高通量基因測序調(diào)查尿道下裂患者雄激素作用相關(guān)基因甲基化研究

劉毅東 吳 旻 葉惟靖 黃翼然

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院泌尿外科（上海 200127）

尿道下裂發(fā)病率約1/300，并且呈逐年增長的趨勢[1-3]，目前眾多國內(nèi)外對于尿道下裂的發(fā)病原因進行了深入的研究，但是均未得出一個明確結(jié)論。目前熱門的流行病學和實驗室調(diào)查將尿道下裂發(fā)病病因指向表觀遺傳學方向[4]，其中由于胚胎在8～14周尿道形成的關(guān)鍵時期[5,6]，可能會受到內(nèi)源性或者外源性因素的影響，通過改變雄激素基因表達表觀遺傳編程作用途徑，影響胎兒雄激素對胎兒的作用，從而影響了正常陰莖及尿道的發(fā)育過程。這引起我們對尿道下裂患者發(fā)病原因進行探究。查閱文獻我們發(fā)現(xiàn)國外有學者研究發(fā)現(xiàn)部分相關(guān)基因甲基化在尿道下裂患者組織中高表達，并提出基因甲基化可能是尿道下裂的發(fā)病機制。我們對于我們?nèi)巳褐心虻老铝雅c甲基化關(guān)系的研究甚少，為了驗證這條途徑是否對尿道下裂患者發(fā)病機制產(chǎn)生影響，我們對123例患者包皮內(nèi)板組織進行雄激素相關(guān)基因甲基化定量檢測，為尿道下裂后續(xù)基因治療提供部分基礎(chǔ)。

資料和方法

一、臨床資料

收集自2012年到2015年于我院接受手術(shù)的患者123名，其中包括實驗組尿道下裂修補術(shù)患者包皮內(nèi)板96 例，年齡從 3.5～8 歲。 平均年齡（5.0±1.5）歲，又根據(jù)患者術(shù)前尿道開口的位置，將尿道下裂患者分為輕中度和重度組。輕中度組定義為尿道開口于冠狀溝及陰莖體中段；重度組定義為尿道口開口于陰莖體近端及會陰部。其中輕中度組患者55例，重度組患者41例，對照組為在我院行包皮環(huán)切的患者包皮內(nèi)板27例，年齡從 3.7～7.5 歲，平均（5.0±0.8）歲，術(shù)前均確定有正常的尿道開口，陰莖及尿道發(fā)育正常。所有患者均排除其他生殖器疾病、隱睪、染色體異常及內(nèi)分泌功能缺陷，術(shù)前基因檢查排除AR基因及SRD5A2基因突變情況，術(shù)前均未接受激素治療。

二、實驗方法

（一）對組織提取樣本的要求

1.樣品類型：基因組DNA，溶解在H2O或TE（pH 8.0）中。樣品純度：OD 260/280值應(yīng)在1.8～2.0之間，無明顯降解與蛋白污染。提取的DNA樣本濃度：最低濃度不低于20ng/μL。

2.樣品總量：每個樣品總量1μg，滿足200個目的片段測序。

（二）試劑耗材

TruSeq DNA樣品制備試劉盒；EpiTect亞硫酸氫鹽試劉盒；TruSeq PE簇生成試劑盒；TruSeq測序試劑盒；QIAquick PCR純化試劉盒；QIAquick凝膠提取試劑盒；NEBNext脫氧核糖核酸片段化酶。

（三）實驗儀器

AB 2720熱循環(huán)儀；Xiang Yi H1650-W離心機；渦旋儀；凝膠電泳；NanoDrop定量儀；Ambion磁性支架；Invitrogen Obit分光光度計；Illumina cbot簇生成支架；Illumina基因組分析儀IIX。

（四）引物的設(shè)計

根據(jù)患者AR基因及SRD5A2基因設(shè)計的引物見表 1、表 2

表1 AR基因設(shè)計引物

表2 SRD5A2基因設(shè)計引物

（五）實驗步驟

1.亞硫酸氫鹽處理：使用EpiTect Bisulfite Kit進行樣本處理。

2.樣本目標片段多重PCR反應(yīng)：使用以下PCR條件：A 20μL混合溶液其中包括：1×反應(yīng)緩沖液（TAKARA）,2mmoL Mg2+,0.2mmoL dNTP,0.1μMoL引物，1 U HotStarTaq聚合酶 (TAKARA)and 2μL模板DNA。PCR循環(huán)條件：預(yù)熱階段：95℃，2min；循環(huán)階段：94℃，20 s，11 個循環(huán)；63℃每個循環(huán) 40 s；72℃ 1min；94℃，20 s，24 個循環(huán)；65℃，30 s； 72℃， 1 mins。 延伸階段：72℃，2 min。

3.相同樣本的多重PCR反應(yīng)體系混合。

4.樣本添加特異性標簽序列：使用以下PCR條件：20μL 混合溶液，包括 1×反應(yīng)緩沖液（NEB Q5TM），0.3 mmoL dNTP，0.25μmoL 引物，0.25μmoL 索引引物，1 U Q5TM DNA聚合酶（NEB）和1μL稀釋模板，循環(huán)再98℃，30s；11 個循環(huán) 98℃， 10 s；65℃，30 s；72℃，30 s；72℃，5 min。

