姜黃素對(duì)肺纖維化模型大鼠TGF-β1表達(dá)的影響

薛愛芹 張爭輝 李銀生

1 菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東省菏澤市 274000； 2 河南省新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院

肺纖維化(Pulmonary fibrosis,PF)主要表現(xiàn)為肺實(shí)質(zhì)漸進(jìn)性不可逆性纖維化進(jìn)展，同時(shí)伴有肺功能降低，表現(xiàn)為干咳、進(jìn)行性呼吸困難，發(fā)病率和死亡率逐年增加，死亡率高于大多數(shù)腫瘤，被稱為一種“類腫瘤疾病”，博萊霉素現(xiàn)已用作研究PF的經(jīng)典模型[1]。關(guān)于PF機(jī)制和治療的進(jìn)展是近幾年的研究熱點(diǎn)，如：通過小分子靶向抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)，阻礙了轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)介導(dǎo)的纖維化作用。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)可能是調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞分化及其進(jìn)一步參與PF發(fā)展的重要機(jī)制[2]；尼達(dá)尼布是特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonury fibrosis,IPF)已經(jīng)獲批的治療方法[3]，姜黃素是一種植物多酚，具有抗氧化、抗炎、降脂、抗腫瘤的作用。本文主要探討博萊霉素誘導(dǎo)的PF模型大鼠在應(yīng)用姜黃素干預(yù)后，檢測TGF-β1在各組間的變化，從而探討姜黃素在PF中的作用機(jī)制，為我們進(jìn)一步探討PF的發(fā)病機(jī)制及其防治提供一種新線索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物的選擇 健康雄性昆明大鼠96只，體重(20±2)g，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)期間為各組大鼠提供標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水，飼養(yǎng)于安靜、溫暖且避強(qiáng)光的環(huán)境中。

1.2 試劑與儀器 姜黃素(四川金郁金科技有限公司生產(chǎn))；醋酸潑尼松片(天津太平洋制藥有限公司生產(chǎn))；注射用鹽酸博萊霉素(日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn))；SABC二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒、兔抗鼠CTGF多克隆抗體、兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體等均購自武漢博士德公司。

1.3 建立肺間質(zhì)纖維化模型及建模后給藥 建模：健康SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組，空白對(duì)照組(A)、模型組(B)、陽性藥物對(duì)照組(C，醋酸潑尼松片)和姜黃素干預(yù)組(D)，每組24只。B、C、D均一次性氣管內(nèi)給予博萊霉素(5mg/kg)制作肺纖維化動(dòng)物模型，空白對(duì)照組以同樣方法一次性氣管內(nèi)注入等體積的生理鹽水。28d后大鼠肺組織基質(zhì)沉積，呈纖維化表現(xiàn)。給藥：造模成功后，A、B組給予等量生理鹽水[0.014L/(kg·d)]，C組給予醋酸潑尼松混懸液[0.56mg/(kg·d)]，D組給予姜黃素羧甲基纖維素鈉混懸液[200mg/(kg·d)]。

1.4 HE、免疫組化染色

1.4.1 取材：腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉(2.5ml/kg)后將大鼠固定，快速取肺臟，冷生理鹽水清洗后，用15%的甲醛預(yù)固定肺左葉組織，抽真空后再用10%甲醛固定。經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋成蠟塊。并將分離出的肺右葉組織凍存到-80℃冰箱。

1.4.2 分別留取常規(guī)病理、免疫組化切片各1套。HE染色：經(jīng)過切片、展片、烤片、脫蠟、至水、染色。免疫組化：石蠟切片置烤箱60℃約1h，常規(guī)脫蠟至水，PBS洗滌5min， 過氧化氫3%孵育25min，PBS洗滌，5min×3次， 微波修復(fù)抗原，5%BSA封閉液滴加，室溫孵育30min。加稀釋的一抗TGF-β1兔抗鼠多克隆抗體1∶300， 4℃冰箱過夜， PBS漂洗5min×3次。滴加羊抗兔生物素化標(biāo)記的二抗，37℃孵育30min。PBS漂洗5min×3次， SABC復(fù)合液滴加，PBS再漂洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察，清水沖洗玻片， 37℃烘箱中烘干，封片，避光，1周內(nèi)采圖。免疫組化染色結(jié)果采用半定量分析。

