應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片CM10檢測(cè)弱精子癥患者精漿標(biāo)志物

徐建新 呂勝啟 朱 濤 方登攀

1.江漢大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科（湖北武漢 430015），2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科（湖北武漢 430060），

弱精子癥是男性不育最常見(jiàn)的疾病之一，但其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，阻礙了弱精子癥臨床診斷和治療的進(jìn)展。蛋白質(zhì)芯片可以篩選出生物標(biāo)志物已經(jīng)取得階段性進(jìn)展，因此針對(duì)精液異常的弱精子癥患者，我們采用CM10芯片結(jié)合蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)精漿樣本進(jìn)行檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析，確立與弱精子癥發(fā)病機(jī)制相關(guān)的重要蛋白，是探尋男性不育原因的一條新思路，這將為探討弱精子癥的診療研究提供重要依據(jù)。

資料和方法

一、臨床資料

所有標(biāo)本均于2017年3月～2017年12月取自江漢大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，按世界衛(wèi)生組織診斷標(biāo)準(zhǔn)行3次精液常規(guī)分析后，選取結(jié)果符合弱精子癥診斷標(biāo)準(zhǔn)者45例，為弱精子癥（RJ）組，平均年齡33歲。對(duì)照組38例，年齡25-38歲，來(lái)源于正常健康男性自愿者捐獻(xiàn)的精液標(biāo)本，為正常（N）組；研究對(duì)象采集精液前禁欲5～7d，待標(biāo)本完全液化后，按精子分析儀對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定精液標(biāo)本的顏色、pH值、精子計(jì)數(shù)、精子活力、液化時(shí)間、及畸形率等。精液標(biāo)本放入無(wú)菌離心管中，離心分離精漿，取上層精漿標(biāo)本1～3mL裝入Ep管中，快速置入液氮冷凍保存。

二、研究方法

（一）精漿標(biāo)本處理

從液氮罐中取出精液樣品，冰凍精漿冰上融解；離心（42×g,4℃）5min，取上清液備用；取 20μl U9 緩沖液（1%DTT,9mol/L 尿素，2%CHAPS）加入 10μl精漿置入EP管中，并將樣品充分混勻，冰浴振蕩30min（500r/min）； 在 160μl的 50mmol NaAC,pH4 結(jié)合緩沖液中加入40ul上述變性的樣本，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）芯片處理

取出CM10的芯片，在芯片背后標(biāo)記操作者的姓名、時(shí)間，芯片種類(lèi)等資料，將芯片經(jīng)10mol/LHCL活化處理10min，再用結(jié)合緩沖液(50mM NaAC,pH4.0)處理10min，將芯片裝入生物芯片處理器。再用振蕩器輕微震動(dòng)芯片5min，甩掉緩沖液。重復(fù)上述操作一次。將100μl處理好的樣品加入在芯片處理器每個(gè)孔中，置振蕩器(MS1Minishaker)42×g,室溫孵育 1h。

（三）上機(jī)檢測(cè)

每孔加入50mmol/L NaAc結(jié)合緩沖液200ul，置振蕩器(MS1 Minishaker)42×g震蕩5min，取出芯片風(fēng)干，每孔加入SPA飽和液0.5μl，5min后重復(fù)加入SPA飽和液0.5ul，芯片干燥后即可上機(jī)測(cè)定。

三、蛋白質(zhì)指紋圖譜

利用NP20芯片對(duì)TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行校正，采用激光源強(qiáng)度為160，檢測(cè)器靈敏度為8，真空度為8.387e-007 Torr，最高掃描分子質(zhì)量Mr50000Da，最低分子質(zhì)量為1000。所有芯片按照上述條件檢測(cè)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

篩選符合正態(tài)分布的樣本采用Ciphergen protein chin software分析兩組樣本的相關(guān)性，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSSl6.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，兩組樣本比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)為差異有顯著性。

結(jié) 果

用CM10芯片結(jié)合蛋白質(zhì)芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)兩組精漿樣本進(jìn)行比較分析，捕獲兩組標(biāo)本的蛋白質(zhì)指紋圖譜。

在CM10蛋白質(zhì)芯片上共檢測(cè)到118種有差異的蛋白峰，弱精子癥組較正常組有2處蛋白峰表達(dá)降低，差異有顯著性（P＜0.05），其中 M/Z 為 6811.14、15520.4；弱精子癥組較正常組有2處蛋白峰表達(dá)增高，差異有顯著性（P＜0.05），M/Z 為 2760.30、14772.0，見(jiàn)表 1。

