血液中脂肪細(xì)胞膜特異性蛋白ASC-1的來源探討

王卓 娜布其 張平驥 王艷勛 呂艷偉 安貴生

1北京積水潭醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 100035；2北京積水潭醫(yī)院臨床流行病學(xué)研究室 100035；3北京積水潭醫(yī)院創(chuàng)傷骨科 100035

脂肪栓塞 (fat embolization,FE)是血液循環(huán)外的脂肪成分進(jìn)入血液循環(huán)的一種狀態(tài),可以有或沒有臨床表現(xiàn)[1]。脂肪栓塞綜合征 (fat embolism syndrome,FES)是脂肪成分進(jìn)入血液循環(huán)并導(dǎo)致一系列臨床癥狀和體征的臨床癥候群。FES是FE的嚴(yán)重后果[2-3]。由于FE缺乏敏感的診斷指標(biāo),使人們甚至不少醫(yī)務(wù)工作者誤認(rèn)為FE 的發(fā)病率較低,其實(shí)FE 的發(fā)病率很高。FE 和FES好發(fā)于創(chuàng)傷、骨折、骨科手術(shù)、抽脂手術(shù)和自體脂肪移植手術(shù)后。創(chuàng)傷和長(zhǎng)骨骨折患者中FE 的發(fā)病率高達(dá)90%[4-6],其中22.5%～29%的人發(fā)展為FES[7-8]。FE的病死率目前報(bào)道差異較大,可高達(dá)60%[9]。目前國內(nèi)外臨床診斷FE 主要靠病理診斷,在血管中發(fā)現(xiàn)脂肪栓子即可確診。但此法多在患者死亡后才能應(yīng)用,臨床價(jià)值明顯受限。FES的診斷標(biāo)準(zhǔn)來源于1974年Gurd和Wilson提出的框架[10]。后來,有學(xué)者在以上基礎(chǔ)上加入了一些新的診斷指標(biāo),如尿中發(fā)現(xiàn)脂肪滴、痰或支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)脂肪滴等[11-13],但研究發(fā)現(xiàn)這些并非FE所特有。目前關(guān)于FE和FES的實(shí)驗(yàn)室檢查仍缺乏特異性,診斷標(biāo)準(zhǔn)敏感度差,漏診率很高[14]。不少患者很難和創(chuàng)傷所致腦部損傷、肺部損傷等疾病相鑒別。近40年來,FE 和FES的診斷標(biāo)準(zhǔn)少有變化,診斷非常困難,導(dǎo)致了大量患者被誤診和漏診。因而尋找敏感度和特異度高的FE和FES診斷指標(biāo)是世界范圍臨床工作的迫切需要。

造成FE的栓子來源主要有兩方面：黃骨髓中的脂肪細(xì)胞；皮下或臟器周圍的脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞中含有甘油三酯和膽固醇。正常情況下,人血循環(huán)中也存在甘油三酯、膽固醇及乳糜顆粒等成分,但不存在脂肪細(xì)胞膜成分。如果在血循環(huán)中發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞膜成分,說明循環(huán)外的脂肪成分進(jìn)入血循環(huán),就可證明FE的發(fā)生。如果能找到脂肪細(xì)胞膜特異的標(biāo)志物,當(dāng)FE發(fā)生時(shí),只要在外周血中檢測(cè)到這種特異的標(biāo)志物就可以證實(shí)FE 的發(fā)生。因此筆者提出從分子水平對(duì)FE 進(jìn)行診斷的思路。為了證實(shí)以上假設(shè),筆者選擇人脂肪細(xì)胞膜特異性蛋白ASC-1作為研究切入點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)需要證實(shí)ASC-1廣泛存在于脂肪組織和黃骨髓中,而不存在或極少存在于正常人外周血中。如果ASC-1被證實(shí)具備這一特點(diǎn),在骨折或骨科手術(shù)后的患者外周血中發(fā)現(xiàn)ASC-1,就可以說明發(fā)生了FE。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究共納入來自北京積水潭醫(yī)院的30例受試者,其中4例非手術(shù)患者,26例手術(shù)患者；男9 例,女21 例；年齡范圍為46～84歲；身高范圍為148～180 cm；體質(zhì)量范圍為50～88 kg。本研究經(jīng)北京積水潭醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(積倫科審字第201811-08號(hào)-備01號(hào))。研究遵循的程序符合北京積水潭醫(yī)院倫理委員會(huì)所制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。所有納入者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本收集 取6例預(yù)行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)或膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者 (既往無外傷史及手術(shù)史)術(shù)前全血各3 ml,取4例非手術(shù)患者 (既往無外傷史及手術(shù)史)入院時(shí)全血各3 ml,取10例行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)或膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者術(shù)后24 h全血各3 ml。不抗凝,室溫血液自然凝固10～20 min,1300×g離心10 min。取分離出的血清凍存于-80 ℃冰箱,備用。取10例行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)或膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者術(shù)中廢棄的黃骨髓各1 ml,皮下脂肪或關(guān)節(jié)腔內(nèi)脂肪各1 cm3,凍存于-80 ℃冰箱,備用。

