新型槲皮素衍生物的合成及其抗腫瘤活性研究

周芳，楊揚，郭舉

槲皮素(Quercetin)(圖1)是一種廣泛存在于植物及食物中的黃酮類化合物，呈黃色粉末狀固體，通常含有兩分子結(jié)晶水，弱酸性。文獻研究表明，槲皮素具有抗氧化作用、抗腫瘤作用、抗炎癥作用、降血糖等多種生物活性，具有很高的藥用價值[1-6]。

圖1 槲皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

近年來，槲皮素對癌癥的化學(xué)預(yù)防和治療作用逐漸被人們所認識并引起廣泛的重視。研究表明，槲皮素能全面地作用于癌發(fā)生的始發(fā)、促癌和演進三個階段，兼有抗致癌、抗促癌和誘導(dǎo)分化的作用[7]。對人白血病細胞、結(jié)腸癌細胞、骨髓瘤細胞、卵巢癌細胞、乳腺癌細胞、淋巴瘤細胞、膀胱癌細胞等均有一定的抑制作用[8-11]。槲皮素通過改變細胞色素p4501A1(CYP1A1)等代謝酶的基因表達和活性，抑制致癌物的活化，或通過抑制環(huán)加氧酶-2(COX-2)的mRNA和蛋白質(zhì)水平，從而減輕細胞損傷和癌變，對癌癥發(fā)生具有預(yù)防作用。此外，在對癌癥的治療方面，槲皮素具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤細胞周期、干擾腫瘤細胞的信號傳導(dǎo)通道、作用于雌激素受體、抑制腫瘤的血管生成，抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、增強抗癌藥物對腫瘤細胞的敏感性、逆轉(zhuǎn)抗癌藥物的耐藥性等作用[12-14]。目前國內(nèi)外課題組從事槲皮素衍生物的研究很多[15-16]，如賈景景等[17]將烯丙基和異戊烯基的引入槲皮素得到了一系列具有抗腫瘤活性的衍生物，Jian Yuan等[18]將甲基引入槲皮素得到一系列具有抗腫瘤活性的衍生物，但關(guān)于針對槲皮素特定位置羥基衍生化的文獻報道的并不多，據(jù)此，我們設(shè)計合成了一系列新型的槲皮素衍生物5C1-5C7(圖2)，這為后續(xù)槲皮素衍生物的合成研究以及獲得具有更好抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物奠定了基礎(chǔ)。

本研究的起止時間為2016年3月至2017年6月。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器1H-NMR：Bruker AVANCEⅢ 400M NMR,瑞士布魯克科技有限公司；雙目顯微熔點儀(表顯)：XT-4型(溫度計未校正)，北京泰克儀器有限公司；三用紫外分析儀：MQK-ZF-1，上海米青科實業(yè)有限公司；恒溫磁力攪拌器：CJB-S型，西安安泰儀器科技有限公司；循環(huán)水式多用真空泵：2XZ型，上海精密儀器儀表有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-3000型，西安安泰儀器科技有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱：CN841-640L型，吳江市超能電熱設(shè)備有限公司。

1.2 實驗試劑 槲皮素：梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；溴化芐：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；取代芳香丙烯酸：梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；二碳酸二叔丁酯：梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC)：梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；4-二甲氨基吡啶(DMAP)：梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；鈀碳(Pd-C)：梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；四氫呋喃：加金屬鈉回流變藍供用；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、二氯甲烷(CH2Cl2)：重蒸且無水處理；硅膠G和H：青島海洋化工廠，未經(jīng)活化；MTT法所需腫瘤細胞：中科院上海細胞庫。所用試劑和溶劑均為化學(xué)純或分析純，除特別注明外，未經(jīng)進一步處理。

1.3 化學(xué)合成實驗

1.3.1 3,7,4′-三芐基槲皮素(2)的合成 稱取槲皮素5.02 g，以100 mL DMF溶解，加入無水碳酸鉀7.18 g，置于冰浴攪拌約15 min。取溴化芐8.2 mL加入反應(yīng)液中，Ar保護，反應(yīng)24 h以上。反應(yīng)完畢，用適量水稀釋反應(yīng)液，乙酸乙酯萃取，合并有機層，以水洗有機層，無水硫酸鈉干燥溶劑，旋干得紅棕色油狀物。粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析，以CH2Cl2為洗脫劑，得淡黃色針狀固體(2)4.67 g，收率55%，熔點155～156℃(文獻參考值[1]為150～152 ℃)[19-20]。1.3.2 3,7,4′-三芐基槲皮素-3′-芳香丙烯酸酯(4B1-4B7)合成通法 稱取3,7,4′-三芐基槲皮素(2)10 mmol和取代芳香丙烯酸(3A1-3A7)10 mmol，以適量無水CH2Cl2溶解，冰浴，DCC 10 mmol和DMAP 12 mmol以無水CH2Cl2溶解加入反應(yīng)體系，Ar保護，低溫反應(yīng)30 min，自然升溫至室溫反應(yīng)過夜。以薄層色譜顯色法(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進行。反應(yīng)完畢，收集濾液，旋干溶劑，以CH2Cl2-CH3OH重結(jié)晶得黃色沉淀(4B1-4B7)，收率70%～85%。

圖2 槲皮素3′-芳香丙烯酯目標化合物的合成路線

1.3.3 槲皮素-3′-芳香丙烯酸酯(5C1-5C7)合成通法 稱取3,7,4′-三芐基槲皮素-3′-芳香丙烯酸酯(4B1-4B7)5 mmol，以適量四氫呋喃和無水乙醇溶解，加入20%鈀碳0.5 mmol，密封真空后，通入氫氣，室溫攪拌24 h。反應(yīng)完畢，旋干溶劑，以CH2Cl2-石油醚重結(jié)晶得淺綠色粉末(5C1-5C7),收率81%～95%。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)表征 3,7,4′-三芐基槲皮素(2):1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):5.07(s,2H),5.13(s,2H),5.19(s,2H),6.44(d,J=2.0 Hz,1H),6.50(d,J=2.0 Hz,1H),6.95(d,J=6.0 Hz,1H),7.24-7.47(m,15H),7.61-7.64(m,2H),12.62(brs,1H)。

