異丙安替比林通過抑制蛋白激酶B通路誘導(dǎo)人腎癌細(xì)胞凋亡和自噬

李明俊，趙冬

雖然，人們對腫瘤的認(rèn)知和理解已經(jīng)取得很大的進步，但是，腫瘤依然是威脅人類生命健康的重要原因之一[1]。考慮到抗腫瘤藥物研發(fā)費用高、失敗率高和試驗周期長等問題，“老藥新用”抗腫瘤有望成為一種行之有效的治療方案[2]。異丙安替比林(Propyphenazone)是一種安替比林衍生物，并具有與安替比林相類似的解熱、鎮(zhèn)痛功效[3]。然而，這種抗炎藥物對于腫瘤的作用和機制尚未報道。我們通過一系列體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，異丙安替比林對腎癌細(xì)胞系Caki-1的增殖具有抑制作用，并且初步探究了其作用機制，為其抗腫瘤作用以及臨床應(yīng)用的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

本研究起止時間為2016年12月至2017年9月。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 人腎癌細(xì)胞系Caki-1和人肝細(xì)胞系LO2由暨南大學(xué)惠贈。異丙安替比林購買自MCE公司(貨號HY-A0273)。MTT(四甲基偶氮唑鹽)和Hoechst 33342購自Sigma公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自天津三箭有限公司。

1.2 抗體和儀器 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT(蛋白激酶B)、磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)、DNA修復(fù)酶(PARP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的蛋白一抗均購自Cell Signaling Technology公司。超凈臺購買自江蘇蘇凈集團，細(xì)胞培養(yǎng)箱購買自Thermo Electron Corporation公司。激光共聚焦顯微鏡購買自O(shè)lympus公司。FACS流式細(xì)胞儀購買自Beckham公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腎癌Caki-1細(xì)胞系用McCOY’s 5A培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)、人肝細(xì)胞LO2細(xì)胞系用DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清)于37 ℃、含5%二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長到80%時，用0.25%胰酶消化并傳代。

1.3.2 MTT(四甲基偶氮唑鹽)實驗 生長狀態(tài)良好的Caki-1細(xì)胞種于96孔板中，每孔先加入100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度8 000個/孔，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后再加入不同濃度的異丙安替比林100 μL，然后置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。MTT檢測前，每孔加入10 μL 5 g/L MTT孵育4～6 h，棄去上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，結(jié)晶充分溶解后，酶聯(lián)檢測儀的波長調(diào)整為570 nm，檢測每孔的光密度值(OD值)，然后，計算Caki-1細(xì)胞增殖率。

1.3.3 克隆形成抑制實驗 生長狀態(tài)良好的人腎癌細(xì)胞系Caki-1，接種于6孔板中(600個細(xì)胞/孔)，置于恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2周后棄去上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗3遍，加入75%乙醇固定15 min，吸去固定液后，適量0.1%結(jié)晶紫染色30 min后，沖洗，干燥，拍照。

1.3.4 Hoechst 33342染色 生長狀態(tài)良好的人腎癌細(xì)胞系Caki-1置于 5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌3遍，加入Hoechst 33342避光染色15 min，流水沖洗干凈，晾干，顯微鏡拍照。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 生長狀態(tài)良好的人腎癌細(xì)胞系Caki-1接種于6孔板，24 h后加入不同濃度的異丙安替比林。48 h后收集細(xì)胞，2 000 r/min，離心5 min，棄去上清，PBS洗1遍，加入200 μL Binding Bufffer吹懸細(xì)胞，分別加入1 μL Annexin V-FITC和1 μL碘化丙啶(PI)，混勻，避光，室溫染色15 min，流式上機檢測凋亡比例。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測相關(guān)信號通路蛋白 人腎癌細(xì)胞系Caki-1用不同濃度的異丙安替比林處理24 h后，PBS洗3遍，加入RIPA細(xì)胞裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制劑)冰上裂解15 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，吸取上清至新的EP管，然后，BCA法測定蛋白濃度。取25 μg蛋白上樣跑電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4 ℃孵育過夜，等滲緩沖鹽溶液(TBST)洗4遍，每遍5 min，二抗室溫孵育至少1 h，TBST洗4遍，每遍5 min，化學(xué)發(fā)光顯色。