表1 弱精子癥（RJ）組與正常(N)組精漿中差異蛋白質(zhì)列表（x±s）

表2 CM10蛋白質(zhì)芯片篩選到的弱精子癥差異蛋白

討 論

弱精子癥是指精液參數(shù)中前向運(yùn)動(dòng)的精子（a和b級(jí)）小于50%或a級(jí)運(yùn)動(dòng)的精子小于25%的病癥，故又稱(chēng)為精子活力低下。男性不育是嚴(yán)重的社會(huì)及醫(yī)學(xué)問(wèn)題[1]，這一疾病嚴(yán)重困擾著患者和醫(yī)生，而弱精子癥是引起男性不育的重要因素之一，文獻(xiàn)報(bào)道，因精子活力低下而導(dǎo)致的男性不育約占所有男性不育致病因素的50%[2]。弱精子癥的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及到精子運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)和功能的異常、信號(hào)傳導(dǎo)通路異常等因素。臨床上弱精子癥的治療困擾著臨床醫(yī)師，各種經(jīng)驗(yàn)性的治療用來(lái)改善精子活力，但療效甚微。研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致精子活力下降與蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化、染色體異常、精漿異常、精索靜脈曲張、內(nèi)分泌因素、生殖道感染等很多因素相關(guān)[3，4]。精液質(zhì)量與微量元素含量的變化有關(guān)，酶活性降低或酶類(lèi)缺乏與精子運(yùn)動(dòng)也有關(guān)系，兩者都可以引起精子受精能力低下。精子活力對(duì)于男性生育力的維持至關(guān)重要，但目前對(duì)于弱精子癥患者精漿中蛋白質(zhì)的變化及其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)研究甚少。

圖1 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z2760.30）

圖2 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z14772.0）

圖3 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z6811.14）

蛋白質(zhì)芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（SELDI-TOF-MS）是一種對(duì)所有蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、圖譜化、鑒定，探尋疾病的生物標(biāo)志物、藥物靶點(diǎn)具有高度靈敏度、自動(dòng)化、微型化的檢測(cè)工具[5]。通過(guò)檢測(cè)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量進(jìn)而對(duì)蛋白質(zhì)分子的修飾、蛋白質(zhì)分子的鑒定來(lái)進(jìn)行研究，可以探究蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位和信號(hào)傳遞與調(diào)控作用，闡明相關(guān)疾病的分子機(jī)制。運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)精漿中差異蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，可以為精子的受精能力、發(fā)育、運(yùn)動(dòng)等相關(guān)研究提供有利線(xiàn)索，可望對(duì)于弱精子癥的診斷和治療提供新的思路。

圖4 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z15520.4）

目前，將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于男性不育的相關(guān)研究，可以篩查出差異表達(dá)蛋白用于疾病診斷、治療和預(yù)防的標(biāo)志物，并且收到較好效果。楊歡等應(yīng)用H4蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)少精子癥患者的精漿，發(fā)現(xiàn)有1處蛋白峰明顯降低，其相對(duì)分子量為M/Z11022.9，在SAX-2芯片上發(fā)現(xiàn)有1處蛋白質(zhì)峰較正常生育男性精漿明顯升高，其分子量為M/Z16751.6[6]。Kempisty等對(duì)100例弱精子癥患者和70例正常生育男性精子中的PRM轉(zhuǎn)入水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)弱精子癥組PRM轉(zhuǎn)入水平較正常組顯著降低（P＜0.01）[7]。景曉瑋等利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)對(duì)弱精子癥患者精子中GRISP2基因進(jìn)行研究，并認(rèn)為GRISP2蛋白及基因是進(jìn)一步研究弱精子癥的分子靶點(diǎn)[8]。Liu FJ等應(yīng)用等利用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)了年老及年輕患者弱精子癥精液中PATE1蛋白質(zhì)的差異性，發(fā)現(xiàn)PATE1蛋白是可能為弱精子癥發(fā)病機(jī)制的一個(gè)靶點(diǎn)[9]。Smith等[10]報(bào)道精子特異性的硫氧還蛋白Txndc2、Txndc3在保護(hù)精子細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。

我們采用CM10蛋白質(zhì)芯片結(jié)合蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)正常生育男性和弱精子癥患者的精漿蛋白質(zhì)進(jìn)行篩查，建立正常（N）組與弱精子癥（RJ）組精漿差異蛋白凝膠狀示意圖及指紋圖譜，并發(fā)掘弱精子癥患者中特異性的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到118種有差異的蛋白峰和弱精子癥相關(guān)，結(jié)果證實(shí)弱精子癥組較正常組相比存在著差異蛋白質(zhì)，捕獲到的4種差異蛋白質(zhì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，弱精子癥組精漿較正常組蛋白質(zhì)譜相比有兩處蛋白質(zhì)峰明顯降低，其中M/Z為6811.14、15520.4，差異有顯著性（P＜0.05）。較正常組有2處蛋白峰明顯增高，其分子量M/Z為2760.30、14772.0，差異有顯著性（P＜0.05）；說(shuō)明精漿中這些差異蛋白質(zhì)的含量變化很可能與弱精子癥的發(fā)病機(jī)制有著重要相關(guān)性，可以將這4種差異蛋白質(zhì)作為弱精子癥臨床篩查的精漿標(biāo)志物。其他學(xué)者也利用SELDI-TOF-MS技術(shù)篩查出了正常男性和弱精子癥患者精漿蛋中的一些差異蛋白質(zhì)，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有助于擴(kuò)充蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),有助于對(duì)其發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究[11]。

但是，目前我們還不能直接給出這些差異蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能和結(jié)構(gòu)等信息，若對(duì)所測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離研究，搜索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，更深入的了解這些差異蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能本質(zhì)，同時(shí)研究弱精子癥的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，最終有助于闡明弱精子癥的發(fā)病機(jī)制，并可望對(duì)弱精子癥的診療開(kāi)辟新的途徑。