誘導多能干細胞來源間充質(zhì)干細胞對大鼠骨關(guān)節(jié)炎的治療作用

何繼晨，嚴君逸，程琢玉，程潤，趙英杰，魏偉，嚴尚學

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種通常發(fā)生在中老年人身上的慢性關(guān)節(jié)疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)僵硬、持續(xù)性疼痛甚至殘疾，并伴隨不同程度的炎癥和軟骨缺損[1]。隨著人口老齡化的加劇，OA的發(fā)病率逐年增高，已經(jīng)發(fā)展成為突出的社會問題。OA是一種退行性疾病，目前尚無有效的治療措施。臨床上主要通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射潤滑補充劑[2]或使用非甾體類藥物、類固醇等緩解癥狀，減輕疼痛并控制炎癥，以及在OA晚期運用關(guān)節(jié)置換等外科手術(shù)治療方法[3]。然而這些方法只能暫時緩解病人疼痛和病情，并不能逆轉(zhuǎn)軟骨損傷和炎癥進程[4]。采用細胞療法修復和再生關(guān)節(jié)組織的結(jié)構(gòu)和功能成為一種新的治療選擇。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潛能，能夠分化成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)等多種成體細胞，而且還具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)特性，現(xiàn)已被應用于免疫和炎癥性疾病[5-6]。骨髓源MSCs是最早研究的MSCs，但因其取材侵襲性強，體內(nèi)數(shù)量有限等，已經(jīng)逐漸被其他來源的MSCs所取代。人臍帶來源的MSCs(human umbilical cord derived MSCs，hUC-MSCs)是MSCs的另一種重要細胞來源，因為其容易分離培養(yǎng)、低免疫原性和強大的體外擴增能力而被廣泛運用。有研究發(fā)現(xiàn)，hUC-MSCs可抑制IL(白細胞介素)-1β誘導的炎癥反應，并通過向軟骨分化從而修復損傷的軟骨組織[7]。誘導多能干細胞來源MSCs(induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells，iPSC-MSCs)是將成熟體細胞制成單細胞懸液后加入特定轉(zhuǎn)錄因子重編程回到胚胎狀態(tài)，然后在MSCs培養(yǎng)基中進行擴增并誘導分化成MSCs。iPSC-MSCs作為一種新型干細胞，比傳統(tǒng)干細胞具有更有效、更可靠的再生能力，更容易從成人組織中通過重編程獲得，并顯示出更大的增殖潛能，可產(chǎn)生大量功能均一的MSCs[8]。有研究表明，iPSC-MSCs可誘導成骨分化，iPSC-MSCs來源的外泌體可促進血管生成，防止股骨頭壞死等[9-10]；iPSC-MSCs移植可促進新西蘭兔關(guān)節(jié)表面缺損處生成新的透明軟骨[11]，也可通過旁分泌途徑分泌一些因子抑制半胱氨天冬氨酸蛋白酶的裂解從而參與炎癥調(diào)節(jié)過程[12]。iPSC-MSCs已經(jīng)成為骨髓源、臍帶源等MSCs和再生藥物治療OA的一種很有前途的替代細胞來源。盡管關(guān)于iPSC-MSCs治療OA的研究很多，但是iPSC-MSCs的療效、副作用及其作用機制仍有待進一步確認和深入研究。

基于iPSC-MSCs的優(yōu)良特性和在軟骨損傷方面的修復能力，本研究通過建立大鼠實驗性骨關(guān)節(jié)動物模型，觀察關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射iPSC-MSCs對OA大鼠的治療作用并探討其軟骨保護作用機制。

本研究起止時間為2017年11月至2018年10月。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠50只，每只180～200 g，雌雄各半，由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供[醫(yī)學實驗動物許可證號SYXK(皖)2017-006；合格證號No.34000200000978,2017-10]，自由飲食飲水。動物實驗方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所實驗動物倫理委員會批準(倫理號LLSC20170382)。

