克羅米芬促排卵周期中應(yīng)用壽胎丸對(duì)小鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜及其容受性、妊娠結(jié)局的影響▲

李 楠 王麗君 張 輝

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，咸陽(yáng)市 712000，電子郵箱：linan_80_311@163.com)

臨床上，克羅米芬用于治療排卵障礙性不孕癥，具有價(jià)格低廉、口服給藥、使用安全等優(yōu)點(diǎn)[1]。但是由于克羅米芬同時(shí)具有抗激素作用，易造成子宮內(nèi)膜容受性下降而出現(xiàn)“高排低孕”現(xiàn)象。中醫(yī)藥治療是解決克羅米芬負(fù)面效應(yīng)的有效方法之一。為了明確中醫(yī)藥壽胎丸對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響，本研究建立克羅米芬誘發(fā)排卵模型，觀察壽胎丸對(duì)著床窗口期子宮內(nèi)膜形態(tài)、厚度，子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的表達(dá)，以及對(duì)妊娠率的影響，為中藥輔助促排卵藥物提高妊娠率提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成熟期、未孕雌性ICR系無(wú)特定病原體小鼠，6～8周齡，體重(30±5)g，清潔級(jí)性成熟雄性小鼠體重，6～8周齡，體重(30±5)g，均由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(川)2015-030。喂養(yǎng)條件：室溫(20±2)℃，自由攝食、飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 藥物：枸櫞酸氯米芬膠囊(商品名：克羅米芬)購(gòu)自康和藥業(yè)(批號(hào)：k0702)，人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)購(gòu)自上海麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠(批號(hào)：170901-1)。壽胎丸由菟絲子、續(xù)斷、桑寄生、阿膠組成，均由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科對(duì)中藥材的來(lái)源及品種進(jìn)行鑒定后，采用水提醇沉法制備藥液，藥物終濃度為1 g生藥/mL， 4℃冰箱保存。

1.1.3 主要試劑及儀器：蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色液(批號(hào)：C0105)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，4%多聚甲醛(批號(hào)：P8430-25)、1%氯化氫-75%乙醇(批號(hào)：80176961)、氫氧化鈉堿液(批號(hào)：C380215000)、95%乙醇(批號(hào)：10009128)、80%乙醇(由95%乙醇配制)、丙三醇(批號(hào)：40025861)、二甲苯(批號(hào)：10023418)、磷酸緩沖鹽溶液(批號(hào)：GL1263)、0.01%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，批號(hào)：A30313503)均購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)，濕盒(批號(hào)：YA0764)購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(批號(hào)：A0216)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，二喹啉甲酸蛋白定量測(cè)定試劑盒(批號(hào)：PT0001)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，聚偏氟乙烯膜(批號(hào)：ISEQ00010)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，電化學(xué)發(fā)光試劑(批號(hào)：32109)購(gòu)自德國(guó)Roche公司，兔抗LIF多克隆抗體(批號(hào)：sc-20087)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，PrimeScriptTMRT試劑盒(批號(hào)：RR037Q)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑(批號(hào)：RR820L)均購(gòu)自TaKaRa公司。CM3050S型冷凍切片機(jī)、IX71型倒置顯微鏡均購(gòu)自Leica公司，StepOnePlus型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，Trans-Blot型電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，2-16k型離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司，LS-2型超凈工作臺(tái)購(gòu)自北京安泰公司，S648型電熱恒溫水箱購(gòu)自上海醫(yī)療器械廠，XSZ-81型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自廣西梧州市光學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 分組方法：每日將棉簽蘸少許生理鹽水后，于雌性小鼠陰道壁外1/3處旋轉(zhuǎn)一圈后取出，行陰道涂片，均勻涂于載玻片上，晾干后用95%乙醇固定30 min；洗去玻片上的乙醇，經(jīng)蘇木素染色5 min，流水沖凈，置入酸性乙醇分化液中浸提2次，每次不超過(guò)10 s，清水洗滌去除多余分化液；將載玻片經(jīng)伊紅染色3 min，自來(lái)水洗滌；干燥后在顯微鏡下觀察并記錄。連續(xù)觀察2個(gè)動(dòng)情周期，將具有規(guī)律動(dòng)情周期的90只雌性小鼠納入本研究。從第3個(gè)動(dòng)情周期開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將雌鼠分為對(duì)照組、克羅米芬組和中藥組，每組30只。

