SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擬南芥葉片實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改進(jìn)

王琳 劉杰 黃金林 潘志明

摘要：目的：改進(jìn)擬南芥葉片的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離方法。方法：采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離擬南芥葉片。主要比較和分析了兩種樣品溶解液和兩種染色方法對實(shí)驗(yàn)的影響。改進(jìn)的樣品溶解液可防止樣品的損失，節(jié)約樣品和試劑；改進(jìn)的染色方法操作時(shí)間短，靈敏度高，分離條帶多且清晰。結(jié)論：改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法可以得到更為靈敏、清晰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)節(jié)約了實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)時(shí)間，減少了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備人員的工作量，更好地適應(yīng)和促進(jìn)了實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作。

關(guān)鍵詞：實(shí)驗(yàn)教學(xué)；改進(jìn)；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；葉片

中圖分類號：Q503 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2019）30-0266-02

目前，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳已成為蛋白質(zhì)分析過程中所普遍采用的方法[1-3]。它具有結(jié)果直觀、分辨率較高、信息量大，技術(shù)成熟等優(yōu)點(diǎn)，因此，此實(shí)驗(yàn)也成為本科生生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中的基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)，是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重要內(nèi)容。

一、方法

1.擬南芥葉片蛋白提取。用液氮研磨適量擬南芥葉片，加入蛋白提取緩沖液，渦旋震蕩15秒后，4℃，6000g離心30分鐘，收集上清，并用丙酮沉淀，即為葉片蛋白。將蛋白質(zhì)樣品1mg左右，按1.0—1.5 g/L溶液比例，向樣品加入“樣品溶解液”溶解后，在100℃沸水浴中保溫2—3分鐘，取出冷至室溫。

2.電泳。先制備分離膠，再制備濃縮膠，輕輕將“梳子”插入濃縮膠內(nèi)。凝膠聚合后，小心拔去“梳子”。將電極緩沖溶液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短玻璃片。用微量注射器在樣品凹槽內(nèi)加樣，加樣體積為10μl。將上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開電源，開始時(shí)將電流控制在15—20 mA，待樣品進(jìn)入分離膠后，改為30—50mA。待藍(lán)色染料遷移至下端約1—1.5cm時(shí)，停止電泳。將凝膠片取出，滑入一培養(yǎng)皿內(nèi)，加固定液固定后，加入染色液，染色完畢，加入脫色液，直至背景清晰。

3.實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)。（1）樣品溶解液的改進(jìn)。原蛋白質(zhì)樣品溶解液：SDS 100 mg，巰基乙醇0.1 ml，甘油0.7 ml，溴酚藍(lán)2 mg，Tris-HCl緩沖溶液2ml，加蒸餾水至總體積10 ml。改進(jìn)的蛋白質(zhì)樣品溶解液：SDS 100 mg，巰基乙醇0.1 ml，甘油1.0 ml，溴酚藍(lán)2 mg，Tris-HCl緩沖溶液2 ml，加蒸餾水至總體積10 ml。（2）染色方法的改進(jìn)。原染色方法：常規(guī)CBB R-250染色。將凝膠浸泡在固定液中3—4 h，然后在CBB R-250染色液（45%乙醇，10%乙酸，0.1%CBB R-250）中染色過夜，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液（無R-250的染色液）脫色，20min/次，至背景顏色淺淡，蛋白質(zhì)條帶清晰即可。改進(jìn)的染色方法：藍(lán)銀染色。將凝膠浸泡于固定液中固定30min，以雙蒸水洗4次，每次15min，然后在染色液（0.12% CBB G-250，10% 硫酸銨，10% 磷酸和20%甲醇）中染色3—4 h，用蒸餾水漂洗數(shù)次直至背景顏色淺淡，蛋白質(zhì)條帶清晰即可。

