• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大黃素對(duì)哮喘小鼠氣道重塑的干預(yù)效果及機(jī)制

    2019-08-02 01:25:50袁曉芳王宋平
    廣西醫(yī)學(xué) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:小鼠

    袁曉芳 王宋平

    (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸一科,四川省瀘州市 646000,電子郵箱:840786087@qq.com)

    哮喘是由包括嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病,病程的延長(zhǎng)可導(dǎo)致一系列氣道結(jié)構(gòu)的改變,即氣道重塑[1]。氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的兩個(gè)重要特征。氣道重塑主要包括氣道管壁增厚、氣道上皮下纖維化、平滑肌細(xì)胞增生肥大、肌成纖維細(xì)胞增生以及腺上皮化生,其中以基底膜下Ⅰ型、Ⅲ型、V型膠原纖維和纖維連接素等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積增加,肌成纖維細(xì)胞活化及增殖為突出表現(xiàn)。哮喘患者體內(nèi)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)水平呈升高趨勢(shì),在肺組織中許多細(xì)胞,如氣道上皮細(xì)胞、白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及T細(xì)胞等,均能產(chǎn)生TGF-β1,而TGF-β1在氣道上皮下纖維化及氣道平滑肌重塑中起著重要作用[2-4]?;|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)和特異性?xún)?nèi)源性抑制因子之間的平衡在氣道壁基質(zhì)沉積和結(jié)構(gòu)重塑中發(fā)揮重要的作用,其可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化,促進(jìn)新生血管形成,刺激成纖維細(xì)胞的增生并合成膠原等多種機(jī)制引起氣道重塑[5]。

    大黃素是中藥大黃的重要單體,具有抑菌、抗炎、保護(hù)肝腎、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗癌等作用,具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái),研究顯示大黃素有降低TGF-β1及MMP-9的表達(dá),以及減少膠原沉積的作用[6-8]。然而大黃素是否能通過(guò)影響支氣管肺組織中TGF-β1、MMP-9的表達(dá),以及氣道膠原的沉積,從而抑制哮喘氣道重塑,目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏相關(guān)研究。本研究通過(guò)建立哮喘小鼠氣道重塑模型,觀察大黃素對(duì)哮喘氣道重塑的影響,并探討其可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠32只(重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷(xiāo)售有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):21100230045566),6~8周齡,體重(20±2)g。將小鼠標(biāo)號(hào),采用抽簽法隨機(jī)分為正常組(A組)、哮喘組(B組)、哮喘+小劑量大黃素組(C組)、哮喘+大劑量大黃素組(D組),每組8只。

    1.2 主要試劑及儀器 卵清蛋白(Sigma公司,批號(hào):A8040),大黃素(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):E8390),氫氧化鋁(上海源葉科技有限公司,批號(hào):S30353),兔抗鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原一抗(Abcam公司,批號(hào):ab90395),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔Ⅰ型、Ⅲ型膠原二抗(Aspen有限公司,批號(hào):ab7778),MMP-9酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定試劑盒(優(yōu)爾生公司,批號(hào):SEA553Ra),TGF-β1 引物(武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司),熒光定量PCR儀(Life Technologies公司,型號(hào):StepOne),酶標(biāo)儀(DiaTek公司,型號(hào):DR-200BS),病理切片機(jī)(武漢恒意賽生物科技有限公司,型號(hào):RM2016),光學(xué)顯微鏡(Olympus公司,型號(hào):CX31),恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,型號(hào):GNP9160)。

    1.3 哮喘氣道重塑模型制備及給藥方式 參照文獻(xiàn)[9]方法制造哮喘氣道重塑模型。B、C、D組小鼠自實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周開(kāi)始,第0、7、14天腹腔注射卵清蛋白致敏液200 μL(含100 μg卵清蛋白+2 mg氫氧化鋁),第21天以卵清蛋白激發(fā)液(含50 μg卵清蛋白)滴鼻建立支氣管哮喘氣道重塑模型,50 μL/次,3次/周,連續(xù)6周。C、D組自第21天起分別給予40 mg/(kg·d)、80 mg/(kg·d)大黃素[10]灌胃,A、B組以等量生理鹽水灌胃,連續(xù)給藥6周。滴鼻與灌胃時(shí)間間隔無(wú)特殊要求。

