精子激活劑在輔助生殖技術(shù)中的應用研究

孔飛燕 綜述 常德輝 審校

甘肅中醫(yī)藥大學，中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院（甘肅蘭州730000）

在臨床工作中，不孕不育是一種比較常見的病癥，大約在15%的夫婦中存在不孕不育的情況，其中男性方面導致不育約為30%-60%[1]；而在男性不育的類型中，特發(fā)性男性不育是最常見的，約占70%～75%，其中包括無精子癥、少精子癥、弱精子癥、畸形精子癥，而對于少精子癥和弱精子癥，其原因繁多，機制復雜。隨著對弱精子癥研究的深入，許多致病的原因和治療的方法被學者發(fā)現(xiàn)和應用，但對于其中大多數(shù)的原因和發(fā)病機制仍無圓滿的解釋；同樣，許多藥物仍然處于實驗研究階段，無充分證據(jù)支持其應用于臨床的可行性。目前，主要以內(nèi)分泌治療和輔助生殖技術(shù)作為治療弱精子癥的的有效措施，后者中常用的人工授精、體外受精-胚胎移植等技術(shù)已經(jīng)取得了優(yōu)良的成果，為生殖醫(yī)學領域中治療男性不育開辟了新的路徑。但是，若要使輔助生殖技術(shù)獲得成功，在人工授精前，必須使精子的各項功能達到優(yōu)良狀態(tài)，這是必要的前提條件。在獲得弱精子癥患者的精液樣本后，要對樣本進行一系列的處理過程，使得人工授精前精子達到最佳的狀態(tài)，其中包括精子超低溫保存、提高精子活力、改善精子微環(huán)境等，而提高精子活力作為處理過程的中心環(huán)節(jié)，精子激活劑已經(jīng)成為研究的熱門。

