骨骼肌挫傷修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞的趨化機制

劉曉光, 陳佩杰, 趙淋淋, 曾志剛,2, 肖衛(wèi)華

(1.上海體育學(xué)院 運動科學(xué)學(xué)院,上海 200438; 2.井岡山大學(xué) 體育學(xué)院,江西 吉安 343000)

骨骼肌是人體最重要的器官之一,約占體質(zhì)量的40%。骨骼肌收縮牽拉骨骼繞關(guān)節(jié)轉(zhuǎn)動,為人體運動提供動力。骨骼肌具有較強的損傷后再生能力,而這種再生能力主要依賴于肌衛(wèi)星細(xì)胞[1]。肌衛(wèi)星細(xì)胞是一種肌原性前體細(xì)胞,存在于肌細(xì)胞膜和基底膜之間。當(dāng)骨骼肌損傷時,肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活,然后增殖分化,與受損肌纖維融合,修復(fù)損傷骨骼肌[2]。

近年來研究表明,巨噬細(xì)胞在骨骼肌損傷修復(fù)過程中也具有重要作用,它不僅參與損傷后肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活,還促進壞死肌纖維及細(xì)胞碎片的清除,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[3]。骨骼肌損傷后,巨噬細(xì)胞在多種因素刺激下游離到損傷部位,參與損傷組織修復(fù)[4]。研究發(fā)現(xiàn),趨化因子在骨骼肌損傷后巨噬細(xì)胞的趨化中發(fā)揮了重要作用[5-6]。在骨骼肌挫傷這一特定病理狀態(tài)下,巨噬細(xì)胞如何趨化到損傷部位卻鮮有研究。因此,本文建立了骨骼肌挫傷模型,通過HE染色觀察骨骼肌挫傷后修復(fù)過程中的形態(tài)學(xué)變化,通過RT-PCR檢測骨骼肌挫傷后巨噬細(xì)胞和趨化因子的時空表達規(guī)律,并對巨噬細(xì)胞和趨化因子表達進行相關(guān)性分析,以探索骨骼肌挫傷后巨噬細(xì)胞趨化的具體機制。這將加深對骨骼肌挫傷修復(fù)機制的理解與認(rèn)識,為研制治療骨骼肌挫傷的藥物提供新的思路,具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組8～10周齡健康ICR雄性小鼠66只,購自上海杰思捷實驗動物有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為21～25℃,濕度為40%～50%,12 h光照,12 h黑暗,自由飲食。隨機選取11只作為對照組(C組),余下進行腓腸肌挫傷處理,分為傷后12 h、1 d、5 d、10 d和15 d組,每組11只。

1.2 骨骼肌挫傷模型小鼠用400 mg/kg體質(zhì)量水合氯醛腹腔注射麻醉后,膝關(guān)節(jié)伸直0°,踝關(guān)節(jié)背伸90°位,將質(zhì)量16.8 g,直徑15.9 mm的實心不銹鋼鋼珠置于一透明管道頂端(高100 cm,內(nèi)徑16.0 mm)釋放后垂直擊中一打擊裝置,打擊裝置底端撞擊小鼠雙側(cè)腓腸肌肌腹中段(打擊面積28.26 mm2)。骨骼肌挫傷后,可見腓腸肌血腫,HE染色可見肌纖維腫脹、壞死、紅細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤。此法已多次被驗證可成功建模[7-9]。

1.3 動物取材小鼠腓腸肌挫傷后在不同時間點(12 h、1 d、5 d、10 d和15 d)取材。小鼠麻醉后頸椎脫位致死,迅速取雙側(cè)受損腓腸肌。其中3只小鼠共6條腿腓腸肌進行HE染色,剩余8只小鼠的左腿腓腸肌用于熒光定量PCR檢測。

1.4 HE染色小鼠腓腸肌取材,經(jīng)4%多聚甲醛(國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn))固定后,用石蠟(國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn))包埋,然后于切片機(Leica-EG 1 160,德國產(chǎn))切3～4 μm的薄片。切片經(jīng)脫蠟處理后,用蘇木素-伊紅染色,然后中性樹膠封片。20倍物鏡下觀察并拍照(Labphot-2,Nikon,美國產(chǎn))。