1.2.2 給藥方法：小鼠動(dòng)情周期為4～5 d，分為動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期，于動(dòng)情前期參照文獻(xiàn)[2]用藥，參照小鼠等效劑量相當(dāng)于人用劑量的9.1倍，計(jì)算小鼠灌胃劑量。對(duì)照組按照1 mL/100 g灌服生理鹽水，1次/d，直至合籠后第4天?？肆_米芬組按照140 mg/(kg·d)給予克羅米芬，每次按1 mL/100 g灌服，1次/d，連續(xù)2 d；合籠后12 h開(kāi)始按照1 mL/100 g灌服生理鹽水，1次/d，直至合籠后第4天。中藥組在克羅米芬組基礎(chǔ)上，從合籠后12 h開(kāi)始按1 mL/100 g灌服中藥，1次/d，直至合籠后第4天。在連續(xù)灌胃2 d后上午8時(shí)，給各組小鼠腹腔內(nèi)注射HCG 5 IU，注射后12 h與雄性小鼠合籠，雌雄比例為2 ∶1。合籠后第4天，每組各處死10只雌性小鼠，觀察妊娠數(shù)，并取子宮觀察內(nèi)膜厚度和形態(tài)學(xué)變化，并檢測(cè)著床窗口期LIF的表達(dá)；分別于第5天、第7天每組各處死10只雌性小鼠，觀察各組的妊娠數(shù)。

1.2.3 HE染色觀察著床窗口期子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化：合籠后第4天，小鼠斷頸處死，于75%乙醇中浸泡消毒5～10 min。無(wú)菌條件下，用生理鹽水沖洗小鼠子宮，體式顯微鏡下檢到囊胚，則確定為妊娠小鼠，隨即留取整個(gè)子宮，放置于4%多聚甲醛中固定24 h。將小鼠子宮包埋于包埋劑后，于冷凍切片機(jī)上切片，設(shè)置切片厚度為5 μm。選取平整的切片進(jìn)行HE染色。將切片于4%多聚甲醛中固定10～30 s，水洗；染蘇木素3～5 min，水洗；1%氯化氫-75%乙醇分化5～10 s，水洗；用堿水促藍(lán)20 s，水洗；伊紅染色30～60 s，水洗；80%乙醇洗3～5 s，95%乙醇洗3～5 s，無(wú)水乙醇洗3～5 s，丙三醇封片。倒置顯微鏡下采用Leica Qwin Plus圖像處理軟件觀察著床窗口期子宮內(nèi)膜厚度，以及腺體的周長(zhǎng)、面積和最大直徑。

1.2.4 檢測(cè)著床窗口期小鼠子宮內(nèi)膜LIF蛋白的表達(dá)：獲取合籠后第4天的妊娠小鼠子宮組織。將組織標(biāo)本經(jīng)預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，剪成約為0.5 g的多個(gè)組織塊，加液氮研磨后加入RIPA裂解液，超聲波破碎，冰浴裂解30 min。4℃下15 000 r/min離心20 min，取上清，采用二喹啉甲酸蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。隨后向蛋白中加入上樣緩沖液，100℃水浴10 min使蛋白變性。用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，轉(zhuǎn)膜后用含10%脫脂奶粉的TBST(20 nm三羥甲基氨基甲烷，150 nm氯化鈉，0.05% Tween-20)室溫封閉2 h，隨后將膜轉(zhuǎn)入含有兔抗LIF多克隆抗體的封閉液中，4℃過(guò)夜孵育。一抗孵育結(jié)束后用TBST洗膜3次，10 min/次。洗滌后的膜放入含有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗封閉液中，室溫孵育2 h。孵育結(jié)束后用TBST洗膜3次，10 min/次。洗滌后的膜用化學(xué)底物發(fā)光法進(jìn)行顯色，然后到暗室中曝光。采用Quantity One軟件進(jìn)行對(duì)特異蛋白條帶進(jìn)行灰度掃描和定量分析。