    1.4 肺組織標(biāo)本收集 于末次激發(fā)后24 h內(nèi)斷頸處死各組小鼠,將小鼠固定于手術(shù)板上,暴露胸腔,無(wú)菌條件下迅速取出左肺組織放于-80℃冰箱保存,備用于TGF-β1及MMP-9的檢測(cè)。無(wú)菌條件下取出右肺組織用4%多聚甲醛固定,備用于蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson染色、免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

    1.5 觀察指標(biāo)

    1.5.1 支氣管肺組織病理學(xué)改變:將部分支氣管肺組織脫水、包埋及切片,經(jīng)蘇木素染細(xì)胞核、伊紅染細(xì)胞質(zhì)及脫水封片后,在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察支氣管肺組織病理學(xué)改變情況,觀察內(nèi)容包括支氣管壁厚度、氣道上皮損傷程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。

    1.5.2 氣道重塑指標(biāo):將部分支氣管肺組織脫水、包埋及切片,再將石蠟切片脫蠟至水,將肺組織經(jīng)Masson染色后,在200倍光學(xué)顯微鏡下,每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取3個(gè)直徑在100~200 μm的完整支氣管橫截面,取其均值,采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)量支氣管基底膜周徑、支氣管總面積、支氣管管腔面積、平滑肌外緣內(nèi)氣管面積、平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積,同時(shí)用支氣管基底膜周徑將測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)化,標(biāo)準(zhǔn)化平滑肌厚度=(平滑肌外緣內(nèi)氣管面積-平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積)/支氣管基底膜周徑,標(biāo)準(zhǔn)化支氣管壁厚度=(支氣管總面積-支氣管管腔面積)/支氣管基底膜周徑。同時(shí)在200倍鏡下同一樣本隨機(jī)選取3個(gè)視野,采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)量膠原面積、整個(gè)圖像總面積,計(jì)算膠原面積比,膠原面積比=(膠原面積/整個(gè)圖像總面積)×100%。

    1.5.3 肺組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量:取出右中葉肺組織后,脫水、包埋,將石蠟切片常規(guī)脫蠟后經(jīng)乙二胺四乙酸緩沖液微波修復(fù),經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液清洗(5 min/次,共3次)后放入3%過(guò)氧化氫溶液中,室溫下避光孵育,經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液清洗(5 min/次,共3次)后再用5%牛血清白蛋白封閉。去除牛血清白蛋白后,分別加入1 ∶150兔抗鼠Ⅰ型膠原一抗及1 ∶100的兔抗鼠Ⅲ型膠原一抗覆蓋組織,4℃過(guò)夜,經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液清洗(5 min/次,共3次),再分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅰ型二抗及山羊抗兔Ⅲ型膠原二抗,37℃孵育50 min,去除磷酸緩沖鹽溶液后加入二氨基聯(lián)苯胺溶液,顯色并洗凈后用蘇木素復(fù)染,經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明后,中性樹(shù)膠封固。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照,用磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作為陰性對(duì)照。用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各組Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量,以積分光密度值表示。

    1.5.4 肺組織TGF-β1 mRNA的表達(dá):用無(wú)菌方法取約100 g肺組織,置于1 mL預(yù)冷的總RNA抽提試劑中充分研磨,加入三氯甲烷4℃ 10 000 g離心10 min,加入異丙醇再次于4℃ 10 000 g離心10 min,最后加入75%乙醇再次于4℃ 10 000 g離心10 min,待酒精完全揮發(fā)后提取肺組織RNA,在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA。小鼠TGF-β1上游引物為5′-GTGGCTGAACCAAGGAGACG-3′,下游引物為5′-AGGTGTTGAGCCCTTTCCAG-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度為195 bp;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上游引物為 5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′,下游引物為5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度為201 bp。PCR反應(yīng)體系包括2×實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)混合物5 μL,引物工作液1 μL,模板液1 μL,蒸餾水2.8 μL,ROX參比液0.2 μL。PCR反應(yīng)為95℃下預(yù)變性1 min,然后95℃變性15 s,退火溫度為58℃,20 s,72℃延伸45 s,共40個(gè)循環(huán)。其溶解曲線為60℃→95℃,每20 s升溫1℃。PCR結(jié)束后,采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