二、結(jié)果與分析

1.原樣品溶解液配制方法與改進(jìn)的樣品溶解液配制方法的分離效果比較。由于原來的甘油濃度使樣品沉積效果不好，因此增加了甘油的濃度。這樣樣品會盡可能多地進(jìn)入凝膠。圖1（a）為原溶解液法和原染色方法分離的擬南芥葉片PAGDE圖譜，圖1（b）為改進(jìn)的溶解液法和改進(jìn)的染色方法分離的擬南芥葉片PAGDE圖譜。從圖1中可以看出，原方法分離的蛋白條帶顯現(xiàn)較少，大多數(shù)低峰度蛋白條帶無法顯現(xiàn)（圖1a）。改進(jìn)的方法分離蛋白的條帶較多，背景清晰，圖1（a）中清晰的蛋白條帶在圖1（b）中進(jìn)一步加深，有些圖1（a）中檢測不到的條帶在圖1（b）中檢測到了（圖1b），因此，改進(jìn)的方法靈敏度更高，更節(jié)約時(shí)間，分離效果更好，更適合SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擬南芥葉片的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

三、討論

樣品裂解液既要盡可能充分地溶解蛋白樣品，也要保證溶解的蛋白樣品能盡可能進(jìn)入到電泳體系中。甘油可以協(xié)助沉淀蛋白質(zhì)。改進(jìn)后的樣品溶解液提高了甘油的比例，這樣使得溶解的蛋白樣品能盡可能全部進(jìn)入到電泳體系中，從而間接增加了蛋白樣品的上樣量，節(jié)約了蛋白樣品的用量，而且還同時(shí)可以得到較好的蛋白分離效果。染色方法是影響實(shí)驗(yàn)分離效果的一個(gè)關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，它影響了實(shí)驗(yàn)的顯像結(jié)果。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)用的常規(guī)的染色方法仍是考染。迄今還未見有將經(jīng)典考染和藍(lán)銀染色這兩種方法用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)比較的報(bào)道。通過本實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)銀染色的靈敏度要高于經(jīng)典考染（圖1）。電泳中常規(guī)的染脫色法以考馬斯藍(lán)、乙酸和水作為染色和脫色劑，所需時(shí)間冗長，不便于凝膠成像。改進(jìn)的染色法中甲醇可以更好地把蛋白質(zhì)固定在凝膠中。磷酸既可以維持染液的酸度，又有利于蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)的結(jié)合。硫酸銨使得蛋白染色靈敏度得以提高。因此改進(jìn)的染色方法更有利于獲得條帶數(shù)量多、背景清楚、靈敏度高的凝膠圖像。這些實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)對實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作產(chǎn)生了很大的影響。如：（1）可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法比原實(shí)驗(yàn)方法可以更好地防止樣品的損失，從而節(jié)約了樣品。改進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法比原實(shí)驗(yàn)方法少用3%的甘油，節(jié)約了試劑。這些都更好地節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。（2）可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間。原染色方法染色時(shí)間較長（需過夜），脫色時(shí)間也較長。這不僅浪費(fèi)試劑，而且也造成時(shí)間的浪費(fèi)。改進(jìn)的染色方法染色時(shí)間較短（3—4h），脫色時(shí)間也較短。所用試劑較少（脫色液只用蒸餾水），這既節(jié)約試劑，減少了試劑的污染，而且也節(jié)約了寶貴的時(shí)間，能讓學(xué)生在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)得到理想的結(jié)果。（3）減少了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備人員的工作量。如今實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備人員緊缺，這更大地發(fā)揮了實(shí)驗(yàn)工作人員的價(jià)值。

四、結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)方法彌補(bǔ)了SDS聚丙烯酰胺凝膠分離擬南芥葉片蛋白傳統(tǒng)方法的一些不足，如用改進(jìn)的樣品溶解液代替原溶解液；用改進(jìn)的藍(lán)銀染色方法代替原考馬斯亮藍(lán)染色方法。這些對實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)得到了更為靈敏、清晰的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)節(jié)約了實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)時(shí)間，能讓學(xué)生在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)得到理想的結(jié)果。同時(shí)也減少了試劑污染和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備人員的工作量，更好地適應(yīng)和促進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作，也有利于其他老師從中得到啟發(fā)。

參考文獻(xiàn)：

[1]崔雪瑩，相美容，武皓.薏苡仁蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析[J].山東中醫(yī)雜志，2017，（2）：155-157.

[2]王芳，李曉靜，周延清，等.聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測大豆SRAP標(biāo)記[J].中州大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，（6）：125-128.

[3]張延紅，高素芳，陳紅剛，等.甘草種子蛋白質(zhì)提取及SDS-PAGE電泳技術(shù)研究[J].種子，2016，35（2）：21-24.