應(yīng)用磁共振體素內(nèi)不相干運動成像評價大鼠肝纖維化

王琳萍，裴彩俠，劉釗，劉海峰，張鵬飛，田瑜，鄭雅蘭，王少彧，雷軍強*

肝纖維化是各因素導(dǎo)致大量膠原和蛋白多糖等細胞外基質(zhì)的過度沉積，研究證實早期(F2期以前)肝纖維化可以通過臨床干預(yù)實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)[1]，肝穿活檢是其診斷金標準，但不能反映肝臟的全部病理改變；目前超聲瞬時彈性成像(transient elastography，TE)、磁共振彈性成像(magnetic resonance elastography，MRE)[2-3]、DWI是臨床評價肝纖維化主要影像檢查方法[4]，但在診斷早期肝纖維化方面存在局限性。較傳統(tǒng)的擴散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging，DWI)成像主要依賴組織中水分子的布朗運動，在活體生物組織內(nèi)水分子運動來自于兩個方面，包括真正的水分子擴散和微循環(huán)灌注所致的水分子擴散效應(yīng)，ADC值包含了水分子擴散運動和微循環(huán)灌注兩種成分，并不能單純地代表活體組織內(nèi)真正的水分子運動。體素內(nèi)不相干運動(intravoxel incoherent motion，IVIM)成像通過雙指數(shù)模型多b值數(shù)據(jù)擬合得到D、f和D*三個重要參數(shù)，其中D值代表體素內(nèi)真實水分子擴散成分；D*和f是灌注相關(guān)參數(shù)，前者是偽擴散系數(shù)，表示組織內(nèi)微循環(huán)灌注引起的假擴散效應(yīng)，后者是灌注分數(shù)，即體素內(nèi)偽擴散成分占總的水分子擴散成分的比例。故IVIM不僅能提示病灶內(nèi)水分子的擴散受限程度，而且同時能夠評估血流變化情況。

本研究基于大鼠肝纖維化模型，探討IVIM雙指數(shù)模型參數(shù)D、D*及f值對肝纖維化診斷及分期的能力，并將其與ADC值對肝纖維化的診斷和分期效能進行比較，為肝纖維化的早期診斷提供動物實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 肝纖維化模型的制備

由蘭州大學(xué)動物中心選成年雄性SPF級SD大鼠[5](倫理委員會批件編號：LDYYLL2018-129) 66只，體重(200±10) g，健康狀況良好，隨機分為實驗組55只和對照組11只，每次注射前稱重以調(diào)整給藥劑量，實驗組0.3 mL/100g體重腹腔注射[6]40% CCl4橄欖油混合液，對照組注射生理鹽水，每周2次，共12周。

1.2 MRI掃描

從第二周開始每周六取實驗組(5只)和對照組(1只)共6只，0.7 ml/100 g體重腹腔注射0.5%戊巴比妥后將其以俯臥位頭先進固定于線圈(西門子3.0 T Skyro 掃描儀，大鼠專用線圈)中以減少運動偽影，進行如下掃描。

常規(guī)序列：Ax TSE-T1WI：TR 721 ms，TE 8.6 ms；SE-T2WI-FS：TR 3000 ms，TE 109 ms；FOV 100 mm×100 mm，層厚3 mm，間距0 mm，NEX為2；DWI：Ax SE-EPI，TR 5000 ms，TE 49 ms，F(xiàn)OV 180 mm×180 mm，層厚3 mm，間距0 mm，NEX為1，b值取0、800 s/mm2。IVIM序列：Ax SE-EPI：TR 6400 ms，TE 106 ms，F(xiàn)OV 200×200 mm，層厚3 mm，間距 0 mm，NEX為1，擴散敏感梯度方向數(shù)3，8個b值分別為0、50、150、200、400、600、800 s/mm2。

1.3 圖像處理與數(shù)據(jù)測量

使用Siemens Workstation后處理DWI序列得到ADC圖。多b值IVIM原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Start MITK Diffusion后處理軟件得到D、f和D*圖。為避免心臟及肝臟管道系統(tǒng)對圖像質(zhì)量和各參數(shù)值的影響，分別在肝臟右后葉盡量靠近病理活檢部位的3個掃描層面上畫取3個位置、大小盡量保持一致的感興趣區(qū)(region of interest，ROI)(大小約 3～4 mm2)，對比參考常規(guī)T2序列圖像，求平均值。圖像處理與數(shù)據(jù)測量均由兩位影像醫(yī)師在未知病理結(jié)果的情況下獨立進行，遇分歧商議解決。