1.3.7 免疫熒光 生長狀態(tài)良好的Caki-1細(xì)胞種于含有玻片的24孔板，異丙安替比林處理24 h后，吸出原培養(yǎng)基，PBS洗2遍，每遍3 min。然后，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2遍，每遍3 min，然后，加入0.25% Triton X-100打孔，PBS洗2遍，每遍3 min。加入4%牛血清蛋白(BSA)封閉后孵育一抗(1∶200稀釋)，室溫1 h，吸出液體，PBS(含2%Tween 20)洗2遍，每遍3 min。然后，加入二抗(1∶200稀釋)室溫孵育1 h。吸出液體，PBS(含2%Tween 20)洗2遍，每遍3 min。經(jīng)DAPI染核后，再將玻片取出晾干后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 異丙安替比林對人腎癌Caki-1和人肝細(xì)胞LO2增殖抑制的影響 MTT細(xì)胞活性實驗表明，對照組Caki-1細(xì)胞增殖率為100%，異丙安替比林(20、40、80、100 μM)組處理24 h的細(xì)胞增殖率分別為(89.1±3.6)%、(80.5±6.2)%、(78.5±3.1)%、(53.2±2.4)%。異丙安替比林(20、40、80、100 μM)組處理48 h的細(xì)胞增殖率分別為(84.5±5.3)%、(82.6±2.5)%、(73.6±4.2)%、(40.6±6.8)%。異丙安替比林(20、40、80、100 μM)組處理72 h的細(xì)胞增殖率分別為(85.7±4.9)%、(63.4±2.1)%、(20.4±2.8)%、(11.4±4.1)%。由此證明，異丙安替比林對Caki-1細(xì)胞增殖呈現(xiàn)時間依賴性和濃度依賴性的抑制作用。經(jīng)SPSS 17.0軟件計算，異丙安替比林處理24 h后，對Caki-1細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)=105 μM；異丙安替比林處理48 h后，對Caki-1細(xì)胞的IC50=83 μM；異丙安替比林處理72 h后，對Caki-1細(xì)胞的IC50=56 μM。然而，對人正常肝細(xì)胞LO2無顯著增殖抑制作用(P>0.05)，見圖1。

2.2 異丙安替比林對人腎癌Caki-1細(xì)胞克隆形成抑制的作用 異丙安替比林作用于Caki-1細(xì)胞7 d，與對照組相比，隨著異丙安替比林濃度增加，細(xì)胞集落克隆數(shù)顯著減少，并且克隆體積顯著變小(P<0.05)。20 μM和40 μM的異丙安替比林處理Caki-1細(xì)胞后，克隆形成率分別降為38%(P<0.05)和20%(P<0.01)，見圖2。

圖1 異丙安替比林對人腎癌Caki-1(A)和人肝細(xì)胞LO2(B)增殖的影響

2.3 異丙安替比林對人腎癌Caki-1細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響 Hoechst 33342染色結(jié)果表明，對照組的Caki-1細(xì)胞核內(nèi)染色均一，說明細(xì)胞狀態(tài)良好。隨著異丙安替比林的濃度增加，Caki-1細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)聚集點，說明Caki-1細(xì)胞發(fā)生凋亡，并伴隨染色質(zhì)的固縮，見圖3。

2.4 異丙安替比林對人腎癌Caki-1細(xì)胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PI檢測凋亡細(xì)胞比例，結(jié)果表明，Caki-1細(xì)胞在不同濃度的異丙安替比林(40 μM、80 μM、100 μM)處理下，隨著濃度增加，凋亡的Caki-1細(xì)胞比例逐漸增加，其中，當(dāng)使用0 μM、40 μM、80 μM和100 μM 的異丙安替林處理Caki-1細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率分別為7.4%、13.5%、34.5%和50.9%，見圖4。

2.5 Western Blot檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 不同濃度異丙安替比林處理Caki-1細(xì)胞24 h，隨著藥物處理濃度的增加，p-AKT蛋白表達(dá)逐漸降低，但對AKT蛋白的表達(dá)未有影響，并且PARP出現(xiàn)酶切條帶，證明異丙安替比林抑制了AKT蛋白的活性，并且誘導(dǎo)Caki-1細(xì)胞發(fā)生了凋亡，其中，80 μM處理細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡最為顯著，見圖5。

圖5 異丙安替比林對人腎癌Caki-1細(xì)胞凋亡和AKT通路的影響

2.6 異丙安替比林誘導(dǎo)人腎癌Caki-1細(xì)胞自噬 免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，異丙安替比林(80 μM)處理人腎癌Caki-1細(xì)胞24 h后，LC3出現(xiàn)點狀聚集現(xiàn)象，而DMSO對照組LC3呈現(xiàn)彌漫狀分布，見圖6。這表明異丙安替比林很可能誘導(dǎo)了Caki-1細(xì)胞發(fā)生了自噬現(xiàn)象。