1.2.5 著床窗口期小鼠子宮內(nèi)膜LIF mRNA的表達(dá)：獲取合籠后第4天的妊娠小鼠子宮組織。利用TRIzol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以各組子宮內(nèi)膜的cDNA為模板，利用特異性定量引物進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，基因特異性引物見(jiàn)表1，每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)體系為20 μL，包括2×SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上游引物(10 μm)0.8 μL，下游引物(10 μm)0.8 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，模板(cDNA)2 μL，雙蒸水6 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，行溶解曲線分析。實(shí)驗(yàn)選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因。采用2-△△CT法計(jì)算mRNA表達(dá)量，每組數(shù)據(jù)值取3個(gè)獨(dú)立樣品的平均數(shù)。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.6 妊娠率的計(jì)算：合籠后第4天、第5天、第7天，摘取各組小鼠子宮，記錄孕鼠數(shù)。生理鹽水沖洗子宮，體式顯微鏡下觀察是否有胚胎，有胚胎者視為孕鼠，無(wú)胚胎者視為未孕。總?cè)焉锫?(總孕鼠數(shù)/交配雌鼠數(shù))×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用(x±s)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較選擇LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(率)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)學(xué)變化 合籠后第4天，與其他兩組比較，克羅米芬組的子宮內(nèi)膜厚度變薄，腺體周長(zhǎng)、面積和最大直徑均較小(均P<0.05)，而中藥組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表2。鏡下觀察到對(duì)照組小鼠子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量增多，間質(zhì)疏松、水腫，血管彎曲，管腔擴(kuò)張，腺腔分泌豐富；克羅米芬組小鼠子宮內(nèi)膜腺體排列稀疏，腺上皮呈低柱狀，間質(zhì)致密，部分腺腔內(nèi)見(jiàn)空泡；中藥組小鼠子宮內(nèi)膜腺體腺上皮呈高柱狀，腺腔內(nèi)見(jiàn)較多空泡，間質(zhì)疏松，血管延長(zhǎng)，腺體數(shù)目及成熟度接近對(duì)照組。見(jiàn)圖1。

表2 3組小鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)學(xué)的比較(x±s)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與中藥組比較，bP<0.05。

對(duì)照組 中藥組 克羅米芬組

圖1 3組小鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化(HE染色，×200)

2.2 3組小鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜LIF mRNA及蛋白表達(dá)水平比較 合籠后第4天，與對(duì)照組及中藥組比較，克羅米芬組著床窗口期子宮內(nèi)膜LIF mRNA及蛋白的表達(dá)均降低(均P<0.05)，見(jiàn)圖2及表3。

圖2 3組小鼠著床窗口期子宮內(nèi)膜LIF蛋白表達(dá)情況

組別nLIF蛋白LIF mRNA對(duì)照組 80.95±0.031.59±0.05中藥組70.91±0.021.56±0.04克羅米芬組50.75±0.02a1.37±0.03a F值64.83050.590P值<0.001<0.001

注：與對(duì)照組和中藥組比較，aP<0.05。

2.3 3組小鼠總?cè)焉锫时容^ 克羅米芬組、對(duì)照組、中藥組的總?cè)焉锫史謩e為50.0%(15/30)、83.3%(25/30)、76.7(23/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.889，P=0.012)。其中克羅米芬組的總?cè)焉锫实陀谄渌麅山M(P<0.05)，而對(duì)照組與中藥組的總?cè)焉锫时容^，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 3組小鼠妊娠情況(n)

3 討 論

胚胎的質(zhì)量和子宮內(nèi)膜的容受性是影響妊娠率的兩個(gè)關(guān)鍵因素，其中60%以上的胚胎種植失敗與子宮內(nèi)膜微環(huán)境改變及容受性不良有關(guān)[3]?？肆_米芬作為治療排卵障礙性不孕癥的一線藥物，應(yīng)用過(guò)程中其會(huì)影響子宮內(nèi)膜厚度及宮頸黏液的產(chǎn)生，造成子宮內(nèi)膜出現(xiàn)低容受性而導(dǎo)致妊娠率降低。子宮內(nèi)膜薄、血流不足、內(nèi)膜成熟延遲可導(dǎo)致周期妊娠率低。因此，通過(guò)增加內(nèi)膜的厚度及血供，促進(jìn)內(nèi)膜成熟，使之與卵泡發(fā)育同步化是提高子宮內(nèi)膜容受性及妊娠率的必要條件。臨床中常通過(guò)補(bǔ)充雌激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)，并通過(guò)口服阿司匹林改善內(nèi)膜下血流來(lái)提高內(nèi)膜容受性。近年來(lái)，有研究顯示中醫(yī)藥有助于促排卵，提高臨床妊娠率[4-5]，這充分顯示了中醫(yī)藥在助孕方面的整體優(yōu)勢(shì)。一項(xiàng)Meta分析顯示，相較于單純克羅米芬治療，在克羅米芬促排卵過(guò)程中聯(lián)合補(bǔ)腎中藥治療多囊卵巢綜合征，可提高排卵率和妊娠率[6]，這為進(jìn)一步研究補(bǔ)腎中藥提高妊娠率的機(jī)制提供了證據(jù)支持。