4B1:1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):4.93(s,2H),5.14(s,2H),5.17(s,2H),5.42(d,J=15 Hz,1H),6.44(d,J=2.4 Hz,1H),6.51(s,1H),6.53(d,J=2.4 Hz,1H),7.01(d,J=9.2 Hz,1H),7.21-7.56(m,19H),7.62(m,1H),7.77(d,J=2.0 Hz,1H),7.92(dd,J=8.8,2.0 Hz,1H),12.64(brs,1H)。

4B2:1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):5.13(s,2H),5.15(s,2H),5.19(s,2H),5.57-5.52(d,J=15 Hz,1H),6.44(d,J=2.4 Hz,1H),6.54-6.56(d,J=6 Hz,1H),6.53(d,J=2.4 Hz,1H),7.01(d,J=9.2 Hz,1H),7.21-7.56(m,19H),7.62(m,1H),7.77(d,J=2.0 Hz,1H),7.92(dd,J=8.8,2.0 Hz,1H),12.64(brs,1H)。

4B3:1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):2.42(s,3H),5.08(s,2H),5.11(s,2H),5.12(s,1H),5.13(s,2H),5.49(d,J=12 Hz,1H),6.44(d,J=2.0 Hz,1H),6.53(d,1H),7.02(d,J=8.8 Hz,1H),7.25-7.44(m,19H),7.78(d,J=2.0 Hz,1H),7.95(dd,J=8.8,1H),12.64(brs,1H)。

5C1:1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):5.13(s,1H),5.40(d,J= 15 Hz,1H),6.20(d,J=2.0 Hz,1H),6.45(d,J=2.0 Hz,1H),7.10(d,J=8.8 Hz,1H),7.32(d,J= 6 Hz,2H),7.34(d,J=6 Hz,2H),7.43(t,J=6.0 Hz,1H),7.87(d,J=2.0 Hz,1H),7.96(dd,J=8.8,2.0 Hz,1H),9.65(brs,1H),10.50(brs,1H),10.87(brs,1H),12.43(brs,1H)。

5C2:1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):5.50-5.54(d,J=15Hz,2H),6.19(d,J=1.6 Hz,1H),6.41(d,J=1.6 Hz,1H),6.60(s,1H),7.08(d,J=8.4 Hz,1H),7.39(d,J=8.0 Hz,1H),7.62(s,1H),7.65(s,1H),7.69(m,2H),7.80(d,J=2.0 Hz,1H),7.96(dd,J=8.4,2.0 Hz,1H),9.57(s,1H),10.46(s,1H),10.81(s,1H),12.42(brs,1H)。

5C3:1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):2.45(s,3H),5.10(s,1H),5.50(d,J= 12 Hz,1H),6.22(d,J=2.0 Hz,1H),6.47(d,J=2.0 Hz,1H),6.94(s,1H),7.18(d,J=8.8 Hz,1H),7.36(s,1H),7.42(s,1H),7.40(s,1H),7.41(d,J=8.0 Hz,1H),7.81(d,J=2.0 Hz,1H),7.98(dd,J=8.4,2.0 Hz,1H),9.62(brs,1H),10.76(s,1H),10.97(brs,1H),12.45(brs,1H)。

2.2 抗腫瘤活性實驗 選取了人結(jié)腸癌細胞系HCT-8，人肝癌細胞系BEL-7402，人胃腺癌細胞系BGC-823，人肺腺癌上皮細胞系A(chǔ)549，人卵巢癌細胞系A(chǔ)2780，人乳腺癌細胞系MX-1、MDA-MB-231等腫瘤細胞株，通過MTT法對槲皮素衍生物5C1-5C7的抗腫瘤活性進行了測試，經(jīng)過3次平行測試，取平均值，結(jié)果顯示如下。

表1 目標化合物對8種人腫瘤細胞的抑制活性/μM

注： IC50表示有50%的腫瘤細胞生長被抑制時的藥物濃度；HCT-8(人結(jié)腸癌細胞系)，BEL-7402(人肝癌細胞系)，BGC-823(人胃腺癌細胞系)，A549(人肺腺癌上皮細胞系)，A2780(人卵巢癌細胞系)，MX-1、MDA-MB-231(人乳腺癌細胞系)

3 討論

本研究用不同取代的芳香丙烯酸與槲皮素3′位羥基進行縮合得到目標縮合物，并通過核磁共振波譜儀(1H-NMR)對目標化合物進行結(jié)構(gòu)表征，同時對該類衍生物進行了體外細胞毒性試驗的抗腫瘤活性測試，初步的活性結(jié)果顯示該系列衍生物具有一定的抗腫瘤活性(表1)。通過對該系列槲皮素衍生物5C1-5C7(圖2)體外抗腫瘤活性的測試結(jié)果可以看出，部分槲皮素衍生物對人結(jié)腸癌細胞系HCT-8和人乳腺癌細胞系MX-1、MDA-MB-231表現(xiàn)出了較好的抗腫瘤活性，尤其使目標化合物5C1和5C6對乳腺癌腫瘤細胞的IC50值達到了10微摩爾級，顯示出了良好的體外抗乳腺癌活性，這為后續(xù)的槲皮素衍生物的合成研究以及獲得具有潛在抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物提供了科學(xué)參考。