1.2.2 脂肪和黃骨髓的處理 切割標(biāo)本后,稱取重量100 mg。剪成小塊,用1 ml PBS洗滌2次,500×g離心5 min,小心棄上清。向組織樣品中加入1 ml總蛋白提取緩沖液 (北京全式金生物技術(shù)有限公司),振蕩混勻,將組織懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的玻璃勻漿器中,勻漿6～10次。將勻漿后的組織懸液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5 ml離心管中,冰上孵育30 min,期間每 10 分鐘振蕩混勻1 次。4 ℃,1400×g離心10 min。小心收集上清 (細(xì)胞總蛋白)于-80 ℃保存,或直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 標(biāo)本融化后仍然保持2～8℃的溫度。加入一定量的PBS (p H 7.4),用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。1300×g離心20 min。仔細(xì)收集上清。分裝后1份待檢測(cè),其余冷凍備用。共收集40份標(biāo)本,其中血清20份 (術(shù)前10份,術(shù)后24 h 10份),黃骨髓10份,下肢皮下脂肪組織5份,膝或髖關(guān)節(jié)腔內(nèi)脂肪5份。

1.2.4 ASC-1 的檢測(cè) 采用美國Andy Gene Biotechnology公司生產(chǎn)的人ASC-1酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒。按說明書操作。該試劑盒檢測(cè)范圍：30～1 200 ng/L。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究采用前瞻性對(duì)照研究,存在自身對(duì)照和組間對(duì)照。因病例較少,ASC-1的濃度不符合正態(tài)分布,以M (QR)來描述。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況 本研究共納入30例受試者,標(biāo)本共40份。術(shù)前患者中有2例老年女性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者血清檢測(cè)到ASC-1,1例經(jīng)再次詢問病史,發(fā)現(xiàn)其術(shù)前接受過小針刀治療和關(guān)節(jié)鏡檢查,1例術(shù)前接受過按摩治療。術(shù)后患者中有3例血清檢測(cè)到ASC-1,1例為單側(cè)全髖置換術(shù)后,2例為單側(cè)全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后。這3例患者術(shù)后病情穩(wěn)定,未發(fā)現(xiàn)明顯不適,除手術(shù)傷口附近以外,未發(fā)現(xiàn)皮膚散在瘀點(diǎn)和瘀斑,均于術(shù)后24 h出現(xiàn)血WBC升高,中性粒細(xì)胞比例升高,血紅蛋白水平降低,血小板水平降低,術(shù)后2～3 d的低熱。術(shù)后3～4 d出院,院外隨診未發(fā)現(xiàn)異常。其余7例術(shù)后患者也出現(xiàn)了血WBC 升高,中性粒細(xì)胞比例升高,血紅蛋白水平降低,血小板水平降低,術(shù)后2～3 d低熱的情況。6號(hào)標(biāo)本 (術(shù)前)和11號(hào)標(biāo)本 (術(shù)后)來自同一男性患者,血清中均未測(cè)出ASC-1。5號(hào)標(biāo)本 (術(shù)前)和16號(hào)標(biāo)本 (術(shù)后)來自同一女性患者,血清中均測(cè)出ASC-1,且術(shù)后高于術(shù)前水平。7號(hào)標(biāo)本 (術(shù)前)和12 號(hào)標(biāo)本 (術(shù)后)來自同一女性患者,血清中均測(cè)出ASC-1,但術(shù)后低于術(shù)前水平。見表1。

2.2 不同標(biāo)本來源的ASC-1濃度 非手術(shù)患者血清中未檢測(cè)到ASC-1,下肢皮下脂肪5例均檢測(cè)到ASC-1,5例患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)脂肪組織的均漿液中4例未檢測(cè)到ASC-1,1 例檢測(cè)到ASC-1,水平較低。共取下肢長(zhǎng)骨內(nèi)黃骨髓10 例,5 例檢測(cè)到ASC-1 (表2)。

表2 不同標(biāo)本來源的ASC-1濃度 (ng/L)