1.5 實時熒光定量PCR

1.5.1 RNA抽提 稱重骨骼肌(約50 mg),并將組織剪碎,然后放入2 mL離心管中,加入1 mL Trizol(Invitrogen公司產(chǎn));機械勻漿器(IKA,德國產(chǎn))勻漿5～6次,每次10 s,靜置5 min后,13 400g離心(centrifuge5 417R,德國Eppendorf公司產(chǎn))10 min,然后取上清(約800～900 μL)放入1.5 mL離心管中;每使用1 mL Trizol加200 μL氯仿(國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)),劇烈震蕩15 s,然后靜置3 min;4 ℃條件下,13 400g離心10 min后,樣品分為3層,中間層和上層是無色水相,RNA主要在水相中(約500 μL),將RNA轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中;在得到的水相中,加入等體積異丙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)),混勻,室溫放置20～30 min;4 ℃條件下13 400g離心10 min后,棄上清,離心后RNA沉在管底,呈微小羽毛狀;加入1 mL 75%的乙醇(國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn))洗滌2次;在4 ℃條件下2 300g離心5 min,棄上清;干燥5 min后,加入30～100 μL DEPC水(生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)),分析RNA的濃度或放-20 ℃短期保存,-80 ℃長期保存。

1.5.2 cDNA合成 cDNA合成按RevertAid第一鏈cDNA Synthesis試劑盒說明進行,取2 μg總RNA、1μL隨機六聚體引物、4μL 5X Reaction Buffer、1μL RiboLockTMRNA酶抑制劑 (20 u/μL)、2μL 10 mmol/L dNTP Mix、1μL RevertAidTMM-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 u/μL)和適量無RNA酶高純水,總體積共20μL。于梯度 PCR儀(Mastercycler EP,德國 Eppendorf 公司產(chǎn))進行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)過程中的溫度和時間控制是25 ℃ 5 min、42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min,然后溫度降低到4 ℃,cDNA合成完成。

1.5.3 熒光定量PCR 熒光定量PCR反應(yīng)體系包括12.5 μL 2×Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master mix (Thermo Scientific)、1μL cDNA、無核酸酶水和300 nmol/L的上下游引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。 使用熒光定量PCR儀進行擴增。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 10 min,然后95 ℃變性 15 s,60 ℃ 1 min共 40個循環(huán)。 通過2-△△CT方法計算所測樣本mRNA的相對含量[10-11]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件處理,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。One-way ANOVA和Bonferroni事后檢驗,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 挫傷骨骼肌修復(fù)過程中形態(tài)學(xué)變化骨骼肌挫傷后,在傷后12 h～1 d組,取材時可見腓腸肌表面有明顯血腫,特別是傷后12 h組最明顯,5 d組開始有所改善,14 d和21 d組已觀察不到此現(xiàn)象。HE染色結(jié)果表明,未損傷骨骼肌形態(tài)規(guī)則,細(xì)胞核分布于肌膜下,無壞死肌纖維。骨骼肌挫傷后12 h～1 d,肌纖維腫脹、結(jié)構(gòu)完整性被破壞,出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤。傷后第5天仍有較多炎性細(xì)胞浸潤,但出現(xiàn)少量再生肌纖維(中央成核肌纖維)。傷后第10天再生肌纖維數(shù)量大大增加,傷后第15天仍見少量再生肌纖維,但肌纖維結(jié)構(gòu)較完整,損傷后修復(fù)基本完成(圖1)。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer Sequences for PCR

圖1 挫傷骨骼肌形態(tài)學(xué)變化Figure 1 Morphological changes of skeletal muscles after contusion

2.2 骨骼肌挫傷后巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達變化RT-PCR結(jié)果顯示,骨骼肌挫傷后CD68(M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物)[8]mRNA表達升高,且在挫傷后第1天達到峰值(P<0.01),第5天仍顯著高于對照組(P<0.01)。CD206為M2a巨噬細(xì)胞標(biāo)志物[8],與對照組相比,在挫傷后5 d和10 d均顯著增加,且第10天達到峰值(P<0.01)。CD163作為M2c巨噬細(xì)胞標(biāo)志物[12],與對照組相比,在挫傷后第10天表達顯著增加(P<0.01)(圖2)。

2.3 骨骼肌挫傷后趨化因子表達變化如圖3 所示,與損傷組相比,單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)在骨骼肌挫傷后12 h顯著增加并達峰值(P<0.01),且在傷后1 d、5 d和15 d仍顯著增加(P<0.01)[圖3(a)]。CC趨化因子受體2(CCR2)在挫傷后1 d、5 d和15d mRNA表達均顯著高于對照組(P<0.01)[圖3(b)]?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)mRNA在挫傷后12 h、10 d和15 d表達均顯著增加[圖3(c)]。CXC趨化因子受體4(CXCR4)雖在骨骼肌挫傷后表達出現(xiàn)變化,但與對照組相比并無顯著差異(P>0.05)[圖3(d)]。