    1.5.5 肺組織MMP-9含量:按照酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)小鼠肺組織MMP-9含量。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,多組比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組小鼠一般情況 建立支氣管哮喘氣道重塑模型后,A組小鼠活潑好動(dòng),毛發(fā)光滑,呼吸平穩(wěn);B組小鼠煩躁不安,頻繁打噴嚏,呼吸急促伴口唇發(fā)紺,部分小鼠出現(xiàn)小便失禁;C、D組小鼠均有打噴嚏、呼吸急促等狀況,但程度較B組小鼠輕。

    2.2 各組小鼠支氣管肺組織病理學(xué)改變 A組小鼠支氣管管腔完整,內(nèi)壁光滑,上皮未見(jiàn)明顯損害,管腔未見(jiàn)上皮細(xì)胞脫落,支氣管內(nèi)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);B組小鼠支氣管管壁明顯增厚,黏膜上皮增生明顯,支氣管平滑肌層增厚,腔內(nèi)可見(jiàn)黏液滲出,支氣管內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯;C組小鼠支氣管管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落上皮及少許滲出,管腔可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);D組小鼠支氣管管腔可見(jiàn)少許脫落上皮及滲出,管腔炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。見(jiàn)圖1。

    圖1 各組小鼠支氣管肺組織病理學(xué)改變(HE染色,×200)

    2.3 各組標(biāo)準(zhǔn)化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、膠原面積比比較 B、C、D組標(biāo)準(zhǔn)化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、膠原面積比均厚于或大于A組,B組、C組、D組上述指標(biāo)依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 各組標(biāo)準(zhǔn)化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、膠原面積比比較(x±s)

    注:▲實(shí)驗(yàn)中死亡2只。與A組比較,△P<0.05;與B組比較,*P<0.05;與C組比較,#P<0.05。

    2.4 各組肺組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的比較 Ⅰ、Ⅲ型膠原在4組肺組織中均有表達(dá)。B、C、D組Ⅰ、Ⅲ型膠原水平均較A組升高,B、C、D組上述指標(biāo)依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

    表2 各組Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的比較(x±s)

    注:▲實(shí)驗(yàn)中死亡2只。與A組比較,△P<0.05;與B組比較,*P<0.05;與C組比較,#P<0.05。

    2.5 各組肺組織TGF-β1 mRNA表達(dá)水平及MMP-9含量的比較 B、C、D組TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平、MMP-9含量均高于A組,B、C、D組上述指標(biāo)依次降低(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

    表3 各組肺組織TGF-β1 mRNA表達(dá)水平及MMP-9含量的比較(x±s)

    注:▲實(shí)驗(yàn)中死亡2只。與A組比較,△P<0.05;與B組比較,*P<0.05;與C組比較,#P<0.05。

    3 討 論

    哮喘是常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病之一,其患病率在全球范圍內(nèi)有逐年增加的趨勢(shì)[11]。氣道重塑是哮喘的重要特征,它包括杯狀細(xì)胞增生、上皮下膠原沉積、平滑肌增生肥大等。氣道重塑程度與哮喘的嚴(yán)重程度密切相關(guān),且氣道重塑在哮喘的早期即已出現(xiàn),并隨疾病進(jìn)程呈進(jìn)行政性加重;即使哮喘癥狀獲得短暫緩解,氣道重塑仍呈進(jìn)行性加重,并伴有肺功能的下降,可發(fā)展為不可逆的氣道阻塞[12]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)卵清蛋白致敏的B、C、D組哮喘小鼠標(biāo)準(zhǔn)化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、氣道基底膜下膠原面積均增加(P<0.05),提示3組小鼠均存在氣道重塑。

    TGF-β具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的作用,是由巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生的促纖維化細(xì)胞因子,與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[13]。許多學(xué)者認(rèn)為T(mén)GF-β1在過(guò)敏性氣道炎癥及氣道重塑中起著重要的主導(dǎo)作用,其不僅可以通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、P38、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、C-jun氨基末端激酶等通路的激活,誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和肥大,還可以通過(guò)誘導(dǎo)哮喘氣道上皮細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致成纖維細(xì)胞數(shù)量增加,并引起ECM的蛋白合成和分泌,從而參與氣道重塑[4,14]。本研究結(jié)果顯示,B、C、D組TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于A組(P<0.05),與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相符,進(jìn)一步說(shuō)明TGF-β1參與氣道重塑。