3 討論

目前,國內(nèi)外對(duì)于FE 的診斷主要依賴對(duì)肺、腦、腎等部位的病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)小血管中存在脂肪栓子。但此法多用于患者死亡后的尸體解剖,故大大限制了應(yīng)用。脂肪栓子不同于血栓栓子,脂肪栓子微小且分散,多以脂肪滴形式存在于血循環(huán)中,或嵌頓在小的血管中,故影像學(xué)檢查無論是CT、MRI幾乎沒有特異性改變[15]。實(shí)驗(yàn)室檢查中的痰、支氣管肺泡灌洗液和尿中發(fā)現(xiàn)脂肪滴和血中巨脂肪球也不具有特異性,在非FE 患者中也常見到[11,16]。因?yàn)檎Ｇ闆r下,人血循環(huán)中也存在甘油三酯、膽固醇及乳糜顆粒等成分。目前,尚無易操作、特異且敏感的FE診斷方法。

關(guān)于FES的診斷方法,臨床普遍采用1974年Gurd和 Wilson[10]提出的FES 診斷標(biāo)準(zhǔn)。診斷須有損傷和潛伏期,且滿足至少1條主要條件和至少4條次要條件。主要條件：呼吸功能不全；腦功能障礙；瘀血點(diǎn)。次要條件：發(fā)熱；心動(dòng)過速；視網(wǎng)膜改變；黃疸；腎功能異常 (包括少尿、無尿、血尿)；貧血；血小板減少；ESR 加快；血中發(fā)現(xiàn)巨脂肪球。該標(biāo)準(zhǔn)主要依靠臨床表現(xiàn),實(shí)驗(yàn)室檢查的各項(xiàng)指標(biāo)均缺乏特異性,漏診率很高。不少患者很難和創(chuàng)傷所致腦部損傷、肺部損傷等疾病相鑒別。有些學(xué)者對(duì)FES的診斷進(jìn)行了改良[17-19],另一些學(xué)者對(duì)高危患者進(jìn)行評(píng)分,以此確定FES的診斷,但都因缺乏特異性和有效性,限制了臨床應(yīng)用[20]。

造成FE的栓子來源主要有兩方面：(1)骨髓來源。骨髓存在于骨松質(zhì)腔隙和長(zhǎng)骨骨髓腔內(nèi),由多種類型的細(xì)胞和網(wǎng)狀結(jié)締組織構(gòu)成,根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同分為紅骨髓和黃骨髓。幼兒的骨髓腔內(nèi)全部為紅骨髓,5歲以后長(zhǎng)骨內(nèi)的紅骨髓,逐漸被脂肪組織所代替,成為黃骨髓。至18歲以后,全身長(zhǎng)骨骨干幾乎充滿了黃骨髓。紅骨髓分布在扁骨 (顱骨、胸骨、肋骨、髂骨),椎骨,鎖骨,肩胛骨以及長(zhǎng)骨的骺的骨松質(zhì)中。黃骨髓主要由脂肪組織構(gòu)成,即骨髓的基質(zhì)細(xì)胞大量變?yōu)橹炯?xì)胞,僅有少量幼稚細(xì)胞團(tuán),其造血功能微弱。當(dāng)長(zhǎng)骨骨折發(fā)生時(shí),骨髓腔內(nèi)的脂肪細(xì)胞受到擠壓和破壞,經(jīng)破損的血管進(jìn)入血循環(huán),FE 隨即發(fā)生。髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)等置換術(shù)時(shí),為了固定人工關(guān)節(jié),關(guān)節(jié)假體的一端需要牢牢地嵌入骨髓腔內(nèi)。嵌入并固定的過程中,骨髓腔內(nèi)壓力很大,非常容易將骨髓腔內(nèi)的黃骨髓,也就是脂肪細(xì)胞壓碎,擠進(jìn)血管,進(jìn)入血循環(huán),FE隨即發(fā)生。所以,骨髓腔內(nèi)黃骨髓中的脂肪細(xì)胞是FE栓子的主要來源。因此長(zhǎng)骨骨折、關(guān)節(jié)置換術(shù)患者是FE的高危人群。(2)皮下或臟器周圍脂肪細(xì)胞來源。當(dāng)創(chuàng)傷發(fā)生時(shí),軟組織受到擠壓和破壞,破碎的脂肪細(xì)胞會(huì)被擠進(jìn)受損的血管,進(jìn)入血循環(huán),導(dǎo)致FE。脂肪移植手術(shù)時(shí),當(dāng)向目標(biāo)部位注射脂肪細(xì)胞時(shí),為了達(dá)到美容效果,局部壓力或張力往往較高,會(huì)導(dǎo)致脂肪細(xì)胞進(jìn)入血管,造成FE。所以皮下或臟器周圍脂肪細(xì)胞是FE 栓子的另一主要來源。創(chuàng)傷及脂肪移植術(shù)患者也是FE的高危人群。

