燈盞花素抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用

劉永浩 周 敏

南昌大學(xué)藥學(xué)院江西省基礎(chǔ)藥理學(xué)重點實驗室，江西省南昌市 330006

當(dāng)心臟缺血后再次恢復(fù)血液供應(yīng)時，會造成大量心肌細(xì)胞損傷，即心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)。MIRI直接影響患者的預(yù)后，其機(jī)制可能與鈣超載、氧自由基、細(xì)胞凋亡等[1]多種因素有關(guān)。燈盞花素(Bregenin,Bre)屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗心肌缺血等多種生物學(xué)活性，對腦組織、心肌、腎臟、肺等組織器官缺血再灌注損傷均表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用[2-5]。目前燈盞花素對心肌MIRI保護(hù)作用機(jī)制仍不明確。本實驗通過利用原代心肌細(xì)胞擬建立缺氧/復(fù)氧(Anoxia/reoxygention,A/R)模型，以氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡為切入點，研究 Bre 對心肌細(xì)胞A/R損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為下一步深入研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 燈盞花素(Bre)，中國藥品生物制品檢定所；DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司；胎牛血清(FCS)，杭州四季青生物制品有限公司；MTS，Ameresco公司；GSH-Px、SOD、MDA、LDH檢測試劑盒，南京建成生物工程研究；AnnexinV-FITC試劑盒，BD Biosciences；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗用原代心肌細(xì)胞 參照劉丹等[6]方法：選取1～3d新生大鼠的心臟處理后，剪成1mm2大小的碎泥狀，加8ml 0.1%的胰酶，37℃水浴8min，靜置數(shù)分鐘棄上清，重復(fù)多次，至碎塊消失，收集混懸液上清，用MEM培養(yǎng)基(含15%FBS)終止消化，離心(4℃，1 000rpm 8min)，收集細(xì)胞沉淀用MEM培養(yǎng)基(含15%FBS)混勻后，200目濾網(wǎng)過濾，常規(guī)培養(yǎng)2h，除去成纖維細(xì)胞，將上清用MEM培養(yǎng)基(含15%FBS)輕柔混勻，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105cells/ml，按2.5×106接種到60mm培養(yǎng)板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱3d后，按照實驗要求進(jìn)行分組實驗。

1.3 方法

1.3.1 心肌缺氧/復(fù)氧(A/R)損傷模型的建立:將原代心肌細(xì)胞棄培養(yǎng)液，用缺氧液(5%CO2-95%N2混合氣體飽和)輕洗1次，再加入缺氧液并置于A/R裝置(持續(xù)充滿5%CO2-95%N2混合氣體)，37℃孵育3h后，棄去缺氧液，用復(fù)氧液(5%CO2-95%O2混合氣體飽和)清洗1次，再加入復(fù)氧液并置于A/R裝置，37℃孵育2h(缺氧液、復(fù)氧液參照Koyama[7]、Xu[8]等方法配制)。

1.3.2 實驗分組：(1)Control組(對照組)：原代心肌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)箱(5%CO2-95%空氣)37℃孵育3h后，再換成復(fù)氧液置于常規(guī)培養(yǎng)箱孵育2h；(2)A/R組(缺氧/復(fù)氧組)：按1.3.1方法建立A/R損傷模型；(3)Bre+ A/R組(燈盞花素組)：取原代心肌細(xì)胞分別加入濃度為20、40、80μM的燈盞花素，常規(guī)培養(yǎng)箱孵育24h，然后進(jìn)行A/R損傷處理。

1.3.3 MTS比色法檢測細(xì)胞存活率：將已接種原代心肌細(xì)胞(覆蓋率70%～80%)的96孔培養(yǎng)板吸出培養(yǎng)基，每孔100μl培養(yǎng)基加入MTS溶液20μl(檢測步驟根據(jù)試劑盒說明書操作)，在常規(guī)培養(yǎng)箱孵育1～4h，490nm讀取吸光度值，記錄結(jié)果。

1.3.4 生化系列指標(biāo)檢測：將各實驗組心肌細(xì)胞收集后，超聲破碎并離心，取上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)操作，將配制的溶液用分光光度計在特定波長(MDA 532nm，SOD 550nm，GSH-Px，LDH 412 nm)讀取吸光度值，記錄結(jié)果。