    MMP是由20多種高度保守的鋅、鈣離子依賴(lài)性蛋白內(nèi)切酶所組成的蛋白,可降解ECM。MMP及其組織抑制劑之間的平衡在合成及降解氣道ECM中發(fā)揮重要作用。MMP-9作為MMP主要的存在形式,與哮喘有著密切聯(lián)系。研究表明,哮喘狀態(tài)下肺組織中MMP-9表達(dá)明顯升高,這可引起上皮成纖維細(xì)胞增殖、活化,以及大量膠原纖維增生,從而促進(jìn)氣道重塑[15]。MMP-9不僅能引起膠原蛋白Ⅲ、膠原蛋白Ⅴ和肌腱蛋白沉積,還可降解ECM中的大部分成分如Ⅳ型膠原,并且通過(guò)釋放固定化生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)平滑肌增生,而增生的平滑肌細(xì)胞進(jìn)一步釋放MMP-9,從而加重氣道重塑。除此之外,MMP-9還可以促使平滑肌細(xì)胞移行到血管基質(zhì),擴(kuò)大血管的表面積,使血管壁變薄,促進(jìn)新血管形成,從而參與氣道重塑中的血管重構(gòu)[16]。本研究結(jié)果顯示,B、C、D組MMP-9含量高于A組(P<0.05),提示MMP-9可能與氣道重塑密切關(guān)系。

    大黃素為中藥大黃、百合等的活性成分,是單蒽核類(lèi)1,6,8-三羥基蒽醌衍生物。近年來(lái),有研究發(fā)現(xiàn)大黃素不僅能降低哮喘氣道炎癥,其對(duì)肺纖維化及慢性胰腺纖維化也有緩解作用[6,17]。本研究結(jié)果顯示,B、C、D組標(biāo)準(zhǔn)化支氣管壁厚度及平滑肌厚度、氣道基底膜下膠原面積比、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平依次減小或降低(均P<0.05),提示大黃素可能是通過(guò)降低TGF-β1 mRNA表達(dá)從而改善哮喘小鼠氣道重塑,且大劑量的大黃素對(duì)氣道重塑的抑制作用更明顯。國(guó)內(nèi)外研究也證實(shí)大黃素極可能通過(guò)Smad 2/3/7通路負(fù)性調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)而改善氣道重塑[18-19]。本研究結(jié)果還顯示,B、C、D組肺組織中MMP-9及Ⅰ、Ⅲ型膠原含量依次降低(均P<0.05),提示大黃素還可能通過(guò)降低MMP-9及Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量,從而減輕氣道重塑,且大劑量的大黃素的作用更明顯。其可能是通過(guò)抑制MAPK激酶的激酶-MAPK激酶-MAPK信號(hào)通路,降低核轉(zhuǎn)錄因子-κB活化,以及抑制p38-MAPK和Janus激酶-信號(hào)傳導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子信號(hào)通路的激活,從而改善氣道重塑[19-22]。

    綜上所述,大黃素可改善哮喘小鼠氣道重塑,且大劑量的抑制作用更明顯;其機(jī)制可能與大黃素抑制TGF-β1 mRNA、MMP-9、氣道壁Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達(dá)有關(guān)。