5.定量后應(yīng)用高通量Illumina Genome Analyzer IIx上機測序。

結(jié) 果

實驗組96例，對照組27例的AR基因及SRD5A2基因甲基化個體水平的結(jié)果見表3。AR基因CpG島共測得46個甲基化位點，整體水平下AR基因甲基化在實驗組與對照組間無統(tǒng)計學差異,均值0.112±0.051 vs 0.107±0.019，P＞0.05（圖 1）。 SRD5A2 基因 CpG島共測得25個甲基化位點，整體水平下SRD5A2基因甲基化在實驗組與對照組間存在統(tǒng)計學差異，均值0.044±0.008 vs 0.039±0.006，P＜0.05（圖 2，圖 3）。

圖1 AR基因CpG島在46個不同的rs片段中實驗組與對照組差異性研究（96 vs 27，46個位點，總體P＞0.05）

圖2 SRD5A2基因CpG島在25個不同的rs片段中實驗組與對照組差異性研究（96vs27，25個位點，總體P＜0.05）

表3 AR基因及SRD5A2基因甲基化個體水平研究（x±s）

圖3 AR基因及SRD5A2基因甲基化亞組水平研究

討 論

胚胎在8～14周尿道形成的關(guān)鍵時期[5,6]，患者受到內(nèi)源性或者外源性因素的影響，改變雄激素基因表達表觀遺傳編程作用途徑，影響了正常陰莖及尿道的發(fā)育過程。雄激素作用相關(guān)過程：睪酮（T）在SRD5A2的作用下生成雙氫睪酮（DHT），DHT作用于AR，影響男性生殖器的發(fā)育過程[7]。其中任意一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，將會影響到男性生殖器的正常發(fā)育，最終可能成為尿道下裂發(fā)病的重要原因之一。Wang等曾報道SRD5A2基因突變在中國人群尿道下裂的一個重要的發(fā)病因素，AR基因突變并沒有在尿道下裂中出現(xiàn)[8]。Akcay等人也同樣報道了在雄激素不敏感的患者中出現(xiàn)SRD5A2基因突變，未發(fā)現(xiàn)AR基因突變現(xiàn)象[9]?？v觀國內(nèi)外對于這一方面的研究，表觀遺傳學的研究是近來一大熱門[10,11]，尤其是腫瘤領(lǐng)域[12-14]。但是我們發(fā)現(xiàn)對于尿道下裂疾病發(fā)生與雄激素相關(guān)基因甲基化的研究少有報道。Vottero等[15]在高加索人人群20例尿道下裂患兒的包皮組織中找到了表觀遺傳學異常的證據(jù)。其研究結(jié)果表明尿道下裂實驗組的包皮組織AR基因甲基化的程度明顯高于正常對照組的包皮組織。以上研究提示，雄激素作用相關(guān)基因的表觀遺傳學改變，影響基因的表達過程。近年來，隨著技術(shù)的發(fā)展，高通量的DNA甲基化檢測技術(shù)隨之出現(xiàn)，Choudhry等第一次使用高通量甲基化分析檢測了12名尿道下裂患者與8名對照組CpG位點甲基化差異性[16]，這一作用機制在我們的尿道下裂患者中是否也是如此或者影響到什么程度，引起我們的興趣。

AR基因及SRD5A2基因正常表達在雄激素作用途徑中起著至關(guān)重要的作用，任何一方表達受到抑制，均會影響其正常的發(fā)揮作用[17]。這給我們啟示是：對于非基因突變的尿道下裂患者是否存在甲基化情況。于是針對AR基因及SRD5A2基因附近區(qū)域CpG島甲基化定量檢測進入我們的課題。

我們的實驗對AR基因及SRD5A2基因附近區(qū)域CpG島進行深度、高準確度檢測。實驗結(jié)果表明：基因水平下實驗組與對照組間AR基因甲基化無統(tǒng)計學差異。部分RS位點盡管存在統(tǒng)計學上的差異，但是其甲基化率過低，所以實驗組與對照組在AR基因CpG島甲基化程度并不考慮其差異性；同樣，SRD5A2基因甲基化在實驗組與對照組間數(shù)據(jù)上存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05），但是考慮其甲基化均值太低，亦不考慮其甲基化的差異性。兩者在輕中度組、重度組同樣甲基化程度呈現(xiàn)極低狀態(tài)，亦不考慮其甲基化存在區(qū)別。這說明在我們的患者當中尿道下裂疾病發(fā)生發(fā)展及其嚴重程度可能與雄激素作用相關(guān)基因AR基因、SRD5A2基因CpG島甲基化程度關(guān)聯(lián)性較小。這與Vottero[15]等報道的高加索人人群AR基因甲基化結(jié)果存在差異。該結(jié)果表明在我們?nèi)巳褐锌赡艽嬖谀虻老铝鸦颊叩陌l(fā)病機理不同于高加索人人群。中國幅員遼闊，環(huán)境習性差異大，或許還需要多中心大樣本合作檢驗。本文不足之處是未解釋尿道下裂的發(fā)病機制，今后需要在蛋白水平上進一步研究。

結(jié) 論

在我們的患者中雄激素相關(guān)基因AR及SRD5A2基因CpG島甲基化抑制了雄激素發(fā)揮作用這條途徑，可能并不是尿道下裂發(fā)病的主要機制。