2014年,哈佛醫(yī)學(xué)院的Ussar等[21]學(xué)者確定了人脂肪細(xì)胞膜特異性蛋白ASC-1,該研究論文發(fā)表在影響因子為16.79的 《Science Translational Medicine》上。ASC-1蛋白在其他細(xì)胞和組織中很少表達(dá),尚未檢索到在血液中表達(dá)的報(bào)道。以上的研究成果為從分子水平對(duì)FE 進(jìn)行診斷奠定了基礎(chǔ)。故筆者提出假設(shè)：如果在人的外周血液中檢測(cè)到脂肪細(xì)胞膜特異性蛋白,說明存在FE。FE的栓子微小且分散,多以脂肪滴形式存在于血循環(huán)中。FE發(fā)生時(shí),較小碎片可以通過肺循環(huán)到達(dá)體循環(huán)[15-16],故推測(cè)在外周血中可以檢測(cè)到脂肪細(xì)胞膜特異性蛋白ASC-1,當(dāng)該蛋白在血中的含量高到一定水平時(shí),即可發(fā)生FES。該假設(shè)如能被證實(shí),只需取患者少量外周血進(jìn)行檢測(cè)即可進(jìn)行診斷。其結(jié)果可以用于FES與腦部損傷、肺部損傷的鑒別,應(yīng)用前景廣闊。

Ussar等[21]學(xué)者發(fā)現(xiàn)ASC-1 在人的皮下、頸動(dòng)脈鞘、頸長(zhǎng)肌的脂肪細(xì)胞中含量很高。但他們未對(duì)人黃骨髓脂肪細(xì)胞中ASC-1的表達(dá)情況進(jìn)行研究。筆者尚未檢索到在正常人血中檢測(cè)到ASC-1的報(bào)道。也未檢索到將ASC-1作為FE診斷指標(biāo)的研究。為了證實(shí)筆者提出的假設(shè),首先需證實(shí)人皮下脂肪細(xì)胞和骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞中存在上述蛋白,然后需證實(shí)正常人外周血中無上述蛋白或僅有微量存在。如果在骨折患者外周血和/或關(guān)節(jié)置換術(shù)后患者外周血中檢測(cè)到上述蛋白,且含量顯著高于正常人血中含量,即可證明FE 的存在。上述蛋白濃度高到一定程度,可能發(fā)生FES。為此,筆者在少量受試者中進(jìn)行了初步的探索。本研究結(jié)果顯示：(1)非手術(shù)患者 (內(nèi)科患者)血清中和絕大部分擇期關(guān)節(jié)置換術(shù)患者術(shù)前血清中未檢測(cè)到ASC-1。(2)擇期關(guān)節(jié)置換術(shù)患者術(shù)前有2例血清中檢測(cè)到ASC-1,均為膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎老年女性患者,病史均為10年。其中1例ASC-1水平較高者,入院前接受過小針刀、關(guān)節(jié)鏡等檢查和治療,推測(cè)這些有創(chuàng)性的操作可能會(huì)導(dǎo)致ASC-1水平的升高。另1例ASC-1水平為58.0 ng/L,稍高于檢測(cè)下限。該患者未發(fā)現(xiàn)入院前接受過有創(chuàng)操作,但接受過推拿按摩,ASC-1 水平高于檢測(cè)下限原因尚需探究。(3)10例患者人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后24 h的血清中有3例檢測(cè)到ASC-1。其中最高的1例為全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者,另2例為全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者。推測(cè)這是由于髖關(guān)節(jié)置換術(shù)對(duì)骨髓腔的影響比膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的影響大,導(dǎo)致更多脂肪細(xì)胞受到破壞,進(jìn)而更多的ASC-1蛋白進(jìn)入血循環(huán)。3例患者術(shù)后除傷口疼痛以外,沒有明顯不適主訴。術(shù)后24 h血常規(guī)檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)WBC 升高,血小板降低,血紅蛋白降低。體溫于術(shù)后有1～3 d的低熱,均于手術(shù)后3～4 d出院。出院后的隨診,未見明顯異常。推測(cè)這3例患者很有可能發(fā)生了無癥狀FE。(4)5例患者皮下脂肪組織的均漿液中,均檢測(cè)到ASC-1的存在,證實(shí)了在人腿部皮下脂肪中存在ASC-1。(5)5例患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)脂肪組織的均漿液中,1例檢測(cè)到ASC-1的存在,但濃度較低。關(guān)節(jié)腔中的脂肪組織是否有異于皮下脂肪,需進(jìn)一步研究。(6)取自下肢長(zhǎng)骨的10例黃骨髓中,5例檢測(cè)到了ASC-1 的存在,另5 例未檢測(cè)到ASC-1。黃骨髓的獲取時(shí)多數(shù)都混入血液,此因素可能會(huì)影響到ASC-1的水平。黃骨髓中ASC-1的表達(dá)情況,還需進(jìn)一步研究。(7)有3例患者為術(shù)前、術(shù)后自身對(duì)照,出現(xiàn)了3種情況,即術(shù)前術(shù)后均未測(cè)出、術(shù)后水平高于術(shù)前、術(shù)后水平低于術(shù)前。因?yàn)槔龜?shù)太少,需要擴(kuò)大例數(shù)以減少實(shí)驗(yàn)偏倚。