3 討論

腎癌是最為常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤第二位[4]，來源于腎上皮組織。流行病統(tǒng)計研究表明，僅2012年腎癌發(fā)病率占男性惡性腫瘤發(fā)病率的第9位，占女性惡性腫瘤發(fā)病率的第14位，并仍處于上升趨勢[5]。一旦出現(xiàn)周圍組織侵犯或者遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，五年生存率小于10%。目前，臨床主要治療策略有：腎臟切除、靶向治療和免疫治療[6]。隨之帶來的治療費用高、周期長、耐藥風(fēng)險大等原因，因而迫切需要安全有效的輔助性抗腫瘤藥物。

在這里，我們發(fā)現(xiàn)一種臨床批準(zhǔn)使用的抗炎、鎮(zhèn)痛藥物——異丙安替比林，具有抑制人腎癌細(xì)胞系Caki-1增殖的作用，并且與克隆形成抑制實驗的結(jié)果趨勢一致。通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，異丙安替比林能誘導(dǎo)Caki-1細(xì)胞的凋亡。進一步的Hoechst 33342染色更加表明，異丙安替比林使得Caki-1細(xì)胞核發(fā)生染色質(zhì)的固縮，并呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的表型。

AKT，也稱為蛋白激酶B，是PI3K/AKT信號通路的關(guān)鍵蛋白，是細(xì)胞重要的生存通路，與多種細(xì)胞生物學(xué)進程相關(guān)，如葡萄糖代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移等[7]。AKT可分為3個亞型：AKT1、AKT2和AKT3[8]。AKT1主要通過抑制凋亡并且誘導(dǎo)胞內(nèi)蛋白合成來促進細(xì)胞的生存。AKT2主要參與胰島素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。AKT3的功能未知，尚未有大量的研究報道。AKT與人類多種腫瘤相關(guān)，而磷酸化的AKT是其活化形式，當(dāng)AKT激活后，會通過磷酸化下游Forkhead家族的轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)下調(diào)，從而促進細(xì)胞的增殖[9]。細(xì)胞凋亡包括死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、B淋巴細(xì)胞瘤-2(BCL-2)家族介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力(ER-Stress)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。其中，內(nèi)源性凋亡主要由BCL-2家族調(diào)節(jié)，通過半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-9(Caspase-9)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Caspase-3)的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致下游DNA修復(fù)酶PARP失活，最終使得細(xì)胞發(fā)生凋亡[10-12]。我們通過Western Blot發(fā)現(xiàn)，異丙安替比林對人腎癌Caki-1細(xì)胞AKT蛋白表達(dá)未有影響，但是顯著下調(diào)磷酸化AKT的表達(dá)，進而抑制了AKT蛋白活性，并促進PARP切割失活，這些結(jié)果均與細(xì)胞凋亡的表型一致。

LC3由MAP1LC3A基因編碼，是自噬體膜的內(nèi)在組件，主要參與自噬泡的形成過程。LC3被認(rèn)為是細(xì)胞自噬分子標(biāo)志物，并在自噬領(lǐng)域中被廣泛研究[13]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時，LC3由Ⅰ型轉(zhuǎn)變?yōu)棰蛐?，并與p62(自噬底物識別受體)結(jié)合，并被包裹于自噬體內(nèi)膜，此時，LC3會在細(xì)胞中發(fā)生點狀聚集[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，異丙安替比林處理Caki-1細(xì)胞后，通過激光共聚焦顯微鏡能夠明顯觀察到LC3的點狀聚集，意味著細(xì)胞在藥物處理條件下發(fā)生了自噬。

綜上所述，異丙安替比林能抑制人腎癌細(xì)胞的增殖，并通過抑制AKT和PARP活性而促進細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬。本研究工作將有助于異丙安替比林作為廉價抗癌藥物或輔助抗癌藥物的研究和開發(fā)。

注：與對照組(DMSO)相比，aP<0.05,bP<0.01圖2 異丙安替比林對人腎癌Caki-1克隆形成抑制的影響

圖3 異丙安替比林對人腎癌Caki-1凋亡形態(tài)的影響(Hoechst 33342染色×100)

圖4 異丙安替比林對人腎癌Caki-1凋亡比例的影響

圖6 異丙安替比林對人腎癌Caki-1細(xì)胞自噬的影響(免疫熒光染色×400)