1.5 Western-blotting測定方法 取0.1g肺組織，放入研缽，倒入適量液氮后用鉗子夾碎，倒入勻漿器，用0.4ml裂解液溶解粉末30min后，將裂解液移至1.5ml EP管中，放入離心機(jī)，12 000rpm，離心5min。取上清液，分裝于0.5ml EP管中后加入5x蛋白上樣液和DTT，混勻后，放入沸水中煮8min，取出冷卻后放入-20℃保存。灌膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及雜交、發(fā)光鑒定、結(jié)果判斷。以β-actin為內(nèi)參照，將膠片進(jìn)行掃描或拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 見圖1?？瞻讓?duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)未見異常(圖A1)。模型組大鼠逐漸觀察到彌漫性肺纖維化和大量膠原沉積(圖B1)；陽性藥物對(duì)照組的肺組織纖維化情況有所好轉(zhuǎn)，可見散在炎性細(xì)胞，肺泡間隔窄，纖維病灶可見于周圍支氣管(圖C1)。姜黃素干預(yù)組肺組織纖維化情況好轉(zhuǎn)明顯，纖維增生灶肺泡間隔較少。細(xì)支氣管周圍的纖維化程度明顯低于模型組(圖D1)。

圖1 HE染色×200

2.2 四組大鼠肺組織中TGF-β1表達(dá)免疫組化表達(dá)結(jié)果 見圖2。模型組在灌注BLM后28d TGF-β1表達(dá)水平達(dá)到高峰。模型組肺組織TGF-β1的表達(dá)較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥物對(duì)照組和姜黃素干預(yù)組TGF-β1表達(dá)都明顯降低，但二者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 TGF-β1表達(dá)變化

2.3 各組大鼠肺組織中TGF-β1表達(dá)Western blotting檢測結(jié)果 見圖3。與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織中TGF-β1的表達(dá)均明顯升高；與模型組相比，陽性藥物對(duì)照組及姜黃素干預(yù)組大鼠肺組織中TGF-β1的表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 TGF-β1表達(dá)

3 討論

PF是一種纖維增生性疾病，最終可導(dǎo)致致命的肺衰竭。其特征在于成纖維細(xì)胞的異常增殖，成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化失調(diào)以及無組織的膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、沉積和降解。其中以IPF發(fā)病率最高，預(yù)后較差，目前PF發(fā)病機(jī)制尚不明確并缺乏有效的治療策略。相關(guān)研究顯示轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)與PF有密切關(guān)系：PF患者患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加，TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)在組織纖維化和腫瘤發(fā)生中起重要作用，特別在IPF肺組織中，其介導(dǎo)的病理學(xué)變化可以促進(jìn)致癌過程并提供有利于癌癥進(jìn)展的微環(huán)境[4]。 另外一項(xiàng)研究觀察到博萊霉素(BLM)造模后第28天引起大鼠肺部出現(xiàn)炎癥浸潤和膠原沉積增加。施用PM014(一種草藥提取物)后的大鼠出現(xiàn)炎癥反應(yīng)的抑制和纖維化變化。其可能是因?yàn)镻M014抑制TGF-β1誘導(dǎo)的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化和成纖維細(xì)胞活化作用，或靶向調(diào)節(jié)了TGF-β1信號(hào)的傳導(dǎo)[5]。那么姜黃素在在肺纖維化方向的研究進(jìn)展又是什么呢？姜黃素通過抑制促炎細(xì)胞因子和抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥而顯示出抗炎作用，一項(xiàng)研究利用可吸入姜黃素大多孔微粒來治療IPF[6]。肺纖維化與不可逆或部分可逆的氣流阻塞相關(guān)，并且最終對(duì)諸如皮質(zhì)類固醇的哮喘治療無反應(yīng)，鼻內(nèi)姜黃素可調(diào)節(jié)慢性哮喘的氣道炎癥和重塑[7]。姜黃素可以在纖維化階段抑制BLM誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化，其機(jī)制可能是抑制I型膠原蛋白的合成和沉積，抑制TGF-β1mRNA的過度表達(dá)。姜黃素對(duì)肺纖維化的治療效果優(yōu)于潑尼松[8]。在TGF-β超家族的亞家族中,TGF-β1是目前研究最多的與疾病相關(guān)分子，TGF-β1自1972年發(fā)現(xiàn)以來, 國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其在臟器纖維化、腫瘤、創(chuàng)傷修復(fù)、炎癥性疾病及自身免疫性疾病等發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[9]，在肺纖維化過程中扮演著重要角色，與肺纖維化關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：肺纖維化模型組大鼠肺組織蛋白中TGF-β1含量明顯高于空白對(duì)照組，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。姜黃素干預(yù)組大鼠給予姜黃素后肺組織蛋白中TGF-β1的含量有一定程度的降低，與模型組比較，有顯著差異，這說明姜黃素能夠從蛋白水平調(diào)節(jié)肺組織TGF-β1的活性。陽性藥物對(duì)照組與姜黃素干預(yù)組肺組織中TGF-β1表達(dá)相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究初步探討了姜黃素抗肺纖維化的作用以及作用機(jī)制，也為臨床新藥的開發(fā)提供一種新的思路。另外該藥具有毒性低、價(jià)格低、藥源充足等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景，但是肺纖維化的形成是一個(gè)慢性復(fù)雜的過程，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究與臨床研究。