1.2 藥品與試劑 iPSC-MSCs(批號NCIMP2018013101，4×108個細胞/毫升)和hUC-MSCs(批號NCMP2018013101，4×108個細胞/毫升)由安徽中盛溯源生物科技有限公司提供，給藥前均經(jīng)表型鑒定、計數(shù)和活力檢查，細胞代次均為第3代。玻璃酸鈉注射液(hyaluronate，HA)，25 mg∶2.5 mL，上海景峰制藥有限公司產(chǎn)品(批號20171013)?？筂MP-13多克隆抗體(ab39012)、抗CollagenⅡ(ab34712)多克隆抗體、抗ADAMTS-5多克隆抗體(ab41037)為Abcam公司產(chǎn)品。

1.3 OA模型的建立 采用Hulth法建立大鼠OA模型，造模前大鼠禁食12 h。用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位置于手術(shù)臺上，常規(guī)備皮消毒右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)，從髕骨旁內(nèi)側(cè)切開暴露膝關(guān)節(jié)，然后切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，打開關(guān)節(jié)腔；隨后，切除前交叉韌帶和后交叉韌帶，行抽屜實驗確定前后交叉韌帶是否被切斷；切除內(nèi)側(cè)半月板。術(shù)中確保關(guān)節(jié)面無損傷。最后，徹底止血后縫合切口，假手術(shù)組除了不切斷前交叉韌帶、后交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶、半月板外，其余處理均同模型大鼠。術(shù)后不予固定手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)，同時，所有大鼠每天肌內(nèi)注射20萬單位青霉素預防感染，持續(xù)3 d。術(shù)后1周以后，每天用小動物轉(zhuǎn)棒儀對各組大鼠進行運動訓練，以加重OA大鼠患肢負重[13]。

1.4 實驗分組和給藥方案 術(shù)后第12周，編號后，運用Excel表格隨機分組功能，將模型大鼠隨機分為4組：模型組、iPSC-MSCs組(2.0×106個細胞/只)、hUC-MSCs組(2.0×106個細胞/只) 和HA組(10 mg/mL)。另設(shè)假手術(shù)組作為對照。每組10只。iPSC-MSCs組和hUC-MSCs組每只大鼠一次性在術(shù)側(cè)關(guān)節(jié)腔注射50 μL細胞；HA組大鼠每周一次關(guān)節(jié)腔注射50 μL HA，共5次；假手術(shù)組大鼠同法注射50 μL磷酸鹽緩沖液。所有大鼠于給藥5周后處死。

1.5 指標檢測

1.5.1 關(guān)節(jié)直徑差值檢測 術(shù)后每天觀察大鼠的飲食和活動情況，并觀察傷口愈合情況。每周測量和記錄動物體質(zhì)量，處死動物后用游標卡尺測量每只動物手術(shù)側(cè)和對側(cè)膝關(guān)節(jié)的直徑，并計算兩側(cè)膝關(guān)節(jié)直徑的差值。

1.5.2 X線檢查 給藥結(jié)束后1周，每組取4只大鼠以3%戊巴比妥鈉麻醉，行X線檢查大鼠手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)，并從膝關(guān)節(jié)腔大小、骨質(zhì)硬化、骨贅形成等方面變化按凱爾格倫-勞倫斯(Kellgren-Lawrence)分級標準[14]進行評分。

1.5.3 大鼠膝關(guān)節(jié)Pelletier評分 給藥結(jié)束處死大鼠后，留取膝關(guān)節(jié)標本，在手術(shù)顯微鏡下暴露關(guān)節(jié)腔，觀察股骨髁和脛骨平臺關(guān)節(jié)面是否平整，并根據(jù)股骨內(nèi)、外髁及脛骨平臺等軟骨表面退變情況按照Pelletier大體評分標準[15]進行評分，評分越高表示關(guān)節(jié)面軟骨損傷越嚴重。

1.5.4 大鼠膝關(guān)節(jié)病理學檢查 處死大鼠后，取股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面，經(jīng)體積分數(shù)10%的甲醛溶液室溫固定48 h，脫鈣，石蠟縱向包埋，切片后HE染色。由獨立觀察者根據(jù)Mankin評分標準[16]對每只動物的軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細胞數(shù)量及潮線完整度進行組織學評分，評分越高表示軟骨結(jié)構(gòu)破壞越嚴重。