一、改善精子成熟和運動微環(huán)境的精子激活劑

近年來，隨著廣泛的研究，精子的缺陷和精子發(fā)生以及成熟所依賴的微環(huán)境改變均會影響精子質(zhì)量以及受孕率，這一觀點已經(jīng)得到學術(shù)界廣泛的認可。而針對這種情況，許多研究者試驗多種生物制劑來替代微環(huán)境中缺失的物質(zhì)或者改善精液微環(huán)境。前列腺液作為精液的重要組成部分，占精液體積的六分之一[2，3]，前列腺液中含有多種蛋白，這些蛋白與精子液化、漸進性運動，抗菌和免疫學活性有關(guān)，對于離體后的精子功能的維持有很重要的作用。有Wei等[4]發(fā)現(xiàn)B7-H3也存在于前列腺液中，但是未證明B7-H3是否具有和其他蛋白一樣的功能。為了驗證B7-H3的功能，Wei等[5，6]進行了研究發(fā)現(xiàn)：B7-H3對于精子的運動有很重要的功能，可以改善精子的運動能力，并且其效能與濃度和時間呈一定的正相關(guān)性。在人體內(nèi)，白細胞和幼稚精細胞可產(chǎn)生低濃度的氧化活性物質(zhì)，后者在精子和卵子結(jié)合過程中起重要作用。但由于生殖器炎癥等原因會使精液中的氧化活性物質(zhì)明顯增多[7]，研究證實高濃度的氧化活性物質(zhì)會影響精子的運動能力，甚至破壞精子DNA的完整性[8，9]，同時，精液內(nèi)存在的許多抗氧化物質(zhì)[10]，比如：超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、抗壞血酸、維生素E、丙酮酸鹽、谷胱甘肽、L-肉堿、牛磺酸、亞牛磺酸等，這些物質(zhì)可拮抗產(chǎn)生的過量氧化活性物質(zhì)，當精子排出體外后，精液中的這些抗氧化物質(zhì)消耗，能力下降，同時產(chǎn)生大量助氧化物質(zhì)[11]，最終導致精子活力降低，DNA完整性破壞。Bj?rndahl等[12]研究發(fā)現(xiàn)Zn可以穩(wěn)定核染色質(zhì)，起到抗氧化作用，同時提升精子的運動能力。D型氨基酸具有刺激精子發(fā)生、合成和分泌激素的作用，且弱精子癥患者的D型氨基酸含量較正常人明顯減低[13]。輔酶Q10（Co-Q10）以穩(wěn)定和活化兩種形式存在于精子后精漿中，它與精子的濃度和精子的運動能力有密切的關(guān)系[14]。Talevi等[15]探究了Zn、天冬氨酸、以及Co-Q10的最佳濃度后，得到各自的濃度分別為10μg/mL、500μg/mL、40μg/mL時， 精子的運動質(zhì)量最優(yōu)。Giacone等[16]按照上面得出的最佳濃度，將三者結(jié)合后與精子共孵化，結(jié)果顯示，精子的運動能力明顯提高，同時，減弱了脂質(zhì)過氧化過程。Yun等[17]設計實驗，探索抗氧化劑對精子的運動活力的影響，分別將?；撬?、半胱氨酸、谷胱甘肽以及三者的聯(lián)合物加入精液中，結(jié)果與對照組相比后，牛磺酸在濃度為1mmol時，精子的各項運動參數(shù)（精子活力，曲線運動速度、直線運動速度、平均路徑速度以及前向運動精子百分率）均有提高，但是三者聯(lián)合使用時，精子的運動能力反而有明顯的降低。精子在睪丸中形成后并不具備運動能力，當運輸?shù)礁讲G中的管道后，精子才獲得了運動能力，而附睪中優(yōu)良的內(nèi)環(huán)境是精子成熟和獲得運動能力所必須的，并且附睪內(nèi)各段管道內(nèi)的微環(huán)境也不完全相同，其中微環(huán)境中鈣離子對于精子獲能至關(guān)重要[18]，但是關(guān)于體外實驗時鈣離子的使用濃度，各家報道均不一樣。Bhoumik[19]等對體外精子實驗時鈣離子濃度的選擇進行了探索，在筆者的實驗中，當外環(huán)境中鈣離子的濃度為10μmol時，精子運動活性明顯提升，而繼續(xù)增加鈣離子濃度時，精子的運動活性呈現(xiàn)出顯著下降趨勢。

二、輔助提升精子自身運動能力的精子激活劑

（一）生化介質(zhì)類型精子激活劑

大量研究證實，cAMP介導精子獲能過程中的酪氨酸磷酸化過程，而且生理試驗[20，21]發(fā)現(xiàn)，cAMP甚至可以直接刺激精子，從而增加精子的能力。在精子獲能的第一階段，鈣離子內(nèi)流且活性氧離子產(chǎn)生，而活性氧離子中的過氧化氫以及鈣離子隨之刺激腺苷酸環(huán)化酶，后者被激活后可進一步增加cAMP的含量。肝素是刺激體外培養(yǎng)的牛精子獲得動能的最常用化合物，屬于黏多糖[22]，它通過結(jié)合漿膜表面的牛精液蛋白，使之發(fā)生構(gòu)型改變，從而激活漿膜上的通道，細胞內(nèi)cAMP隨之增加[23]。Nabavi等[24]將等量的咖啡因加入含有小鼠精子和卵子細胞的T6和M16兩種培養(yǎng)基中，通過實驗得出結(jié)論，一方面咖啡因具有促進精子運動和刺激發(fā)生頂體反應，另一方面，培養(yǎng)基在激活精子方面同樣具有重要的作用，并且兩者結(jié)合時，效果明顯增加。IA Barakat等[25]設計實驗研究咖啡因、己酮可可堿、血管舒緩素對冷凍牛精子的超活化效應，同時探究各化合物的最佳效應濃度，經(jīng)過實驗得出：咖啡因在其濃度為5mmol對精子具有激活作用達到最佳；己酮可可堿也有促進精子活化的功能，其最佳效應濃度為1mmol，血管舒緩素對精子無明顯活化作用。Pariz等[26]設計實驗，探索咖啡因在低溫冷藏人類精子復溫后的不同時間內(nèi)，對精子的激活效應是否有差異，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)在復溫15min時加入咖啡因后，其對精子的獲能效應最強，并且復溫后不運動的精子比例明顯減少。環(huán)糊精載膽固醇復合物[27，28]促進低溫冷藏復溫后精子的運動并提高復溫后精子的存活率。