本研究在部分患者外周血中檢測(cè)到了脂肪細(xì)胞膜特異性蛋白ASC-1。研究納入的手術(shù)患者均為擇期關(guān)節(jié)置換術(shù)患者,近2年內(nèi)未發(fā)生骨折。手術(shù)過程中需要將人工關(guān)節(jié)假體嵌入并固定于骨髓腔,非常容易將骨髓腔內(nèi)的黃骨髓,也就是脂肪細(xì)胞壓碎,擠進(jìn)血管,進(jìn)入血循環(huán)。故推測(cè)ASC-1主要來源為骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞。手術(shù)中需要切開皮膚及皮下脂肪等組織進(jìn)入關(guān)節(jié)腔,并切除多余的關(guān)節(jié)腔內(nèi)脂肪組織。安裝人工關(guān)節(jié)時(shí),對(duì)周圍皮下脂肪會(huì)有擠壓,故推測(cè)皮下脂肪細(xì)胞是血中ASC-1的次要來源。關(guān)節(jié)腔內(nèi)脂肪細(xì)胞來源可能性很小。3例術(shù)后血中檢測(cè)到ASC-1的患者沒有明顯的不適主訴,不符合1974年FES診斷標(biāo)準(zhǔn),但不能排除他們發(fā)生了無臨床癥狀的FE。

本研究的優(yōu)點(diǎn)是提出了從分子水平對(duì)FE 進(jìn)行診斷的新思路,為尋找敏感、特異的FE 診斷指標(biāo)提供了可能。缺點(diǎn)是因既往無相關(guān)研究,本研究為初期探索試驗(yàn),例數(shù)少,并非所有納入患者均為自身對(duì)照。支持本研究假設(shè)的結(jié)果是：非手術(shù)的患者血清中均未檢測(cè)到ASC-1,術(shù)前患者大部分未檢測(cè)到ASC-1；皮下脂肪中均檢測(cè)到ASC-1；黃骨髓中也檢測(cè)到ASC-1。不支持的結(jié)果是：關(guān)節(jié)腔內(nèi)脂肪幾乎都未測(cè)出ASC-1；自身對(duì)照患者術(shù)后血清中的ASC-1濃度并非都高于術(shù)前。本研究所用試劑盒的監(jiān)測(cè)范圍在30～1 200 ng/L,可能會(huì)影響含量較低樣本的檢測(cè)結(jié)果。由于臨床中發(fā)生的FE 如果沒有明顯癥狀,往往被漏診。有明顯癥狀的根據(jù)上述1974年診斷標(biāo)準(zhǔn),疑診或確診為FES。本研究中納入者中,雖然沒有滿足1974年FES診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者,但很有可能存在FE 患者,因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)了術(shù)后SAC-1水平高于術(shù)前的患者。

綜上所述,本研究為從分子水平對(duì)FE 進(jìn)行診斷提供了初期研究資料。脂肪細(xì)胞膜特異性蛋白ASC-1可能成為FE診斷的特異性指標(biāo),但需進(jìn)一步研究以證實(shí)其臨床應(yīng)用價(jià)值。未來筆者將從擴(kuò)大樣本量、加強(qiáng)自身對(duì)照、提高試劑盒敏感度、尋找其他脂肪細(xì)胞或脂肪組織特異性標(biāo)志物等方面來開展進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

致謝感謝北京積水潭醫(yī)院矯形骨科褚亞明醫(yī)師、姜旭醫(yī)師、呂明醫(yī)師、唐竟醫(yī)師,檢驗(yàn)科邱爽醫(yī)師,腎內(nèi)科楊潔醫(yī)師、王曉飛醫(yī)師、陳天怡醫(yī)師,呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科戴麗醫(yī)師、王艷醫(yī)師、徐志新護(hù)士對(duì)本研究的幫助和支持