1.5.5 膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13、Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)、解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAMTS)-5的檢測 采用免疫組織化學方法檢測MMP-13、CollagenⅡ、ADAMTS-5在大鼠膝關(guān)節(jié)中的表達。大鼠膝關(guān)節(jié)經(jīng)脫鈣、石蠟縱向包埋切片后，分別用乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復液和3%過氧化氫進行抗原修復并阻斷內(nèi)源性過氧化物的干擾，一抗孵育4 ℃過夜，3遍磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后滴加生物素二抗室溫孵育25 min，染色、封片后在光鏡下觀察。染色結(jié)果用Image J軟件分析量化。

2 結(jié)果

2.1 iPSC-MSCs對OA大鼠膝關(guān)節(jié)直徑差值的影響 實驗結(jié)果如圖1所示，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑差值顯著增大，提示手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)直徑顯著增大、關(guān)節(jié)變形，OA模型誘導成功；與模型組相比，iPSC-MSCs、hUC-MSCs給藥均可顯著降低大鼠膝關(guān)節(jié)直徑差值[(1.00±0.40)比(2.34±0.44),P<0.01]、[(1.33±0.41)比(2.34±0.44),P<0.020]，HA給藥也有類似作用[(1.48±0.21)比(2.34±0.44),P<0.049]。

2.2 iPSC-MSCs對OA大鼠膝關(guān)節(jié)X線評分的影響 X線檢查結(jié)果如表1所示。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)腔狹窄，部分形成可見的骨贅和骨質(zhì)硬化，提示OA模型誘導成功；與模型組相比，iPSC-MSCs給藥可降低大鼠膝關(guān)節(jié)X線評分等級和重度(3、4級)OA動物數(shù)量，改善關(guān)節(jié)腔結(jié)構(gòu)、減少骨贅形成和骨質(zhì)硬化作用。

表1 OA大鼠膝關(guān)節(jié)X線評分與模型組的比較/只

注：與模型組比較，aZ=2.381,P=0.029;bZ=2.205,P=0.029;cZ=1.517,P=0.200;dZ=0.168,P=0.114

2.3 iPSC-MSCs對OA大鼠膝關(guān)節(jié)Pelletier評分的影響 解剖動物膝關(guān)節(jié)可見，假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)面光滑平整，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，關(guān)節(jié)腔內(nèi)未見明顯的關(guān)節(jié)積液及滑膜增生。模型組大鼠關(guān)節(jié)磨損嚴重，軟骨面粗糙，關(guān)節(jié)面色澤暗淡，部分動物出現(xiàn)軟骨剝落，軟骨下骨質(zhì)暴露。圖2結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Pelletier評分顯著增高；與模型組相比，給予iPSC-MSCs和hUC-MSCs均能顯著降低Pelletier評分[(1.22±0.67)比(3.22±0.83),P<0.01]、[(2.00±0.71)比(3.22±0.83),P<0.01]，改善軟骨損傷，且iPSC-MSCs降低Pelletier評分較hUC-MSCs[(1.22±0.67)比(2.00±0.71),P=0.021]和HA[(1.22±0.67)比(1.89±0.60),P=0.045]給藥差異有統(tǒng)計學意義。

2.4 iPSC-MSCs對OA大鼠膝關(guān)節(jié)病理的影響 病理組織學檢測結(jié)果及評分如圖1所示，假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)骨組織正常，軟骨細胞分布均勻，排列規(guī)律整齊，4層結(jié)構(gòu)清晰可見，潮線完整平滑。模型組大鼠軟骨邊緣部分缺損，軟骨細胞排列紊亂，成簇分布，可見炎性細胞浸潤和不規(guī)則裂隙深達輻射層，潮線漂移中斷或出現(xiàn)多重潮線。相比于模型組，iPSC-MSCs給藥可顯著減輕關(guān)節(jié)軟骨退變狀況，減少炎性細胞浸潤，改善關(guān)節(jié)病理[(5.50±1.29)比(1.75±0.50),P<0.01]。與hUC-MSCs組和陽性藥HA組比較，iPSC-MSCs對軟骨結(jié)構(gòu)的改善和降低病理Mankin評分差異有統(tǒng)計學意義[(3.25±1.26)比(1.75±0.50),P=0.041]、[(4.00±0.82)比(1.75±0.50),P=0.004]。