2.4 巨噬細(xì)胞與趨化因子的相關(guān)性分析通過皮爾遜相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),骨骼肌挫傷后,MCP-1與CD68存在強相關(guān)(r=0.654,P=0.001),與其受體CCR2呈強相關(guān)(r=0.617,P=0.015),與CD163和CD206無相關(guān)。SDF-1與其受體CXCR4呈相關(guān)(r=0.187,P=0.023),與CD68、CD163和CD206均無相關(guān)(表2)。

圖2 骨骼肌挫傷后巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達變化Figure 2 The expression changes of macrophages markers after skeletal muscle contusion

表2 趨化因子與其受體及巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性
Table 2 Correlation between thechemokines and their receptors and markers of macrophages

注:*表示無相關(guān);—表示未進行相關(guān)分析

3 討論

3.1 骨骼肌挫傷模型的構(gòu)建Ceafalan等[13]發(fā)現(xiàn),小鼠腓腸肌壓碎性損傷后,大量肌纖維壞死、炎性細(xì)胞浸潤,在傷后第5天首次發(fā)現(xiàn)中央成核肌纖維(再生肌纖維),傷后第14天大部分再生肌纖維已成熟。本實驗結(jié)果與Ceafalan等的結(jié)果相似,骨骼肌挫傷后肌纖維壞死、腫脹、大量炎性細(xì)胞浸潤,傷后第7天有大量再生肌纖維,傷后第14天大部分再生肌纖維已成熟。與之不同的是,在本實驗中,骨骼肌挫傷后第3天即可見少量再生肌纖維。出現(xiàn)這種差異的原因可能是骨骼肌壓碎傷較挫傷更為嚴(yán)重,因此再生肌纖維出現(xiàn)得較晚。此外,Wright等[14]發(fā)現(xiàn),小鼠腓腸肌挫傷后第7天,損傷部位出現(xiàn)大量再生肌纖維。Nozaki等[15]發(fā)現(xiàn),小鼠腓腸肌挫傷后第14天,損傷骨骼肌仍有少量再生肌纖維,大部分再生肌纖維已成熟。以上結(jié)果與本文相似,提示骨骼肌挫傷模型建立成功[7,16]。

3.2 骨骼肌挫傷后巨噬細(xì)胞浸潤的規(guī)律巨噬細(xì)胞在骨骼肌損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[9,12]。巨噬細(xì)胞通?？煞譃?種基本類型:M1和M2巨噬細(xì)胞。M2巨噬細(xì)胞又可進一步分為M2a、M2b和M2c 3種類型[3,17]。M1巨噬細(xì)胞為促炎性巨噬細(xì)胞,它可分泌多種促炎細(xì)胞因子(如IFN-γ、TNF-α和IL-6等),清除壞死肌纖維及細(xì)胞碎片等,促進機體炎癥反應(yīng)[18]。M2巨噬細(xì)胞為抗炎性巨噬細(xì)胞,可分泌多種肌再生因子(如IGF、MGF和HGF等)及抗炎細(xì)胞因子(IL-10),促進骨骼肌損傷修復(fù)[19]。巨噬細(xì)胞在損傷骨骼肌中的表達存在一定規(guī)律性,如Tonkin等[20]發(fā)現(xiàn),小鼠脛骨前肌注射心臟毒素?fù)p傷后第2天M1巨噬細(xì)胞達峰值,隨后表達下降,而M2巨噬細(xì)胞在傷后第5天達峰值。Shono等[21]發(fā)現(xiàn),小鼠腓腸肌擠壓損傷后1～4 d M1型巨噬細(xì)胞表達顯著增加,M2巨噬細(xì)胞在傷后7～10 d表達顯著增加。與上述損傷模型相似,本文發(fā)現(xiàn),M1巨噬細(xì)胞在骨骼肌挫傷后1～5 d顯著增加(P<0.01),M2a巨噬細(xì)胞在挫傷后5～10 d顯著增加,M2c巨噬細(xì)胞在挫傷后第10天顯著增加。此外,本實驗結(jié)果與上述研究者略有差異的原因可能與骨骼肌損傷方式不同(心臟毒素致傷與骨骼肌挫傷;擠壓致傷與骨骼肌挫傷)及損傷肌肉類型(脛骨前肌與腓腸肌)不同有關(guān)。盡管不同研究之間略有差異,但這些結(jié)果提示,骨骼肌損傷后巨噬細(xì)胞浸潤存在一定規(guī)律性,在骨骼肌損傷早期M1巨噬細(xì)胞浸潤占優(yōu)勢,隨后M1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2巨噬細(xì)胞,在損傷后期M2巨噬細(xì)胞顯著增多[22]。