1.4 肝組織病理學(xué)檢查

所有MRI掃描后的大鼠均采用過量麻醉法處死，解剖取出肝組織固定、石蠟包埋切片，行HE染色。由2名資深病理醫(yī)師采用Metavir標準對大鼠肝纖維化分期[7]，進行雙盲法診斷。Metavir標準將纖維化分為F0～F4期：F0期，無纖維化；F1期，匯管區(qū)及其周圍纖維化和竇周少量纖維化；F2期，纖維間隔形成，但小葉結(jié)構(gòu)基本未受到破壞；F3期，纖維間隔增多，破壞肝小葉結(jié)構(gòu)，但無肝硬化；F4期，早期肝硬化。

表1 大鼠肝纖維化模型制備情況Tab. 1 Preparation of rat liver fibrosis model

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

使用SPSS 22.0對DWI及IVIM數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用x±s表示。通過Spearman檢驗分析DWI、IVIM各參數(shù)值與肝纖維化程度的相關(guān)性，采用獨立樣本t檢驗比較正常組與實驗組(肝纖維化)大鼠的參數(shù)值，使用單因素方差分析的LSD-t檢驗法對肝纖維化各期的DWI及IVIM參數(shù)值進行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過ROC曲線判斷各參數(shù)值，即臨界值(Cutoff值)、敏感度(Sen)(95%CI)、特異度(SPE)(95%CI)、陽性似然比(+LR)、陰性似然比(-LR)、Youden指數(shù)對各階段肝纖維化的鑒別診斷價值，并給出最佳參數(shù)閾值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝纖維化模型結(jié)果

試驗期間對照組11只全部順利行MR掃描并納入研究分析；實驗組在建模期間4只死亡(第7、8周各1只，第10周2只)，6只掃描圖像質(zhì)量不佳被排除(第2周2只，第4、5、11、12周各1只)，共45只納入研究分析(表1)。依據(jù)Metavir分級標準結(jié)果為：F1期8只，F(xiàn)2期13只，F(xiàn)3期14只，F(xiàn)4期10只，對照組11只為F0期。

圖1 肝纖維化F0～F4期(A，B) T2壓脂圖像。A：正常小鼠肝組織；B：F1期肝纖維化，肝臟形態(tài)規(guī)則，信號均勻，與正常大鼠無明顯差異；C：F2期肝纖維化，肝臟形態(tài)尚可，但內(nèi)部血管走形僵硬，似可見結(jié)節(jié)樣變，T2信號略升高，可能與CCL4造成的損傷相關(guān)；D：F3期肝纖維化，與F2期無明顯差異；E：早期肝硬化，肝組織結(jié)節(jié)樣變不明顯，與早期肝纖維化表現(xiàn)相似 圖2 肝纖維化F3(A，B)期IVIM序列圖像。A：F3期肝纖維化大鼠IVIM融合圖；B：體素內(nèi)真性水分子擴散D圖，D值為1.13×10-3 mm2/s；C：灌注分數(shù)f圖，f值為0.17；D：體素內(nèi)微循環(huán)灌注D*圖，D*值為35.27×10-3 mm2/sFig. 1 F0—F4 phase (A, B) T2 liposuction image of liver fibrosis. A: normal mouse liver tissue. B: Picture, F1 stage liver fibrosis, liver shape regular, uniform signal, no signi ficant difference with normal rats. C: F2 stage liver if brosis, liver morphology is acceptable, but internal blood vessels Stiff-shaped, seemingly nodular changes, T2 signal slightly elevated, may be related to the damage caused by CCL4. D: F3 liver fibrosis, no signi ficant difference with F2. E: early liver cirrhosis, nodular change of liver tissue is not obvious were not obvious and were similar to early liver fibrosis. Fig. 2 Image of the IVIM sequence of liver fibrosis F4 (A, B). A: IVIM fusion map of F3 liver fibrosis rats. B: The D map of the true water molecule diffusion in the voxel, the D value is 1.13×10－3 mm2/s. C: The perfusion fraction f map, the f value is 0.17. D: Intra-microcirculation perfusion D* map, D* value is 35.27×10-3 mm2/s.

圖3 A：DWI、IVIM各參數(shù)鑒別肝纖維化F0和F1～F4的ROC曲線；B：DWI、IVIM各參數(shù)鑒別肝纖維化F0～F1和F2～F4的ROC曲線；C：DWI、IVIM各參數(shù)鑒別肝纖維化F0～F2和F3～F4的ROC曲線；D：DWI、IVIM各參數(shù)鑒別肝纖維化F0～F3和F4的ROC曲線Fig. 3 A: Identi fication of ROC curves of liver fibrosis F0 and F1—F4 by DWI and IVIM parameters. B: Identi fication of ROC curves of liver fibrosis F0—F1 and F2—F4 by DWI and IVIM parameters. C: Identi fication of ROC curves of liver fibrosis F0—F2 and F3—F4 by DWI and IVIM parameters. D: Identi fication of ROC curves of liver fibrosis F0—F3 and F4 by DWI and IVIM parameters.