2.5 iPSC-MSCs對OA大鼠膝關(guān)節(jié)中CollagenⅡ、MMP-13、ADAMTS-5表達的影響 免疫組織化學方法檢測大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨中CollagenⅡ、MMP-13、ADAMTS-5含量，陽性結(jié)果為軟骨細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染粒。結(jié)果如圖2～4所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中CollagenⅡ降解嚴重，表達顯著減少[(66.97±2.82)比(35.87±8.52),P<0.01]；與模型組相比，iPSC-MSCs和hUC-MSCs給藥組能顯著增加軟骨基質(zhì)中CollagenⅡ表達[(35.87±8.52)比(69.90±7.65),P<0.01]、[(35.87±8.52)比(61.00±5.52),P<0.01]，陽性藥HA組CollagenⅡ表達水平低于iPSC-MSCs組[(49.31±12.32)比(69.90±7.65),P=0.010]，提示iPSC-MSCs可減少OA軟骨基質(zhì)的破壞，保護軟骨基質(zhì)。檢測MMP-13和ADAMTS-5結(jié)果顯示，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13和ADAMTS-5表達顯著高于假手術(shù)組[(59.25±5.56)比(21.50±4.51),P<0.01]、[(52.25±10.47)比(14.50±4.20),P<0.01]；各組給藥均可顯著降低模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨MMP-13和ADAMTS-5表達水平，其中iPSC-MSCs組MMP-13和ADAMTS-5的表達水平明顯低于hUC-MSCs組[(33.75±5.85)比(43.25±6.02),P=0.028]、[(22.25±6.13)比(36.50±4.65),P=0.011]和HA組[(33.75±5.85)比(51.75±5.56),P<0.01]、[(22.25±6.13)比(40.75±5.56),P=0.001]，提示iPSC-MSCs可以下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨中MMP-13和ADAMTS-5表達，降低軟骨基質(zhì)降解酶的水平。

3 討論

Hulth模型是研究OA的一種經(jīng)典造模方法，通過切除內(nèi)側(cè)副韌帶暴露大鼠關(guān)節(jié)腔，再切除內(nèi)側(cè)半月板和前后交叉韌帶，破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，導致關(guān)節(jié)應力失衡，增加關(guān)節(jié)間的摩擦，從而達到類似與人OA的病理改變。但由于動物術(shù)后的活動情況不一致等原因，模型成型率及OA嚴重度均不甚理想。為了提高模型的成型率，我們在動物手術(shù)1周后每天用小動物轉(zhuǎn)棒儀對模型大鼠進行運動訓練10 min，轉(zhuǎn)速從慢到快，加速、加重患肢的負擔，顯著提高了OA大鼠模型的成型率和嚴重度。造模12周后，大鼠手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)增粗、硬骨變形，X線檢查結(jié)果顯示手術(shù)側(cè)關(guān)節(jié)腔變窄，骨贅形成，出現(xiàn)骨質(zhì)硬化，提示OA大鼠造模成功，總體成模率達90%。

iPSCs是類似于胚胎干細胞的一種新型多能干細胞，可由病人自身的特定體細胞誘導，細胞質(zhì)量可控，來源廣泛，可以克服hUC-MSCs存在的倫理學、來源受限等問題，被認為是治療各種組織損傷有希望的療法[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，iPSC-MSCs可顯著降低大鼠手術(shù)側(cè)和非手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)直徑差值，降低大鼠膝關(guān)節(jié)面Pelletier評分和X線評分，改善關(guān)節(jié)腔結(jié)構(gòu)，減輕骨質(zhì)硬化程度和骨贅等形成，提示iPSC-MSCs可緩解由于手術(shù)造成的關(guān)節(jié)不穩(wěn)，對膝關(guān)節(jié)面之間摩擦而引起的骨質(zhì)增生和硬化具有保護作用；iPSC-MSCs關(guān)節(jié)腔注射可減少軟骨層缺損，改善潮線完整度并降低病理學評分，修復后的軟骨具有與正常軟骨相似的典型透明特征，提示iPSC-MSCs對OA大鼠具有明顯的治療作用，且在降低Pelletier評分、改善關(guān)節(jié)病理和軟骨基質(zhì)退變方面較上市制劑HA以及臍帶源MSCs具有一定的優(yōu)勢。