1.3.5 Annexin V-FICT/PI雙染法檢測心肌細(xì)胞凋亡：將前期處理收集的細(xì)胞用400μl的1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×106cells/ml，添加5μl Annexin V-FITC，混勻后避光，置2～8℃冰箱孵育15min；加入10μl PI，輕混后再避光，置2～8℃冰箱孵育5min，在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素對原代心肌細(xì)胞A/R損傷后細(xì)胞存活率、LDH 活性和細(xì)胞凋亡的影響 如表1所示，與對照組相比，A/R組細(xì)胞存活率明顯降低 (P<0.01)，培養(yǎng)液中LDH 活性明顯升高(P<0.01)，A/R損傷模型構(gòu)建成功；與A/R 組相比，Bre處理組(20、40、80μM)細(xì)胞存活率呈劑量依賴性升高(P<0.01)，培養(yǎng)液中LDH 活性逐漸降低(P<0.01)。與對照組相比，A/R 組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加(P<0.01)，心肌細(xì)胞經(jīng)A/R損傷后凋亡明顯；與A/R 組相比，Bre處理組(20、40、80μM)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.01)。

表1原代心肌細(xì)胞A/R損傷后細(xì)胞存活率、LDH活性和細(xì)胞凋亡的影響

注：與對照組比較，*P<0.01；與A/R 組比較，▲P<0.01。

2.2 燈盞花素對原代心肌細(xì)胞A/R損傷后SOD、GSH-Px和MDA含量的影響 如表2所示，與對照組相比，A/R 組細(xì)胞內(nèi)抗氧化物酶 SOD 及 GSH-Px 活性均明顯降低(P<0.01)，MDA的含量明顯增加(P<0.01)，A/R損傷模型建立成功；與A/R 組相比，Bre處理組(20、40、80μM)的抗氧化酶SOD 及 GSH-Px 的活性明顯增加(P<0.01)，MDA的含量明顯減少(P<0.01)。

表2原代心肌細(xì)胞A/R損傷后SOD和GSH-Px活性以及MDA含量的影響

注：與對照組比較，*P<0.01;與 A/R組比較，▲P<0.01。

3 討論

近年來，經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)、體外循環(huán)心臟外科手術(shù)、動脈搭橋術(shù)、溶栓療法等手段的建立和推廣應(yīng)用，心臟在短時間內(nèi)缺血再次恢復(fù)血氧供應(yīng)過程中造成的心肌缺血再灌注損傷(MIRI)，已成為影響心臟血管外科手術(shù)療效的一大難題。Fliss等[9]研究發(fā)現(xiàn)MIRI中心肌細(xì)胞死亡本質(zhì)上有可能是細(xì)胞凋亡。MIRI中細(xì)胞凋亡的發(fā)生與再灌注恢復(fù)氧供應(yīng)過程中的氧化應(yīng)激損傷[10-11]密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧的過度產(chǎn)生所致的氧化應(yīng)激是造成細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[12]。機(jī)體內(nèi)抗氧化物酶可清除氧自由基，其中超氧化物歧化酶(SOD) 可清除超氧陰離子，而谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)可清除脂質(zhì)過氧化物(MDA)，MDA可反應(yīng)氧自由基的含量。因此提高抗氧化物酶的活性、減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生可以抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，達(dá)到心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

燈盞花素，具有抗心律失常作用，能抑制MIRI引起的細(xì)胞凋亡[13]。有研究表明，燈盞花素可通過清除氧自由基，減少氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮肝臟、腦組織MIRI保護(hù)作用[14-15]。在本實驗中，利用原代心肌細(xì)胞作為研究對象，A/R損傷前用燈盞花素進(jìn)行預(yù)處理后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與A/R組相比，細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性升高，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯減少，細(xì)胞存活率得到提高，細(xì)胞凋亡減少。實驗結(jié)果表明，心肌細(xì)胞經(jīng)過燈盞花素預(yù)處理能有效地提高其A/R損傷后的抗氧化物酶活性，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述，燈盞花素心肌保護(hù)作用機(jī)制可能與其減少氧化應(yīng)激損傷，抑制細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。本實驗為下一步深入探討燈盞花素心肌的保護(hù)作用機(jī)制提供了新的實驗數(shù)據(jù)。