一氧化氮作為活性氧的一種，它具有傳遞細胞信息[29]的功能，而且研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮對于精子獲能和頂體反應均起到重要作用。大量的證據(jù)支持：只要一氧化氮的使用濃度不要超過生理濃度 （一般認為少于1微摩爾[30]），一氧化氮的可以發(fā)揮其重要生理意義。Wang等[31]對一氧化氮的使用濃度以及使用持續(xù)時間進行了研究，得到結(jié)論：在合適的濃度范圍下，充足時間持續(xù)作用于精子對其獲得動能非常有益。

神經(jīng)生長因子作為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的重要營養(yǎng)因子，同時對于內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)同樣很重要[32]。新的研究[33]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子和它的兩個特異性受體 （TrkA和p75）廣泛分布于生殖系統(tǒng)中，包括精子的頭部和尾部[34]。Lin等將神經(jīng)營養(yǎng)因子和精子共孵化，發(fā)現(xiàn)精子的移動距離明顯增加，并且隨著濃度的增大，精子移動的距離隨之增加，呈現(xiàn)出劑量依賴性特征，同時達到A等級精子[36]的比例明顯增加。

（二）射線類型精子激活劑

在上世紀，許多學者就注意到物理因素對精子的運動能力的影響，并且不斷的精確研究提高精子運動能力的各因素，其中主要集中在激光照射使精子的運動能力獲得提升，以及照射的元素，照射的計量和波長，被照射精子的質(zhì)量，是否對細胞造成損害。Sato等[37]使用氪元素紅激光，多樣的照射方式對人精子進行照射，發(fā)現(xiàn)該激光可以明顯提高精子的運動能力。Lenzi等[38]輔助使用計算機分析儀，通過測定精子運動的速率以及距離，充分證實了前者的結(jié)論。Yazdi等[39]對激光的照射劑量進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)使用4～6J/cm2的放射劑量，持續(xù)照射40～60min后，人精子的運動能力明顯提高。NSalama等[40]收集了27例人精子樣本，其中包括弱精子癥患者和正常成年男性兩組樣本，使用波長為636.6nm波長，總輸出功率為13W的紅光LED燈，距離試管5cm處對精子進行照射，通過測定精子肌酸激酶活性，進行低滲的腫脹測試和苯胺藍染色后，證實精子的運動活力明顯提高，可認為紅光LED燈是一種安全使用的工具，對體外精子運動能高有很高使用價值。FrangezBan等[41]經(jīng)過實驗驗證了上述結(jié)論，但是還得到另一結(jié)論，即LED燈的波長在470-850nm范圍內(nèi)時，精子的運動能力可得到明顯提升。Harrison等[42]分別使用波長為660-850nm（100～400 J）的 LED 燈和波長為 810nm（2-4 J）的二極管激光對人類精子進行照射，結(jié)果顯示中間值放射量的LED燈照射與2J放射量的二極管激光照射30min后，精子獲得的動能最大。而國外有報道[43]進行的試驗發(fā)現(xiàn)，隨著照射劑量的增加，精子運動的速度逐漸降低。