2.2 T2WI壓脂及IVIM掃描圖像特點

正常肝臟在T2WI壓脂相上信號稍低，信號強度均勻一致，肝臟邊緣規(guī)整光滑，肝實質(zhì)內(nèi)未見異常信號結(jié)節(jié)影；肝纖維化肝臟信號較高，實質(zhì)信號不均勻，肝臟邊緣不規(guī)整。隨肝纖維化進展，肝實質(zhì)擴散受限明顯，IVIM圖像信號逐漸升高(圖1，2)。

表2 對照組與實驗組各參數(shù)值比較(x±s)Tab. 2 Comparison of values between the control group and the experimental group (x±s)

表3 對照組及實驗組各期肝纖維化各參數(shù)值對比(56只，x±s)Tab. 3 Comparison of parameters of liver fibrosis in control group and experimental group (n=56, x±s)

表4 肝纖維化與各參數(shù)的相關(guān)性Tab. 4 Correlation between liver fibrosis and various parameters

2.3. DWI與IVIM評價指標與統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

2.3.1 對照組與實驗組DWI、IVIM各參數(shù)值對比

對照組和肝纖維化組的ADC值均高于其D值，P＜0.05。實驗組DWI、IVIM各參數(shù)均較對照組減低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05(表2)。

2.3.2 肝纖維化各期 DWI、IVIM各參數(shù)值比較

分析結(jié)果顯示隨肝纖維化水平增加，ADC、D、f及D*總體呈下降趨勢(表3)。在DWI單指數(shù)模型中，F(xiàn)3和F4期ADC值具有顯著差異(P＜0.05)，F(xiàn)0和F1、F1和F2、F2和F3之間ADC值無顯著差異。在IVIM雙指數(shù)模型中，正常大鼠與肝纖維化F1期大鼠的D*值有顯著差異(P＜0.05)；F1和F2期大鼠的D*和f值有顯著差異(P＜0.05)；F3和F4期大鼠的D值有明顯差異(P＜0.05)(表3)。

2.3.3 DWI、IVIM各參數(shù)值與肝纖維化程度的相關(guān)性

Spearman秩檢驗顯示ADC、D、f及D*值與肝纖維化嚴重程度呈負相關(guān)(r=-0.657，-0.668，-0.711，-0.851，P=0.01)(表4)。

2.3.4 DWI、IVIM各參數(shù)值診斷不同階段肝纖維化的準確性

由DWI、IVIM各參數(shù)評估肝纖維化的感受性曲線得出，D*值對F0和F1～F4期、F0～F1和F2～F4期及F0～F2和F3～F4期的鑒別效能均優(yōu)于ADC、D和f值(表5；圖3A～C)；ADC在F0～F3和F4期的鑒別診斷上，ROC曲線下面積最大，具有較高的診斷效能(表5；圖3D)。

表5 DWI及IVIM各參數(shù)對不同階段肝纖維診斷準確性Tab. 5 Diagnostic accuracy of liver fiber in different stages of DWI and IVIM parameters

3 討論

慢性損傷導(dǎo)致的細胞外基質(zhì)產(chǎn)生及降解的失衡是肝纖維化發(fā)展的主要機制，肝星狀細胞(HSCs)未受到刺激時處于未激活狀態(tài)，肝臟受損后，在炎癥、損傷、壞死等因素作用下肝臟實質(zhì)和非實質(zhì)細胞開始分泌各種細胞因子，同時肝星狀細胞激活為成纖維細胞和成肌纖維細胞，通過不斷增生和分泌細胞外基質(zhì)而打破細胞外基質(zhì)的代謝平衡，使膠原蛋白基質(zhì)異常沉積于肝臟形成肝纖維化[8]。注射CCL4橄欖油混合液建立肝纖維化是經(jīng)典的建模技術(shù)，較其他方法安全、穩(wěn)定、高效，由于慢性肝炎活動與肝纖維化呈正相關(guān)，故利用一系列指標來區(qū)分慢性丙型肝炎活動程度的METAVIR分級可用于評價并量化肝纖維化[9]，幫助確定治療和檢測疾病的發(fā)展，其中F0～F4肝纖維化程度由輕到重。IVIM參數(shù)在不同程度肝纖維化間有差異，相對于ADC值，IVIM參數(shù)可反映組織的擴散和灌注情況，可更全面、準確地反映肝纖維化早期的病理生理改變。