3.3 骨骼肌挫傷后修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞趨化的可能機制MCP-1/CCR2軸參與了多種病理環(huán)境中巨噬細(xì)胞的遷移,如腫瘤組織中MCP-1與CCR2結(jié)合可促進巨噬細(xì)胞趨化[23-24],離體狀態(tài)下MCP-1可促進經(jīng)典激活型巨噬細(xì)胞(M1巨噬細(xì)胞)的遷移與激活[25]。骨骼肌挫傷后,MCP-1/CCR2軸是否參與了巨噬細(xì)胞的募集則不得而知。本文通過RT-PCR檢測挫傷骨骼肌修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞和趨化因子的表達,采用相關(guān)性分析探討骨骼肌損傷修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞趨化的可能機制。結(jié)果顯示,骨骼肌挫傷后MCP-1表達顯著上調(diào),且與CCR2呈強相關(guān)(r=0.617,P=0.015),與M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68呈強相關(guān)(r=0.654,P=0.001),提示骨骼肌挫傷后MCP-1/CCR2軸可能參與了巨噬細(xì)胞的募集。

這一推測可從其他骨骼肌損傷模型得到支持。如Shireman等[6]發(fā)現(xiàn),與野生型小鼠相比,MCP-1基因缺失小鼠,在骨骼肌缺血性損傷后第3天巨噬細(xì)胞浸潤減少,在傷后第7天仍有巨噬細(xì)胞浸潤和大量壞死組織,損害了骨骼肌再生。與野生型小鼠相比,CCR2(MCP-1的受體)基因敲除小鼠,在心臟毒素注射骨骼肌損傷后巨噬細(xì)胞募集減少、脂肪沉積增加、VEGF表達下降,骨骼肌再生受損[5,26-27]。雖然MCP-1與M1巨噬細(xì)胞顯著相關(guān),但MCP-1與M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163和CD206均無相關(guān),提示MCP-1可能未參與M2巨噬細(xì)胞趨化,因為骨骼肌損傷后,M2巨噬細(xì)胞一般較晚出現(xiàn),且一般認(rèn)為其由M1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來,而非從外周血募集[17,28]。以上結(jié)果提示,MCP-1/CCR2軸可能參與了挫傷骨骼肌修復(fù)過程中M1巨噬細(xì)胞的趨化。

此外,SDF-1/CXCR4軸也與巨噬細(xì)胞的遷移相關(guān)。SDF-1及其受體CXCR4屬于CXC趨化因子家族,在多種細(xì)胞中表達(如C2C12成肌細(xì)胞、肌衛(wèi)星細(xì)胞、造血干細(xì)胞、白細(xì)胞等)[29-31]。SDF-1/CXCR4軸常被認(rèn)為與腫瘤環(huán)境中巨噬細(xì)胞募集有關(guān)[32-33]。雖然在離體狀態(tài)下SDF-1可促進巨噬細(xì)胞趨化[33],但能否促進損傷骨骼肌中巨噬細(xì)胞的募集則少有研究。本實驗中,骨骼肌挫傷后SDF-1 mRNA表達顯著上調(diào),且SDF-1與其受體CXCR4呈相關(guān),但SDF-1與巨噬細(xì)胞3種標(biāo)志物間均無相關(guān)性。提示在骨骼肌挫傷這一特定病理環(huán)境中,SDF-1/CXCR4可能并未參與巨噬細(xì)胞趨化。

4 結(jié)束語

本文基于前期大量文獻報道,僅對涉及巨噬細(xì)胞趨化的2條重要趨化途徑進行了探索。從結(jié)果看,MCP-1/CCR2軸可能參與了挫傷骨骼肌修復(fù)過程中M1巨噬細(xì)胞的趨化,但仍不能排除有其他促進巨噬細(xì)胞向損傷骨骼肌趨化的途徑。