目前對激光的作用機制尚未研究清楚，SB Doshi等[44-46]研究認為激光照射后，生物刺激會使細胞以及線粒體合成大量的ATP（三磷酸腺苷），為精子提供能量。國外有學者[47，48]認為，一定劑量激光會刺激細胞外的Ca2+向細胞內(nèi)流動，而精子的鞭毛運動主要靠Ca2+的激活，所以會使精子的活力增強。而Lin認為[35]激光照射會刺激細胞膜，細胞質(zhì)，線粒體產(chǎn)生大量活性氧，比如超氧陰離子，一氧化氮，過氧化氫等，這些物質(zhì)作為第二信使調(diào)節(jié)精子獲得動能，并激發(fā)頂體反應。SLuo等[49]將公羊精子置于碳離子（12C6+）放射的環(huán)境中，探究碳離子對精子的運動活力及存活率的影響，得出結(jié)論：0.1Gy的碳離子劑量是提高精子質(zhì)量的最合適劑量。探討機制后認為大劑量的離子放射可增加精子的糖酵解過程，產(chǎn)生大量烯醇化酶和ATP，為精子的運動提供充足能力。

（三）中藥制劑型精子激活劑

雖然中藥制劑治療弱精子癥的報道比較多，但只有部分中藥的效果已經(jīng)得到了基礎試驗的驗證和廣泛的認可。陳智等[50]研究刺五加水提物在體外對弱精子癥患者的各項運動參數(shù)的影響，并且探究最佳效應濃度，經(jīng)過實驗后得出，刺五加水提物體對精子運動能力有很大提高，其最佳的效應濃度為10g/L。梁培育等[51]將黃芪注射液與弱精子癥精子共孵化，檢測精子中線粒體的功能，發(fā)現(xiàn)線粒體的活性明顯提高，為黃芪提高精子活力提供了理論基礎。Ayeleso等[52]對糖尿病小鼠模型的精液進行分析后得出，高血糖顯著降低精子的運動能力，之后使用紅棕櫚油（2mL/d）和南非路易波士茶汁提取物（2%）對小鼠模型進行注射，7周后，提取小鼠的精液進行分析，結(jié)果顯示紅棕櫚油和南非路易波士茶汁提取物提高了精子的直線運動速度和擺動頻率。

三、小結(jié)

精子從發(fā)生到獲得動能，再到具備與卵子結(jié)合成為正常胚胎，這其中的每個環(huán)節(jié)，每種物質(zhì)以及每個條件，只要發(fā)生微小的變化，精子的質(zhì)量或者生存的微環(huán)境就會發(fā)生明顯變化，最終導致卵子不能正常受孕。而輔助生殖技術(shù)的核心環(huán)節(jié)，就是在體外為精子創(chuàng)造一個優(yōu)良的微環(huán)境，包括溫度、pH、多種無機離子、多種蛋白質(zhì)，多種酶；同時，盡可能的糾正精子自身的缺陷，比如，線粒體產(chǎn)生能量不足，低溫冷藏后對精子的損害等，使之在授精以前達到最優(yōu)良的狀態(tài)，從而增加受孕率。因此，一些研究者對體外精子的培養(yǎng)各個環(huán)節(jié)進行探索，包括對精子自身缺陷的糾正，微環(huán)境不良的改善，輔助精子在低溫冷藏后復溫過程中的動能的獲得，以及降低體外精子的脂質(zhì)過氧化損傷。但是，以上提到的各種精子激活劑中，許多仍處于實驗階段，有些試劑，如已酮可可堿、咖啡因等不良反應也有許多文獻報道。使用一定激光照射，確實會增加精子的運動活力，但是關(guān)于其不良反應，卻鮮有報道。對于試劑使用的劑量，各家報道有很大差異，如鈣離子在外環(huán)境中的濃度，激光照射的劑量等。同時，對于多數(shù)研究，樣本較少，研究指標單一，結(jié)論說服力較弱。所以，對于精子體外培養(yǎng)，大樣本，多因素的廣泛研究，以及后續(xù)的臨床試驗仍是必須的。