壽胎丸出自著名醫(yī)家張錫純所著的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》[7]，其由菟絲子、續(xù)斷、桑寄生、阿膠四味藥物組成，原方用于治療滑胎和預(yù)防流產(chǎn)。作為固腎安胎第一方，該方劑已經(jīng)成為臨床中應(yīng)用最廣、報(bào)道最多、療效最為顯著的方劑，用于治療先兆流產(chǎn)、不明原因反復(fù)流產(chǎn)等[8-9]。鑒于壽胎丸的有效性，近年來(lái)有學(xué)者對(duì)該方劑開(kāi)展了廣泛而深入的研究臨床及基礎(chǔ)[10-11]，并延伸到輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域[12]。研究表明，壽胎丸能增加子宮內(nèi)膜厚度，提高生育能力和胚胎質(zhì)量，促進(jìn)胚胎著床，從而提高體外受精-胚胎移植周期的成功率[13]。另有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，壽胎丸加減方可提高超排卵小鼠種植窗期子宮內(nèi)膜的容受性[14]。此外，壽胎丸的雌激素樣活性，可明顯降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠胚胎丟失率，調(diào)節(jié)流產(chǎn)小鼠蛻膜組織中多種蛋白質(zhì)表達(dá)，促進(jìn)早孕期胎盤(pán)分泌絨毛膜促性腺激素，調(diào)節(jié)母胎界面的內(nèi)分泌及免疫網(wǎng)絡(luò)分子水平，并提高孕激素水平，從而改善黃體功能，且在合理劑量下對(duì)胚胎發(fā)育無(wú)明顯毒性[15-19]。

本研究結(jié)果顯示，合籠后第4天，中藥組小鼠子宮內(nèi)膜厚度雖不及正常組厚，但較克羅米芬組增厚(P<0.05)，提示受抑制的內(nèi)膜得到了逆轉(zhuǎn)。鏡下觀察到克羅米芬組子宮內(nèi)膜腺體排列稀疏，腺上皮呈低柱狀，間質(zhì)致密，部分腺腔內(nèi)見(jiàn)空泡；而中藥組子宮內(nèi)膜腺體腺上皮呈高柱狀，腺腔內(nèi)見(jiàn)較多空泡，間質(zhì)疏松，血管延長(zhǎng)，腺體數(shù)目及成熟度接近對(duì)照組。提示中藥組小鼠子宮內(nèi)膜腺體、間質(zhì)及血管發(fā)育較成熟，接近于正常小鼠，說(shuō)明壽胎丸雌激素樣活性，彌補(bǔ)了克羅米芬造成的內(nèi)源性雌激素不足的缺陷，促進(jìn)子宮內(nèi)膜的快速恢復(fù)，為胚胎著床提供適宜的子宮內(nèi)膜厚度和良好的內(nèi)膜容受性。本研究中，中藥組的總?cè)焉锫矢哂诳肆_米芬組(均P<0.05)，提示壽胎丸對(duì)胚胎的黏附和植入過(guò)程中的子宮內(nèi)膜局部微環(huán)境有正向調(diào)節(jié)作用。

LIF是一種多效性的分泌型糖蛋白，屬于白細(xì)胞介素6超家族的成員，與相應(yīng)的受體結(jié)合后在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化中發(fā)揮廣泛的作用，與胚胎種植相關(guān)[20]。有實(shí)驗(yàn)表明，LIF基因敲除的小鼠不能發(fā)生胚胎種植，但將基因敲除的小鼠的胚胎種植在正常小鼠或敲除基因后再給予LIF，仍可使胚胎種植[21]。因此，LIF可影響子宮內(nèi)膜的容受性。本研究結(jié)果顯示，克羅米芬組子宮內(nèi)膜LIF mRNA及蛋白表達(dá)均較對(duì)照組和中藥組下降(均P<0.05)，而中藥組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這從分子角度證明了克羅米芬對(duì)子宮內(nèi)膜容受性有負(fù)面影響，而在克羅米芬促排卵周期中應(yīng)用壽胎丸有利于改善子宮內(nèi)膜容受性，從而提高妊娠率。

綜上所述，壽胎丸能夠改善克羅米芬促排卵后子宮內(nèi)膜厚度，增強(qiáng)LIF在內(nèi)膜中的表達(dá)。因此，可以在促排卵助孕周期加用壽胎丸作為輔助治療，以改善著床窗口期子宮內(nèi)膜容受性，以提高臨床妊娠率。