細胞外基質(zhì)及軟骨下骨合成和降解的失衡是OA發(fā)生的重要機制。關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中硫酸軟骨素蛋白多糖(aggrecan)與糖胺多糖透明質(zhì)酸形成巨大的聚集體，吸水后膨脹的聚集體受另一種軟骨成分CollagenⅡ網(wǎng)的束縛，這種復合結(jié)構(gòu)賦予軟骨基質(zhì)抗壓強度及減震性能[19]。基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMP-13是降解軟骨細胞外基質(zhì)的主要酶系，可以通過過度切割軟骨基質(zhì)中含量最多的CollagenⅡ，促進CollagenⅡ三螺旋結(jié)構(gòu)的裂解膨脹[20]，在OA病人關(guān)節(jié)軟骨中，MMP-13含量升高引起軟骨基質(zhì)網(wǎng)狀Ⅱ型膠原結(jié)構(gòu)被破壞，從而導致關(guān)節(jié)軟骨缺損。Aggrecan是構(gòu)成軟骨基質(zhì)的另一重要組成部分，可以保持軟骨的彈性、含水量和結(jié)構(gòu)完整性。解聚蛋白樣金屬蛋白酶家族中ADAMTS-5可以通過降解aggrecan，導致軟骨結(jié)構(gòu)完整性喪失和關(guān)節(jié)功能受損，其含量與OA疾病的嚴重程度呈正相關(guān)[21]。iPSC-MSCs關(guān)節(jié)腔注射可抑制基質(zhì)降解酶MMP-13和ADAMTS-5的表達，并增加基質(zhì)中CollagenⅡ的表達，提示iPSC-MSCs關(guān)節(jié)腔注射可以抑制軟骨降解、促進Ⅱ型膠原形成，發(fā)揮軟骨保護作用。

綜上，iPSC-MSCs關(guān)節(jié)腔注射對大鼠OA具有明顯的治療作用，其機制與恢復軟骨基質(zhì)合成與降解的失衡有關(guān)。

注：a表示潮線，b表示軟骨面缺損或平整性，c表示炎性細胞浸潤，d表示軟骨細胞；與假手術(shù)組相比，eP<0.01；與模型組相比，fP<0.05，gP<0.01；與iPSC-MSCs組相比，hP<0.05，iP<0.01圖1 iPSC-MSCs對大鼠膝關(guān)節(jié)病理的影響：A為假手術(shù)組，B為模型組，C為iPSC-MSCs(2.0×106)組，D為hUC-MSCs(2.0×106)組，E為HA(10 mg/mL)組，A～E圖均HE染色×100；F為各組大鼠膝關(guān)節(jié)病理Mankin評分

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05,cP<0.01；與iPSC-MSCs組相比，dP<0.05 圖2 iPSC-MSCs對OA大鼠膝關(guān)節(jié)CollagenⅡ表達的影響：A為假手術(shù)組，B為模型組，C為iPSC-MSCs(2.0×106)組，D為hUC-MSCs(2.0×106)組，E為HA(10 mg/mL)組，A～E圖均免疫組織化學染色×100；F為各組大鼠膝關(guān)節(jié)CollagenⅡ表達

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01；與iPSC-MSCs組相比，cP<0.05，dP<0.01圖3 iPSC-MSCs對OA大鼠膝關(guān)節(jié)MMP-13表達的影響：A為假手術(shù)組，B為模型組，C為iPSC-MSCs(2.0×106)組，D為hUC-MSCs(2.0×106)組，E為HA(10 mg/mL)組，A～E圖均免疫組織化學染色×1 000；F為各組大鼠膝關(guān)節(jié)MMP-13表達

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.01；與iPSC-MSCs組相比，cP<0.05，dP<0.01圖4 MSCs對OA大鼠膝關(guān)節(jié)ADAMTS-5表達的影響：A為假手術(shù)組，B為模型組，C為iPSC-MSCs(2.0×106)組，D為hUC-MSCs(2.0×106)組，E為HA(10 mg/mL)組，A～E圖均免疫組織化學染色×1 000；F為各組大鼠膝關(guān)節(jié)ADAMTS-5表達