jìn)入Ⅱ型肺泡細(xì)胞就能不斷的復(fù)制增殖[10]。因此，筆者推測結(jié)核桿菌可能通過促進(jìn)肺泡細(xì)胞中IL-37的產(chǎn)生來促進(jìn)其復(fù)制增殖。

在不同時間段，用滅活的結(jié)核桿菌株H37Rv刺激人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞。從那些結(jié)果中，筆者發(fā)現(xiàn)H37Rv確實促進(jìn)了IL-37 mRNA表達(dá)以及蛋白質(zhì)產(chǎn)生。由于是第一次報道結(jié)核桿菌有誘導(dǎo)IL-37產(chǎn)生的能力，筆者想進(jìn)一步確定是哪種成分導(dǎo)致了H37Rv誘導(dǎo)產(chǎn)生 IL-37。

H37Rv細(xì)菌通過親水性和親脂性試劑將其分為兩部分，例如氯仿:甲醇和水，筆者發(fā)現(xiàn)只有水相對IL-37的產(chǎn)生有明顯的刺激活性。脂多糖已經(jīng)被報道能誘導(dǎo)A549細(xì)胞中IL-37的產(chǎn)生，盡管分枝桿菌沒有脂多糖，但結(jié)核桿菌細(xì)胞表面包含著名叫ManLAM的復(fù)雜脂質(zhì)糖蛋白，它與脂多糖有很多相同的物理化學(xué)特性。在分枝桿菌親水成分中，ManLAM是最豐富的親水性脂聚糖，已經(jīng)證實它能抑制宿主免疫系統(tǒng)的一個關(guān)鍵原因是免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生。

在A549細(xì)胞中，ManLAM誘導(dǎo)IL-37 mRNA和蛋白表達(dá)具有時間和劑量依賴性。因此，盡管IL-37產(chǎn)物在ManLAM處理過的 A549 細(xì)胞中略低，但是H37Rv和ManLAM刺激孵育24h后，IL-37產(chǎn)物沒有明顯的差別，這種細(xì)微的下降可能是由于H37Rv其他的抑制性成分，像mAGP和LprG[11]，這些需要進(jìn)一步的證實。IL-37抑制了自身免疫性疾病和霉菌感染中促炎因子的產(chǎn)生，像IL-1β、IL-6和TNF,而且ManLAM 或 H37Rv誘導(dǎo) IL-37產(chǎn)生在各種促炎因子中的作用將會在進(jìn)一步的研究中加以證實。

MAPK信號通路是炎癥中的一個主要信號通路。在THP1細(xì)胞中，由于IL-37的產(chǎn)生，p38和ERK1/2抑制劑能夠抑制MAPK信號通路 。ManLAM不僅能夠激活p38 MAPK 和 MEK/ERK磷酸化以阻止結(jié)核桿菌吞噬體成熟，而且能抑制促炎因子的產(chǎn)生，像 IL-8，同時刺激IL-10的產(chǎn)生[12]。筆者實驗結(jié)果表明ManLAM促進(jìn)了A549細(xì)胞中p38和ERK1/2磷酸化，并且這兩種蛋白質(zhì)特異性抑制劑抑制了ManLAM誘導(dǎo)IL-37的產(chǎn)生。然而，JNK抑制劑SP600125也能抑制IL-37產(chǎn)生，至于ManLAM誘導(dǎo)IL-37產(chǎn)生升高的機制還需要進(jìn)一步的詳細(xì)研究。

ManLAM能夠被TLR2和TLR4識別[13]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)了IL-37的產(chǎn)生。此外，TLR配體也能通過 p38和ERK1/2 MAPK通路促進(jìn)樹突狀細(xì)胞中IL-10的產(chǎn)生[14]。ManLAM刺激24h后,A549細(xì)胞表面的TLR2和TLR4表達(dá)都顯著增加了，然而只有TLR2敲除能夠減弱ManLAM誘導(dǎo)IL-37產(chǎn)生的能力。更重要的是，ManLAM刺激后，TLR2干擾也能顯著減弱p38和ERK1/2 磷酸化。

綜上所述，本研究首次證實了結(jié)核桿菌細(xì)胞壁的主要成分ManLAM能夠誘導(dǎo)人Ⅱ型肺泡細(xì)胞產(chǎn)生IL-37，它通過使TLR2表達(dá)上調(diào)，ERK1/2和p38 MAPK磷酸化來介導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)已經(jīng)揭示結(jié)核桿菌表面ManLAM之前未被認(rèn)可的免疫調(diào)節(jié)作用。