    猜你喜歡
    小鼠
    晚安,大大鼠!
    萌小鼠,捍衛(wèi)人類(lèi)健康的“大英雄”
    視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞再生令小鼠復(fù)明
    科學(xué)(2020年3期)2020-11-26 08:18:30
    小鼠大腦中的“冬眠開(kāi)關(guān)”
    今天不去幼兒園
    清肝二十七味丸對(duì)酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:19:34
    米小鼠和它的伙伴們
    高氟對(duì)C57BL/6J小鼠睪丸中AQP1、AQP4表達(dá)的影響
    Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
    加味四逆湯對(duì)Con A肝損傷小鼠細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
    少妇精品久久久久久久| 久久6这里有精品| 亚洲美女视频黄频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久精品国产自在天天线| 国产精品99久久久久久久久| 色综合色国产| 99热这里只有是精品50| 国产精品成人在线| 久久人人爽人人片av| 亚洲精品视频女| 内射极品少妇av片p| 精品国产三级普通话版| 色综合色国产| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 欧美高清成人免费视频www| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 我的老师免费观看完整版| 在线精品无人区一区二区三 | 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲av日韩在线播放| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 青春草国产在线视频| 国产视频内射| 丰满少妇做爰视频| 精品久久久久久电影网| 男女免费视频国产| 国产精品99久久久久久久久| 精品一品国产午夜福利视频| 99热这里只有精品一区| 2021少妇久久久久久久久久久| 舔av片在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲精品国产av成人精品| 成人特级av手机在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩免费高清中文字幕av| 成人影院久久| 一级毛片 在线播放| 99视频精品全部免费 在线| 久久久精品免费免费高清| 99热全是精品| 简卡轻食公司| 能在线免费看毛片的网站| 七月丁香在线播放| 欧美xxⅹ黑人| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 久久久久久久久久成人| 99久久人妻综合| 大香蕉97超碰在线| 青青草视频在线视频观看| 久久久久久伊人网av| 欧美日韩精品成人综合77777| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久这里有精品视频免费| av女优亚洲男人天堂| 在线观看三级黄色| av免费观看日本| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品一二三| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲成人手机| 国产精品爽爽va在线观看网站| 一本色道久久久久久精品综合| 国产一区二区三区av在线| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品日韩av片在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美成人a在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 精品亚洲成国产av| 黄色一级大片看看| 亚洲av中文av极速乱| 深夜a级毛片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一级毛片aaaaaa免费看小| 一个人免费看片子| 亚洲av成人精品一区久久| 少妇精品久久久久久久| tube8黄色片| 丝瓜视频免费看黄片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 中文字幕亚洲精品专区| 麻豆乱淫一区二区| 国产高潮美女av| 熟女电影av网| 精品少妇黑人巨大在线播放| 欧美人与善性xxx| 内地一区二区视频在线| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产淫片久久久久久久久| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲精品国产av成人精品| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产美女午夜福利| 秋霞在线观看毛片| 久久久久性生活片| 国产精品久久久久久久久免| 九九爱精品视频在线观看| 免费少妇av软件| 久热这里只有精品99| h视频一区二区三区| 国产午夜精品一二区理论片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 成人一区二区视频在线观看| 久热这里只有精品99| 亚洲无线观看免费| 久久精品国产亚洲av涩爱| 免费少妇av软件| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产成人精品一,二区| 青春草国产在线视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产日韩欧美亚洲二区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日日啪夜夜爽| 熟妇人妻不卡中文字幕| 香蕉精品网在线| 欧美成人午夜免费资源| 免费在线观看成人毛片| 亚洲图色成人| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲色图av天堂| 国产免费福利视频在线观看| 精品一区二区免费观看| 久久久久久久精品精品| 国产精品伦人一区二区| 国产探花极品一区二区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲精品视频女| 欧美精品一区二区大全| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日韩国内少妇激情av| 99re6热这里在线精品视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 99热这里只有是精品50| 国产色婷婷99| 午夜视频国产福利| 性高湖久久久久久久久免费观看| 身体一侧抽搐| 1000部很黄的大片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 成人免费观看视频高清| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲久久久国产精品| 日韩成人伦理影院| 色综合色国产| 亚洲欧美精品专区久久| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品一及| 99久久精品热视频| 国产精品三级大全| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 综合色丁香网| 美女cb高潮喷水在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 最近的中文字幕免费完整| 下体分泌物呈黄色| 亚洲人与动物交配视频| 欧美3d第一页| 欧美高清性xxxxhd video| 少妇精品久久久久久久| 免费大片黄手机在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 精品国产露脸久久av麻豆| 夫妻性生交免费视频一级片| 人妻一区二区av| 看十八女毛片水多多多| 日本免费在线观看一区| 一区二区三区精品91| 99热国产这里只有精品6| 五月伊人婷婷丁香| 高清av免费在线| 欧美zozozo另类| 