3.1 ADC值及IVIM相關(guān)參數(shù)D值、f值、D*值評價大鼠肝纖維化的診斷價值

本研究實驗組ADC值、D值、f值及D*值均較對照組ADC值明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，與部分研究的結(jié)論一致[10-12]，表明肝纖維化肝臟的水分子擴散和微循環(huán)灌注都受到限制。另外，本研究得出ADC值、D值、f值及D*值與肝纖維化水平呈負相關(guān)(r=-0.657，-0.668，-0.711，-0.851，P=0.001)，與Franca等[11]認為D值在正常肝臟與肝纖維化肝臟之間無顯著差異的結(jié)論不一致，可能與本研究樣本量較小有關(guān)。當(dāng)肝纖維化程度進展，各參數(shù)值逐漸降低，其中ADC值和D值在肝纖維化晚期(F3期和F4期肝纖維化之間[13-14])差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，D*值和f值在肝纖維化早期差異比較明顯，前者在正常肝臟和F1期肝纖維化之間及F1期和F2期肝纖維化之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，后者在F1期和F2期肝纖維化之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。ADC值的減低一方面是因為肝纖維化時隨著肝內(nèi)膠原蛋白不斷積累，限制了水分子的自由擴散，引起ADC值減低；另一方面是由于肝纖維化，肝細胞腫脹、變性，竇腔狹窄變形，肝內(nèi)門脈高壓，門靜脈血流減少，代償性增多的肝動脈血供不足以彌補門靜脈血循環(huán)的減少也導(dǎo)致肝纖維化肝臟ADC值降低[15]。D值代表體素內(nèi)純的水分子布朗運動，導(dǎo)致肝纖維化形成與發(fā)展的各種病因引起肝細胞損傷、壞死及炎癥反應(yīng)，繼而合同大量纖維結(jié)締組織異常沉積于肝內(nèi)，這些病理變化引起水分子擴散運動受限，隨肝纖維化進展，限制作用更明顯，這可能是本研究中ADC值及D值隨著肝纖維化進展逐漸減低的原因，且二者在肝纖維化后期甚至是肝硬化時顯著減低[15]。本研究顯示肝纖維化肝臟D*值低于正常肝臟，提示肝纖維化時肝臟微循環(huán)灌注減少，CT灌注[13]已證實，肝硬化組的平均門靜脈灌注較對照組降低，本研究得出D*值在正常肝臟和F1期肝纖維化之間及F1期和F2期肝纖維化之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，f值的作用各文獻報道結(jié)果有差異[10-16]，可能與掃描方案未標準化相關(guān)，本研究中f值在F1期和F2期肝纖維化之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示血流灌注在肝纖維化早期變化比較顯著，D*和f值可以作為肝纖維化早期診斷和分期的敏感指標，與Zhang等[15]和Sandrasegaran等[16]的結(jié)論相同。且本研究中通過ROC曲線分析顯示D*值在F1期及以上、F2期及以上、F3期及以上肝纖維化具有較高的鑒別診斷效能，ADC在F0～F3期和F4期肝纖維化之間具有最高的鑒別診斷效能。

3.2 本研究的局限性

本研究的局限性：(1)本研究以大鼠肝纖維化模型為研究對象，與人類病理變化過程存在差異，研究結(jié)果尚不能完全反映人體肝纖維化病理變化特點；(2)IVIM雙指數(shù)模型考慮體內(nèi)的純水分子擴散成分和毛細血管內(nèi)的偽擴散成分，忽略了體素內(nèi)其他流動成分對結(jié)果的影響；(3)動物實驗樣本量較小，需要進一步擴大樣本量證實研究結(jié)果的可靠性與可重復(fù)性。

綜上，IVIM雙指數(shù)模型多參數(shù)值可以從水分子擴散和微循環(huán)灌注兩方面診斷及評估肝纖維化水平，比DWI單指數(shù)模型更真實地表現(xiàn)肝纖維化病理變化特點，D*值、ADC值對肝纖維分期具有應(yīng)用價值，D*值在鑒別診斷F0～F3期各期之間肝纖維化的效能最高，ADC值鑒別F0～F3期和F4期肝纖維化的效能最高，IVIM雙指數(shù)模型多參數(shù)值結(jié)合DWI單指數(shù)模型參數(shù)ADC值對肝纖維早、晚期的鑒別診斷和分期更具有價值，但IVIM成像至今沒有一種公認的標準化掃描方案，因此IVIM成像評價肝纖維化程度的價值還有待進一步探索。

利益沖突：無。