91久久精品国产一区二区成人| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲精品第二区| 欧美成人午夜免费资源| 老熟女久久久| 中文在线观看免费www的网站| 中文欧美无线码| 99热网站在线观看| 亚洲精品色激情综合| 成人国产麻豆网| 黑人高潮一二区| 哪个播放器可以免费观看大片| 草草在线视频免费看| 九色成人免费人妻av| 偷拍熟女少妇极品色| 91精品伊人久久大香线蕉| 99久国产av精品国产电影| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲中文av在线| 亚洲成人av在线免费| 久久人妻熟女aⅴ| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 男女边吃奶边做爰视频| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲人成网站在线播| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲第一区二区三区不卡| av国产免费在线观看| 99久久综合免费| 直男gayav资源| 久久国产精品大桥未久av | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 丰满迷人的少妇在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| www.av在线官网国产| 精品国产露脸久久av麻豆| 日本色播在线视频| 一级毛片电影观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产色爽女视频免费观看| 久久久精品免费免费高清| 成人免费观看视频高清| 日韩人妻高清精品专区| 国产精品成人在线| 一本色道久久久久久精品综合| 久久ye,这里只有精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 欧美成人一区二区免费高清观看| 日韩亚洲欧美综合| 国产精品久久久久久久久免| 欧美 日韩 精品 国产| 直男gayav资源| 成人亚洲精品一区在线观看 | 亚洲欧美精品专区久久| 久久99热这里只有精品18| 日韩精品有码人妻一区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 天美传媒精品一区二区| 免费观看的影片在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 美女视频免费永久观看网站| 少妇精品久久久久久久| 成人美女网站在线观看视频| 在线播放无遮挡| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲成人av在线免费| 亚洲精品乱久久久久久| 午夜激情福利司机影院| av视频免费观看在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 中国国产av一级| 如何舔出高潮| 波野结衣二区三区在线| 欧美精品国产亚洲| 人妻系列 视频| 亚洲性久久影院| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美另类一区| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 日韩亚洲欧美综合| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩欧美一区视频在线观看 | 色网站视频免费| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲av成人精品一二三区| 日韩精品有码人妻一区| 少妇的逼好多水| 亚洲色图综合在线观看| 成人影院久久| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲中文av在线| 26uuu在线亚洲综合色| 国产在视频线精品| 久久这里有精品视频免费| 身体一侧抽搐| 舔av片在线| 嘟嘟电影网在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲av福利一区| 99久久综合免费| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 成人免费观看视频高清| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产乱来视频区| 午夜精品国产一区二区电影| 午夜精品国产一区二区电影| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日本黄色日本黄色录像| 视频区图区小说| 91久久精品电影网| 多毛熟女@视频| 国产精品伦人一区二区| 久久久久久久久久人人人人人人| 精品午夜福利在线看| 久久97久久精品| 国产精品成人在线| 精品人妻视频免费看| 中文天堂在线官网| 午夜免费观看性视频| 欧美成人午夜免费资源| 18+在线观看网站| 欧美xxⅹ黑人| 大话2 男鬼变身卡| 精品一区二区免费观看| 丝袜脚勾引网站| 欧美97在线视频| 日本与韩国留学比较| 大片免费播放器 马上看| 九九爱精品视频在线观看| 日本av手机在线免费观看| 久久99热这里只有精品18| 成人国产麻豆网| 丰满乱子伦码专区| 美女福利国产在线 | 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲av男天堂| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 欧美变态另类bdsm刘玥| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品欧美亚洲77777| 国产69精品久久久久777片| 国产精品不卡视频一区二区| 成人黄色视频免费在线看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| av专区在线播放| 国产亚洲5aaaaa淫片| 黄片无遮挡物在线观看| 少妇的逼好多水| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲欧美一区二区三区国产| 免费黄频网站在线观看国产| 女性生殖器流出的白浆| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲欧洲日产国产| 午夜激情久久久久久久| 久久ye,这里只有精品| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品蜜桃在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产在线免费精品| 亚洲精品,欧美精品| 精品久久国产蜜桃| 国产成人a∨麻豆精品| 99热这里只有是精品50| 91aial.com中文字幕在线观看| 精品久久久精品久久久| 国产又色又爽无遮挡免| 成人国产av品久久久| 婷婷色av中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产免费视频播放在线视频| 香蕉精品网在线| 国产免费福利视频在线观看| 观看美女的网站| 伊人久久国产一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产成人免费无遮挡视频| 日韩视频在线欧美| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 在线免费观看不下载黄p国产| 成人亚洲精品一区在线观看 | 一级毛片aaaaaa免费看小| 最黄视频免费看| 美女cb高潮喷水在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲精品色激情综合| 久久99热6这里只有精品| av天堂中文字幕网| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产精品一二三区在线看| 国产精品不卡视频一区二区| 插逼视频在线观看| 久久久午夜欧美精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 一级毛片电影观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 精品酒店卫生间| 日本wwww免费看| 亚洲人与动物交配视频| 欧美最新免费一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级 | h日本视频在线播放| 久久久亚洲精品成人影院| 在线观看免费高清a一片| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲精品视频女| 亚洲综合精品二区| 97超碰精品成人国产| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久久久网色| 99久久精品一区二区三区| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品一二三区在线看| 日本免费在线观看一区| av在线播放精品| 国产淫语在线视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99热全是精品| 成人毛片60女人毛片免费| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产在线男女| 久久久久网色| 在线精品无人区一区二区三 | 激情五月婷婷亚洲| 国产色婷婷99| 日本vs欧美在线观看视频 | 久久久久精品性色| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 中文字幕亚洲精品专区| 黄片无遮挡物在线观看| 插阴视频在线观看视频| 日韩国内少妇激情av| 久久久久视频综合| 亚洲三级黄色毛片| 一区在线观看完整版| 一区二区三区乱码不卡18| av在线播放精品| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲精品第二区| 亚洲三级黄色毛片| 午夜免费观看性视频| 国产高潮美女av| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 晚上一个人看的免费电影| 免费看光身美女| 成人国产麻豆网| 国产精品一区www在线观看| 另类亚洲欧美激情| freevideosex欧美| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲精品,欧美精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 丰满少妇做爰视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 日日啪夜夜撸| 免费黄色在线免费观看| 边亲边吃奶的免费视频| 欧美成人a在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| www.色视频.com| 一级av片app| 这个男人来自地球电影免费观看 | 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产成人a区在线观看| 国产高潮美女av| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲国产日韩一区二区| 视频中文字幕在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲精品色激情综合| 高清在线视频一区二区三区| 国产一区二区在线观看日韩| 久久99热6这里只有精品| 交换朋友夫妻互换小说| 一本久久精品| 免费av不卡在线播放| 在线观看国产h片| 99久久精品一区二区三区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲国产精品国产精品| 成人国产麻豆网| 午夜精品国产一区二区电影| 深夜a级毛片| 久久99热6这里只有精品| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲欧美清纯卡通| av福利片在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 麻豆成人av视频| 成人影院久久| 18+在线观看网站| 麻豆国产97在线/欧美| 99热这里只有是精品50| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲欧洲国产日韩| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 色吧在线观看| 日韩成人伦理影院| 丰满少妇做爰视频| 久久久午夜欧美精品| 欧美成人午夜免费资源| 多毛熟女@视频| 黄色一级大片看看| av女优亚洲男人天堂| 午夜福利在线在线| 色视频www国产| 免费观看在线日韩| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产美女午夜福利| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩亚洲欧美综合| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 亚洲色图av天堂| 久久久久久久精品精品| 赤兔流量卡办理| 大片电影免费在线观看免费| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| av黄色大香蕉| 美女国产视频在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 高清日韩中文字幕在线| 成人一区二区视频在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲成人一二三区av| 亚州av有码| 欧美人与善性xxx| 99久久精品国产国产毛片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产大屁股一区二区在线视频| 在线观看国产h片| 99视频精品全部免费 在线| a级毛色黄片| 中国三级夫妇交换| 国产精品99久久久久久久久| 日韩亚洲欧美综合| 国产一区二区在线观看日韩| 秋霞伦理黄片| 好男人视频免费观看在线| freevideosex欧美| 观看免费一级毛片| 国产视频首页在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久精品国产亚洲网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美人与善性xxx| 国产精品嫩草影院av在线观看| av国产免费在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久精品久久精品一区二区三区| 91久久精品电影网| 久久精品国产a三级三级三级| 激情 狠狠 欧美| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲人成网站高清观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久久久久九九精品二区国产| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久国产一区二区| 99国产精品免费福利视频| 男人爽女人下面视频在线观看| av免费观看日本| 亚洲人成网站高清观看| 久久6这里有精品| 久久精品人妻少妇| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久热精品热| 欧美高清性xxxxhd video| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 美女视频免费永久观看网站| 国产精品三级大全| 大陆偷拍与自拍| 男人狂女人下面高潮的视频| 一级a做视频免费观看| 国产黄片美女视频| 国产精品一二三区在线看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 欧美精品亚洲一区二区| 国产一区二区三区av在线| 在线观看人妻少妇| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲国产精品国产精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜 | 春色校园在线视频观看| 日韩中字成人| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产亚洲精品久久久com| 久久久久精品久久久久真实原创| 在线播放无遮挡| 亚洲精品日本国产第一区| 视频区图区小说| 亚洲性久久影院| 简卡轻食公司| 又大又黄又爽视频免费| 尾随美女入室| av女优亚洲男人天堂| 日日撸夜夜添| 免费大片黄手机在线观看| 韩国av在线不卡| av又黄又爽大尺度在线免费看| 黄色日韩在线|